Особенности клеточного иммунитета и регенерации при алкогольном фиброзе печени

Размещено на http://www.allbest.ru/

Особенности клеточного иммунитета и регенерации при алкогольном фиброзе печени

Газатова Н.Д.

Юрова К.А.

Вульф М.А.

Тодосенко Н.М.

Литвинова Л.С.

Балтийский федеральный университет (БФУ) им. И. Канта Россия, 236029, г. Калининград, ул. Гайдара, 6

Гаврилов Д.В.

Наркологический диспансер Калининградской области Россия, 236006, г. Калининград, ул. Барнаульская, 6а

Новицкий В.В.

Сибирский государственный медицинский университет (СибГМУ) Россия, 634050, г. Томск, Московский тракт, 2

Резюме

Цель. Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у больных алкогольным фиброзом печени (АФП).

Материалы и методы. В исследование были включены 62 больных АФП; 15 пациентов, злоупотребляющих алкоголем, без фиброза печени и 20 условно здоровых доноров. В образцах лизированной периферической крови методом проточной цитометрии определяли число клеток, несущих поверхностные маркеры.

Результаты. У больных АФП на терминальных стадиях (ст.) фиброза регистрировалась значительная лимфопения с изменением состава основных субпопуляций лимфоцитов относительно значений условно здоровых доноров и группы сравнения. Выявленное нами в крови больных АФП с терминальными (Ш-1У) ст. заболевания снижение (относительно контроля и группы сравнения) относительного числа наивных (ТД и Т-лимфоцитов центральной памяти (ТСМ), ассоциированное с ростом количества эффекторных клеток (ТЕМ и ТЕМКА), позволяет нам предположить у этой категории больных факт прямой дифференцировки лимфоцитов Тм и ТСМ в эффекторные (ТЕМ и ТЕМКА), что может усугублять течение тканедеструктивного процесса за счет высокой биоцидной активности последних. Повышенный уровень гемопоэтических (СБ 34 и СБ 133) клеток в периферической крови на начальных и умеренных (1-11) ст. фиброза (относительно контроля и группы сравнения) может быть обусловлен персисти- рующим воспалением в паренхиме печени и нарастающим дисбалансом между процессами ее повреждения и репаративными возможностями. Тогда как снижение их количества на терминальных ст. фиброза может свидетельствовать о нарастающей декомпенсации и истощении регенераторного потенциала организма на финальных этапах дегенеративного процесса.

Заключение. В целом полученные данные демонстрируют новые аспекты иммунной регуляции процессов фиброгенеза при хроническом алкоголизме.

Ключевые слова: хронический алкоголизм, цирроз печени, алкоголь, субпопуляционный состав лимфоцитов.

Features of cellular immunity and regeneration for alcoholic fibrosis of the liver

Gazatova N.D.1, Yurova K.A.1, Gavrilov D.V.2, Vulf M.A.1,

Novitskiy V.V.3, Todosenko N.M.1, Litvinova L.S.1

1 Immanuel Kant Baltic Federal University (IKFU)

6, Gaidar Str., 236029, Kaliningrad, Russian Federation

2 Drug Dispensary Kaliningrad Region (DDKG)

6a, Barnaulskaya Str, 236006, Kaliningrad, Russian Federation

3 Siberian State Medical University (SSMU)

2, Moscow Trakt, 634050, Tomsk, Russian Federation

ABSTRACT

Purpose. The subpopulation composition of peripheral blood lymphocytes was evaluated in patients with alcoholic liver fibrosis (ALF).

Materials and methods. The study included 62 patients with ALF; 15 patients abusing alcohol without liver fibrosis and 20 conditionally healthy donors. In samples of lysed peripheral blood, the number of cells bearing surface markers was determined by flow cytometry. In patients with ALF at terminal stages of fibrosis, significant lymphopenia was recorded with a change in the composition of the main subpopulations of lymphocytes relative to the values of conditionally healthy donors and the comparison group.

Results. We identified in the blood of ALF patients with terminal (III-IV) stage (relative to control and comparison group) of the relative number of naive (TN) and central memory T-lymphocytes (TCM) associated with an increase in the number of effector cells (TEM and TEMRA) allows us to suggest in this category of patients the direct differentiation of TN and TCM lymphocytes to effector (TEM and TEMRA), which can aggravate the course of the tissue-destructive process due to the high biocidal activity of the latter. Elevated levels of hematopoietic (CD34 and CD133) cells in the peripheral blood at the initial and moderate stages. (I-II) fibrosis (relative to control and comparison group) may be due to persistent inflammation in the liver parenchyma and an increasing imbalance between the processes of its damage and reparative capabilities. Whereas the decrease in their number at the terminal station fibrosis may indicate an increasing decompensation and depletion of the regenerative potential of the organism in the final stages of the degenerative process.

Conclusions. In general, the obtained data demonstrate new aspects of the immune regulation of the processes of fibrogenesis in chronic alcoholism.

Key words: alcoholic liver fibrosis, chronic alcoholism, liver cirrhosis, cellular immunity, alcohol, subpopulation composition of lymphocytes.

Введение

Проблема хронических диффузных заболеваний печени, включая стеатоз, фиброз и цирроз, относится к приоритетам национальных систем здравоохранения индустриально развитых стран мира [1, 2]. Преобладающим этиологическим фактором в патогенезе хронических заболеваний печени является длительное употребление алкоголя [2, 3]. Цикличность процессов повреждения и репарации гепатоцитов при фиброгенезе, индуцированного большинством гепатотоксических факторов, ассоциируют с дизрегуляцией дистантных и локальных механизмов врожденного и адаптивного иммунитета [4]. лимфоцит алкогольный фиброз

Согласно современным представлениям, печень в условиях физиологической нормы рассматривается в качестве иммунного органа, обогащенного клетками врожденного (клетки Купфера, у 5 Т-лимфоциты, натуральные киллеры (NK, natural killer), Т-клетки натуральные киллеры (NKT, включая инвариантные iNKT- клетки) и др.) и адаптивного (популяции CD4 +и CD8 + Т-клеток, В-лимфоциты) иммунитета. Характеризуется сложной и активной цитоки- новой средой, включающей экспрессию основных провоспалительных (интерлейкина (IL) 2, IL-7, IL-12, IL-15, интерферона (IFN) у и др.) и противовоспалительных (IL-10, IL-13 и трансформирующего фактора роста (TGF) в) медиаторов резидентными клетками [4]. В то же время для предотвращения чрезмерной активации печень поддерживает статус иммунной толерантности [4].

Хроническое злоупотребление алкоголем модулирует морфофункциональное состояние всех популяций иммунных клеток [4]. В частности, этанол опосредует гиперактивацию клеток врожденного иммунитета как в периферической крови, так и в тканях печени за счет бактериальных токсинов, проникающих в избыточных количествах в системную циркуляцию, вследствие повышенной проницаемости кишечной стенки и сниженной функции печени [3]. Высокий уровень продукции этими клетками активных форм кислорода и целого спектра молекул с провоспалительным действием стимулирует трансформацию резидентных звездчатых клеток печени (ЗКП, клетки Ито) в миофибробласты, продуцирующие компоненты внеклеточного матрикса с последующим их накоплением в пространстве Диссе, а также способствует миграции иммунных клеток из кровотока в очаг повреждения, приводя к усилению инфильтративного компонента воспаления, усугубляя, тем самым, повреждение паренхимы печени [5]. В то же время длительный прием алкоголя способствует развитию лимфопении, с увеличением числа активированных Т-клеток в циркуляции, опосредованной их гомеостатической пролиферацией [5, 6].

Учитывая тот факт, что механизмы этанолиндуцированного фиброгенеза до конца не расшифрованы, интерес к оценке состояния клеточного звена врожденного и адаптивного иммунитета у больных алкогольной болезнью печени (АБП) продиктован участием иммунных клеток в регуляции воспалительных и регенеративных реакций, возникающих в ответ на повреждение гепатоцитов, и, в конечном итоге, их ролью в модуляции печеночного фиброгенеза. В настоящей работе была проведена оценка параметров клеточного иммунитета и регенерации у пациентов с алкогольным фиброзом печени, ранжированных по стадиям (ст.) процесса.

Материалы и методы

Материалом для исследования служила периферическая кровь, взятая из локтевой вены утром натощак с помощью стандартных вакуумных систем BD VACUTAINER™ (Greiner-bio-one, Австрия) с гепарином (20 Ед/мл) у 62 больных алкогольным фиброзом печени (АФП, МКБ 10 - K70.2; 32 женщины и 30 мужчин в возрасте (46,4 ± 5,6) лет), 15 пациентов, злоупотребляющих алкоголем без нарушенной функции печени (8 женщин и 7 мужчин в возрасте (42,1 ± 4,2) лет) и 20 условно здоровых доноров (10 женщин и 10 мужчин в возрасте (38,3 ± 6,4) лет). Пациенты с АФП МЕТАУШ, I ст. - 17 человек, II ст. - 16 человек, были ранжированы на четыре группы в зависи- III ст. - 17 человек, IV (цирроз) ст. - 12 человек) мости от ст. фибротического процесса (по шкале (табл. 1).

Т а б л и ц а 1

Пациенты с АФП и без нарушений структуры и функций печени, вошедшие в исследование, имели в анамнезе хроническое злопотребление алкоголем и характеризовались как сильно пьющие (4 200-5 600 г 100%-го этанола в месяц), со стажем употребления алкоголя не менее 3 и не более 10 лет. Для исключения прямого действия этанола на исследуемые параметры взятие крови производили на 7-е сут после детоксикационной терапии в условиях стационара.

Верификация диагноза и набор пациентов в группы исследования осуществлялись заведующим наркологическим отделением, врачом психиатром-наркологом Д.В. Гавриловым на базе ГБУЗ "Наркологический диспансер Калининградской области" (гл. врач - Ю.Н. Скалин), а также заведующим диагностическим отделением, врачом ультразвуковой диагностики высшей квалификационной категории Н.Б. Котовым на базе клинико-диагностического центра ФГАОУ ВО "Балтийский федеральный университет им. И. Канта" (гл. врач - О.В. Иванова). Диагностические исследования включали опрос пациентов, полигепатографию, ультразвуковое исследование органов брюшной полости, фиброэластометрию печеночной паренхимы, биохимический анализ крови.

Подготовка проб для проведения иммунофенотипического анализа в образцах цельной венозной крови была осуществлена по методике "Окрашивание - лизис". Образцы цельной венозной крови в объеме 10 мкл были инкубированы при +4 С° 30 мин с 10 мкл различных коктейлей моноклональных антител, приготовленных ex temporo, в иммунологических планшетах. Далее для лизирования эритроцитов в образцах использовали реагент Guava 1X Lysing Solution (Merck Millipore, Германия) в соответствии с протоколом производителя.

В образцах лизированной периферической крови число клеток, несущих поверхностные маркеры (CD45, CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD19, CD62L, CD45R0, CD34, CD133), определяли методом проточной лазерной цитометрии с помощью коктейля моноклональных антител, конъюгированных с Viablue (CD45); аллофикоцианином (APC) (CD19, CD62L); флуоресцинизотионатом (FITC) (CD4, CD34, CD16, CD45R0), фикоэритрином (PE) (CD8, CD56, CD133); с конъюгатом РЕ с цианином (PE- Cy7) (CD3), согласно протоколам производителей (Miltenyi Biotec, Германия; Abcam, Cambridge, Великобритания; e-Bioscience, США). Регистрацию результатов проводили на проточном цитофлуориметре MACSQuant (Miltenyi Biotec, Германия).

Коктейли использованных моноклональных антител: CD45-Viablue, CD3-PE.Cy7, CD4-FITC, CD8-PE; CD45-Viablue, CD3-PE.Cy7, CD16-FITC, CD56-PE, CD19-APC, CD45-Viablue, CD3-PE.Cy7, CD45RO-FITC, CD62L-APC; CD45-Viablue, CD34- FITC, CD133-PE. Все результаты цитометрического анализа были проанализированы с помощью программы KALUZA Analysis Software (Beckman Coulter, США).

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы IBM SPSS Statistics 20 (Statistical Package for the Social Sciences). Оценку полученных результатов проводили методами статистического описания и проверки статистических гипотез [7]. При анализе имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения Колмогорова - Смирнова. Для нормально распределенных выборок вычисляли средние выборочные характеристики: среднее арифметическое Х, ошибку среднего т; для выборок, распределение которых отличалось от нормального, рассчитывали медиану, первый и третий квартили Ме (^--23). Для оценки достоверности различий выборок использовали параметрический ^критерий Стъюдента или непараметрический Манна - Уитни для независимых выборок. С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный (путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена г) и регрессионный (с вычислением коэффициента регрессии г 2) анализы. Различия считались достоверными при уровне значимости р < 0,05 [7]. При проведении сравнительного анализа изучаемых показателей клеточного иммунитета и регенерации в группе условно здоровых доноров, у лиц с хроническим злоупотреблением алкоголя с и без фиброза печени в зависимости от гендерных критериев достоверных различий тестируемых параметров не выявлено. Ввиду отсутствия значимых различий между исследуемыми показателями клеточного иммунитета и регенерации у больных АФП с I и II ст. фиброза они были объединены в одну группу.

Результаты и обсуждение

У обследованных нами больных АФП с III ст., злоупотребляющих алкоголем, регистрировалось значимое снижение относительного, а у больных циррозом (IV ст.) печени абсолютного и относительного числа лимфоцитов содержания СБ 45+СБ 3+ и СБ 45+СБ 3+СБ 4+ Т-лимфоцитов в периферической крови в сравнении с контролем и группой хронических алкоголиков без АБП (табл. 2).

Т а б л и ц а 2

Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у больных алкогольным фиброзом (АФП) печени, ранжированных по стадиям

Subpopulation of peripheral blood lymphocytes in patients with alcoholic liver fibrosis (ALF) ranked by stages

Примечание. Здесь и в табл. 3: p0--p3 - уровни значимости по сравнению с группами I--V соответственно. Note. Here and in table 3: p0--p3 - significance levels in comparison with groups I--V, respectively.

У больных АФП с I--II ст., напротив, наблюдалось незначительное увеличение исследуемых параметров (см. табл. 2). Установленная нами общая негативная корреляция (г = -0,783; p = 0,031) между относительным содержанием лимфоцитов и ст. фиброза у больных АФП находит отражение в исследованиях [11]. Более ранние работы L. Lombardo и соавт. свидетельствуют о взаимосвязи между уменьшением числа CD3+CD4+ и тяжестью течения цирроза печени [12].

Несмотря на многочисленные исследования, посвященные роли лимфоцитов в патогенезе АБП, полученные результаты и их интерпретация являются крайне противоречивыми. Так, хроническое злоупотребление алкоголя у человека и в экспериментальных моделях (животные) способствует развитию лимфопении, нарушая баланс между различными субпопуляциями Т-клеток, а также оказывает влияние на их активацию и функциональный статус [10]. Группой авторов обнаружено, что у лиц, злоупотребляющих алкоголем без заболевания печени и у пациентов с алкогольным циррозом [13] значительная лимфопения опосредована равномерным уменьшением числа популяций CD4 и CD8 Т-лимфоцитов в циркуляции. Другие исследования, напротив, демонстрируют рост числа CD3 Т-клеток у хронических алкоголиков без АБП в основном за счет увеличения числа активированных цитотоксических лимфоцитов [14].

Лимфоциты CD3+CD8+ являются уникальной субпопуляцией [15], обладающей способностью модулировать свое окружение через секрецию различных медиаторов и прямую цитотоксичность [16]. Ранее было высказано предположение об участии CD3+CD8+ T-лимфоцитов в повреждении печени. У обследованных нами пациентов с АФП на начальных и умеренных (I--II) ст. фиброза содержание (относительное) CD3+CD8+ лимфоцитов было значительно выше соответствующих показателей здоровых доноров и лиц, не имеющих структурных и функциональных нарушений печени. Тогда как на более продвинутых стадиях заболевания регистрировалось значительное снижение абсолютного и относительного их содержания (см. табл. 2).

В некоторых работах было показано, что у человека и экспериментальных животных хроническое потребление этанола сопровождается увеличением числа и выраженной активацией популяций цитотоксических CD3+CD8+ Т-лим- фоцитов, NK- и NKТ-клеток [8, 14], что предполагает потенциальную роль эффекторных цитотоксических клеток в формировании фиброза печени через механизмы иммуноопосредованного апоптоза гепатоцитов [8].

В то же время, согласно данным литературы, на более продвинутых ст. фиброза у пациентов с циррозом печени и активным потреблением этанола число цитотоксических CD4/CD8 и NKT Т-клеток в циркуляции и их цитолитическая (цитотоксическая) активность in vitro снижаются наряду с повышенной продукцией у этой категории лиц факторов с профиброгенным действием IL-10 и TGFP [8]. Предполагают, что уменьшение числа пула цитотоксических клеток может быть обусловлено их усиленной миграцией в печень, что подтверждается присутствием активированных CD4 и CD8 Т-лимфоцитов в воспалительных печеночных инфильтратах при тяжелом фиброзе или циррозе алкогольной этиологии [2]. Эндотоксины (липополисахариды грамотрицательных бактерий), вырабатываемые кишечником, и продукты взаимодействия метаболитов этанола и клеточных структур, по-видимому, выступают в роли антигенов. В дополнение к вышесказанному, экспериментально было показано, что этанол дозозависимым образом индуцирует на CD4 и CD8 Т-лимфоцитах экспрессию хемоки-новых рецепторов CXCR3 и CXCR4 (C-X-C motif chemokine receptor 3, 4), а также молекул адгезии на эндотелии сосудов, в частности сосудистого эндотелия 1-го типа (vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1) и межклеточной адгезии (intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1), обеспечивая миграцию этих клеток в печень [17, 18]. Снижение числа цитотоксических Т-клеток в циркуляции на терминальных ст. фиброза (цирроза) может быть также опосредовано повышенной гибелью CD8+ Т-клеток, индуцированной этанолом через митохондриальный путь апоптоза [19]. Кроме того, в литературе представлены сведения о фагоцитозе CD8-лимфоцитов активированными ЗКП [20]. Следует отметить, что в условиях физиологической нормы высокое содержание активированных CD8 Т-клеток и CD4/ CD8 Т-лимфоцитов памяти в печени связывают с механизмами утилизации этих клеток вследствие апоптотической гибели, индуцированной активацией антигеном [4].

Согласно полученным результатам, у больных АФП с III и IV ст. значения индекса иммунорегуляции (ИР) значимо превышали аналогичные показатели контроля, группы сравнения и лиц с АФП с меньшей стадией фиброза (см. табл. 2). Впервые лимфопения и увеличение ИР (CD4/CD8) у больных алкогольным циррозом с прогрессирующей печеночной недостаточностью были описаны P. Couzigou и соавт. [21], что было подтверждено и более поздними работами [11, 20].

Интересно отметить противоположную зависимость у больных вирусными гепатитами (отрицательные корреляции между значениями ИР и стадией фиброза печени) [20].

Особый интерес в нашем исследовании представляла оценка числа Т-клеток, несущих маркеры наивных Т-клеток (TN, CD3+CD62L+CD45R0-/ RA+), Т-лимфоцитов центральной (TCM, CD3+C- D62L+CD45R0+) и эффекторной (TEM, CD3+C- D62L-CD45R0+) иммунной памяти, а также терминальнодифференцированных эффекторов, реэкспрессирующих высокомолекулярную изоформу рецептора CD45 - CD45RA (TEMRA, CD3+C- D62L-CD45RCT). Последние отличаются низкой теломеразной активностью, способностью продуцировать провоспалительные молекулы (в частности, фактор некроза опухолей (TNF) а), ростом экспрессии поверхностного маркера CD57, а также высоким внутриклеточным содержанием перфорина и гранзима А [21, 22]. Известно, что гетерогенные по фенотипическим, анатомическим и функциональным характеристикам субпопуляции Т-клеток памяти характеризуются ангиген- независимой персистенцией, самообновлением и способностью к самоподдержанию, обеспечивая быстрый и эффективный ответ при повторном воздействии патогенов инфекционной и неинфекционной природы [23]. Этанол - небольшая молекула, и не может быть использована в качестве антигена для индукции иммунной реакции. Однако, учитывая его дозозависимое супрессорное влияние на иммунитет, а также способность метаболита этанола ацетальдегида образовывать ковалентные химические аддукты с белками, липидами и ДНК [24], ранее была выдвинута гипотеза о влиянии хронического употребления алкоголя на изменение (увеличение) числа Т-клеток с фенотипом лимфоцитов памяти в циркуляции.

Согласно полученным нами данным, у всех больных АФП, ранжированных по стадиям фиброза, регистрировалось достоверное увеличение процентного числа эффекторных Т-клеток памяти ТЕМ, в том числе ТЕМКД, на фоне снижения содержания популяций Тк и ТСМ по сравнению с параметрами условно здоровых доноров и пациентов без АФП (рис.).

Рисунок. Содержание наивных Т-клеток (TN)-A, Т-лимфоцитов центральной памяти (ТСМ)-Б, Т-клеток эффекторной памяти TEM-В и терминально дифференцированных эффекторов (TEMRA)-T в периферической крови больных алкогольным фиброзом печени, ранжированных по стадиям, %, Me (Qj-Q3): 1 - здоровые доноры (n = 20); 2 - больные без АФП (n = 15); 3 - больные I--II ст. (n = 33); 4 - больные III ст. (n = 17); 5 - больные IV ст. (п = 12). Достоверность различий р < 0,05: * относительно здоровых доноров, А - относительно больных без АФП, # - относительно I-- II ст., ? - относительно III ст.

Figure. Content of naive T cells (TN)-A, T-lymphocytes of central memory (TCM)-B, T-cells of effector memory (TEM)-B and terminal differentiated effectors (TEMRA)-G in peripheral blood of patients with alcoholic liver fibrosis, ranked by stages, %, Me (Q1-Q3): 1 - healthy donors, n = 20; 2 - patients without ALF, n = 15; 3 - patients (I-II stages), n = 33; 4 - patients (III stage), n = 17; 5 -patients (IV stage), n = 12. Reliability of differences p < 0,05: * compared with healthy donors, Д - compared with patients without ALF, # - compared with I-II stages, ? - compared with III stage.

Следует отметить, что у категории больных без АФП число эффекторов ТЕМ и ТЕМЕД также превышало показатели контрольной группы, содержание ТСМ лимфоцитов не изменялось (регистрировалась тенденция к снижению), а число наивных Т лимфоцитов было значительно ниже нормы ("15%).

Влияние злоупотребления алкоголем на конверсию фенотипа наивных Т-лимфоцитов описано в литературе. Так, у взрослых мужчин, принимающих около 400 г этанола в день в течение примерно (25,6 ± 11,5) лет, отмечалось сниженное число наивных (СБ 45ИД) клеток в СБ 4/СБ 8 популяциях Т-лимфоцитов, тогда как число примированных (СБ 45И 0) Т-клеток возрастало [5]. Аналогично в эксперименте на мышах (самцах и самках) хроническое потребление 20%-го этанола в питьевой воде в течение 6 мес уменьшало число наивных Т-клеток и увеличивало долю Т-клеток памяти в результате повышенной гомеостатической пролиферации последних, опосредованной лимфопенией [24].

В отличие от специфической антиген-зависимой активации Т-клеток, гомеостатическая пролиферация, опосредованная лимфопенией при хроническом потреблении алкоголя, индуцируется стимуляцией собственными пептидами, приводя к экспансии множественных клонов, что способствует увеличению риска развития аутоиммунных расстройств [23, 25]. В целом повышение содержания Т-клеток памяти связано с развитием хронических воспалительных заболеваний и возрастных патологий, таких как остеопороз, саркопения, болезнь Альцгеймера, аутоиммунные и онкологические заболевания, сердечно-сосудистая патология и др. [26, 27].

Обнаруженное нами снижение относительного числа лимфоцитов Тк и ТСМ в крови больных АФП с терминальными ст. заболевания ассоциировалось с ростом количества эффекторных клеток ТЕМ и ТЕМКД Это позволяет нам предположить у этой категории больных факт прямой дифференцировки наивных Т-клеток и Т-лимфоцитов центральной памяти в эффекторные. Наше предположение подтверждается сильными корреляциями отрицательного характера между содержанием Тк с ТЕМКД (г = -0,863; р = 0,023; г = -0,773; р = 0,044 для больных АфП с III и IV ст. фиброза) и ТЕМ (г = -0,861; р = 0,038 для больных АФП с IV ст. фиброза); ТСМ с ТЕМКД (г = -0,731; р = 0,032 для больных АфП с IV ст. фиброза) и ТЕМ (СБ 3+СБ 62Б-СБ 45К 0+) (г = -0,891; р = 0,036 для больных АФП с IV ст. фиброза). Результаты проведенного нами регрессионного анализа позволили продемонстрировать положительную зависимость содержания TEMRA у больных АФП со ст. фиброза (У = 0,831; p = 0,028) и отрицательную с числом наивных Т-клеток (r2 = -0,761; p = 0,042). У лиц, злоупотребляющих алкоголем, без АБП также были обнаружены негативные ассоциации между числом TN с TEM (r = -0,522; p = 0,015) и Tm с Tem (r = -0,691; p = 0,031). Выявленная нами взаимосвязь между числом TEMRA клеток и содержанием CD8+ Т-лимфоцитов у больных АФП с IV ст. фиброза (г = 0,629; p = 0,041) доказывает участие цитотоксических лимфоцитов в патогенезе АБП.

Таким образом, у лиц с хроническим активным злоупотреблением алкоголя на терминальных стадиях АФП снижение числа наивных Т-лимфоцитов и Т-клеток центральной памяти сопровождается образованием Т-эффекторов (TEM и TEMRA) с высоким биоцидным потенциалом, что может усугублять течение тканедеструктивного процесса за счет экспрессии этими клетками молекул прямой цитотоксичности (гранзимы, перфорины) и продукции каскада медиаторов с провоспалительным действием. В то же время уменьшение пула наивных Т-клеток у данной категории больных может быть ассоциировано с нарушением формирования эффективных иммунных реакций на инфекцию и вакцинацию.

Важная роль в защите организма от многочисленных патогенов и опухолевых клеток принадлежит механизмам врожденного иммунитета, представленного, в том числе, системой интерферонов и натуральными киллерами [28]. В литературе описаны антифибротические эффекты NK-клеток in vivo и in vitro, запуск которых происходит при повреждении печени [20]. С одной стороны, следует отметить протекторную роль NK-клеток в патогенезе фиброза, вирусных гепатитов и опухолевых заболеваний печени, с другой - участие некоторых субпопуляций этих клеток (в частности, iNKT-клетки, несущие инвариантный Т-кле- точный рецептор) в механизмах повреждения и воспалении печени не вызывает сомнения [28].

У пациентов с I--II ст. АФП относительное содержание NK-клеток (CD3-CD16+CD56+) в периферической крови достоверно превышало значения условно здоровых доноров и было сопоставимым с результатами группы сравнения, тогда как у больных АФП с III-IV ст., напротив, регистрировалось снижение относительного числа CD3-CD16+CD56+ лимфоцитов (см. табл. 2).

В литературе существуют весьма разнонаправленные данные по влиянию этанола на NK-клетки. Некоторые авторы в эксперименте обнаружили способность алкоголя ингибировать цитолитиче- скую функцию NK-клеток [29], тогда как другими группами были получены противоположные результаты [8]. Установлен интересный факт: снижение цитолитической активности натуральных киллеров при длительном воздействии этанола без патологии печени регистрируется на фоне повышения общей цитотоксичности, опосредованной другими клетками [8]. В то же время выявлено, что подавление функций NK-клеток печени при хроническом употреблении алкоголя способствует патогенезу АБП [30]. Уменьшение активности NK-клеток и их числа на периферии при АБП, возможно, связаны с избирательным хоумингом этих клеток в очаг воспаления в сочетании с этанолиндуцированным нарушением их продукции в костном мозге [30, 31].

Выявленные нами изменения пула естественных киллеров в циркуляции вполне согласуются с современной концепцией регрессии (разрешения) фиброза печени, основанной на запуске апоптоза актированных ЗКП, реализация которого может быть опосредована различными механизмами [28], где наиболее важным является активация NK-клеток интерферонами а, в и у [32]. Учитывая, что "30-50% лимфоцитов печени - NK-клетки, факт регуляции последними активности ЗКП представляется вполне логичным. Введение этанола в эксперименте значительно увеличивает резистентность ЗКП к апоптозу через угнетение активности NK-клеток и их способности продуцировать IFNy [30]. Показано, что хроническое потребление этанола ингибирует гибель активированных ЗКП, опосредованную NK-клетками, за счет подавления экспрессии активирующих рецепторов на NK-клетках, в частности NKG2D (natural killer group 2D), снижения синтеза апоптоз-индуцирующего лиганда семейства TNF (TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL), гранзимов, пер- форина и IFNy [33]. Кроме того, прием этанола стимулирует продукцию ЗКП TGFP; последний ингибирует функции NK-клеток [30].

Мы предполагаем, что уменьшение числа NK- клеток в периферической крови у хронических алкоголиков может способствовать снижению антифибротических эффектов этих клеток с утратой контроля над процессами фиброгенеза на терминальных ст. заболевания, индуцированного длительным приемом алкоголя. В-клетки в условиях физиологической нормы обеспечивают механизмы адаптивного (гуморального и клеточного) иммунитета за счет представления антигенов Т-клеткам, продукции специфических антител, секреции цитокинов и др. [34].

У обследованных нами лиц, страдающих хроническим алкоголизмом, на начальных и умеренных ст. фиброза печени, содержание (относительное и абсолютное) B-клеток (CD3-CD19+) в периферической крови было сопоставимым с контрольными значениями и группой сравнения; тогда как на III ст. фиброза регистрировалось значимое снижение относительного, а у больных циррозом (IV ст.) относительного и абсолютного количества этих клеток относительно контроля и группы лиц без АБП (см. табл. 2).

Полученные нами результаты в целом не противоречат данным литературы, согласно которым у больных циррозом печени с активным статусом потребления алкоголя, уровень B-лимфоцитов в периферической крови значительно снижается [8, 11]. Аналогичные изменения выявлены также у хронических алкоголиков без патологии печени [35], что не подтвердилось в нашем исследовании. Предполагают, что регистрируемая при хроническом злоупотреблении алкоголя В-лимфо-пения опосредована влиянием этанола на развитие В-клеток в костном мозге на уровне ранних предшественников [35]. Экспериментально доказано, что воздействие in vitro этанола на поздней стадии дифференцировки олигоклональных неонатальных клеток-предшественниц приводит к нарушению дифференцировки В-клеток за счет этанол-индуцированного угнетения экспрессии транскрипционных факторов - раннего фактора В-клеток (early B-cell factor, EBF) и критичного фактора коммутирования В-линии (paired box, Pax 5) [35].

Исследования с использованием животных (мыши) также продемонстрировали важную роль В-лимфоцитов в развитии фиброза печени. Ученые установили, что участие В-клеток в прогрессии дегенеративных изменений в печени, индуцированных токсическими факторами, не зависит от Т-клеток и антителогенеза (антительных реакций), а определяются их функциями в месте локализации (секреция цитокинов, межклеточные взаимодействия и т.д.) [35]. Императивная роль В-клеток выявлена также в патогенезе аутоиммунного диабета у мышей NOD (non-obese diabetic) [36] и волчаночного нефрита в полиген- ных, fas-интактных и fas-дефицитных моделях системного аутоиммунитета у генетически модифицированных MRL (Murphy Roth Large) мышей [37]. В обоих случаях антителонезависимый механизм вовлечения B-клеток в патогенез этих заболеваний оказался превалирующим [38].

В литературе также встречаются отдельные работы, свидетельствующие, что в контексте общей лимфопении при хроническом алкоголизме повышается относительное содержание В-клеток, продуцирующих неспецифические иммуноглобулины (Ig) M и A на фоне снижения секреции IgG, что предполагает потенциальную роль этих изменений в формировании аутоиммунных и иммуно-дефицитных состояний при АБП [8, 11]. Таким образом, снижение числа В-клеток в периферической крови мы констатировали только на терминальных ст. фиброза. У пациентов, злоупотребляющих алкоголем, на начальных ст. заболевания и без АБП изучаемые параметры были сопоставимы с контрольными, что может свидетельствовать об относительной резистентности B-клеток к действию алкоголя и запуске компенсаторных механизмов, обеспечивающих гуморальные реакции на ауто- или эндотоксины, образующиеся вследствие токсического действия метаболитов этанола и повышенной проницаемости кишечной стенки.

Выход из костного мозга в кровь полипотентных и унипотентных стволовых клеток (мобилизация стволовых клеток), обладающих высокой пролиферативной активностью и регенерационным потенциалом, и их миграция в поврежденные участки являются адаптивной реакцией организма, развивающейся в ответ на повреждение органов и тканей. Претенденты на стволовые гемопоэтические клетки (CD34,

СШ 33) как в составе первичной суспензии клеток фетальной печени, так и в изолированном виде обладают высокой колониеобразующей активностью и ярко выраженной способностью к мультинаправленной дифференцировке [39]. Определена способность циркулирующих стволовых клеток с фенотипом С 034+С 045- дифференцироваться в эпителиальные клетки кожи и клетки желудочно-кишечного тракта и гепатоциты [40]. Широко обсуждается вопрос о способе дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток в гепатоциты, в частности за счет механизмов слияния и трансдифференцировки [39]. Согласно полученным нами результатам, содержание клеток С 045+С 034+/СШ 33+ в образцах периферической крови пациентов с АФП на начальных и умеренных ст. фиброза значимо превышало контрольные цифры в среднем в 2,5 раза, а также показатели группы сравнения (" в 1,4 раза). У больных хроническим алкоголизмом с АФП на терминальных ст. фиброза число СЭ 34 и СШ 33 позитивных клеток в образцах периферической крови значимо снижалось относительно результатов контроля и группы сравнения (табл. 3).

Т а б л и ц а 3

Содержание гемопоэтических клеток (CD45+ CD34+ / CD133+) в периферической крови больных алкогольным фиброзом печени, ранжированных по стадиям, Me (Q--Q)

The content of hemopoietic cells (CD45+ CD34+ / CD133+) in the peripheral blood of patients with alcoholic liver fibrosis ranked by stages, Me (Q--Q})

Полученные нами результаты у больных АФП на начальных и умеренных ст. фиброза частично согласуются с данными мировой литературы. Установлено, что при хронических заболеваниях печени, ассоциированных со снижением регенеративной способности гепатоцитов, регистрируются мобилизация стволовых гемопоэтических клеток из костного мозга и повышение их уровня в циркуляции и печени, опосредованные активацией миграционной оси, образованной хемокином, фактором стромальных клеток 1 (stromal cell-derived factor, SDF-1) и его рецептором CXCR4 [40, 41].

Как уже упоминалось ранее, воспаление является критическим фактором в инициации и поддержании процессов фиброгенеза печени и цирроза в результате действия различных гепатотоксических факторов.

Реакции воспаления с высвобождением медиаторов с провоспалительным действием (таких как IL-1a, IL-6 и TNFa) из поврежденных клеток способствуют рекрутингу реактогенных циркулирующих клеток крови в печень [41].

Логично предположить, что повышенные уровни клеток CD34 и CD133 в периферической крови пациентов, злоупотребляющих алкоголем, на начальных ст. фиброза связаны с персистирующим воспалением в паренхиме печени и дисбалансом между процессами ее повреждения, а также эндогенными репаративными возможностями. Следует отметить, что CD34 является маркером эндотелиальных клеток при хронических дегенеративных заболеваниях печени, характеризующихся капилляризацией синусоидов. Выраженность экспрессии CD34 имеет четкую ассоциацию с тяжестью поражения печеночной паренхимы. В то же время установлено, что часть клеток CD34, обнаруживаемых в печени, являются гемопоэтическими и принимают участие в ее регенерации [42].

В настоящее время инфузия клеток СЭ 34 и СШ 33 в воротную вену и чревный ствол [42, 43], печеночную артерию пациентам с терминальной стадией цирроза печени может улучшить их клиническое состояние. Аналогичные исследования также показали, что стволовые гемопоэтические клетки, с одной стороны, способствуют регенерации и восстановлению функции печени в результате травмы [44].

С другой стороны, снижение количества клеток СЭ 34 и СШ 33 в циркуляции на терминальных стадиях фиброза у обследованных нами пациентов, злоупотребляющих алкоголем, может свидетельствовать о нарастающей декомпенсации и истощении регенераторного потенциала организма на финальных стадиях дегенеративного процесса. Оценка содержания СЭ 34- и СШ 33-позитивных клеток в периферической крови может быть использована как важный прогностический критерий, свидетельствующий о регенеративной активности организма в ответ на повреждение печеночной паренхимы.

В целом выяснение роли нарушений межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток и гепатоцитов, индуцированных гепатотоксическими факторами, значительно расширит представления о фундаментальных механизмах, опосредующих патологическое ремоделирование печени.

Заключение

Литература / references

1. World Health Organization. World Health Report 2011: Global status report on alcohol and health. Switzerland, 2011: 286.

2. Celli R., Zhang X. Pathology of аlcoholic liver disease. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 2014; 2(2): 103-109. DOI: 10.14218/JCTH.2014.00010.

3. Miller A.M., Horiguchi N., Jeong W.I., Radaeva S., Gao B. Molecular mechanisms of alcoholic liver disease: innate immunity and cytokines. Alcohol. Clin. Exp. Res. 2011; 35 (5): 787-793._DOI: 10.1111/j.1530-0277.2010.01399.x.

4. Robinson M.W., Harmon C., O'Farrelly C. Liver immunology and its role in inflammation and homeostasis. Cellular and Molecular Immunology. 2016; 13 (3): 267-276. DOI: 10.1038/cmi.2016.3.

5. Barr T., Helms C., Grant K. Messaoudi I. Opposing effects of alcohol on the immune system. Prog. Neuropsy- chopharmacol. Biol. Psychiatry. 2016; 65: 242-251. DOI: org/10.1016/j.pnpbp.2015.09.001.

6. Curtis B.J., Zahs A., Kovacs E.J. Epigenetic targets for reversing immune defects caused by alcohol exposure. Alcohol. Res. 2013; 35 (1): 97-113.

7. Кремер Н.Ш. Высшая математика для экономистов. М.: Юнити, 2004: 472. [Kremer N. Sh. Higher mathematics for economists. Moscow: Unity, 2004: 472 (in Russ.)].

8. Laso F.J., Almeida J., Torres E., Vaquero J.M., Marcos M., Orfao A. Chronic alcohol consumption is associated with an increased cytotoxic profile of circulating lymphocytes that may be related with the development of liver injury. Alcohol Clin. Exp. Res. 2010; 34 (5): 876-885. DOI: org/10.1111/j.1530-0277.2010.01160.x.

9. Газатова Н.Д., Юрова К.А., Гаврилов Д.В., Литвинова Л.С. Алкоголь и иммунитет. Гены и Клетки. 2018; 13 (1): 47-55. [Gazatova N.D., Yurova K.A., Gavrilov D.V., Litvinova L.S. Alcohol and immunity. Genes and Cells. 2018; 13 (1): 47-55 (in Russ.)].

10. Pasala S., Barr T., Messaoudi I. Impact of аlcohol аbuse on the аdaptive immune system. Alcohol. Res. 2015; 37 (2): 185-197.

11. Matos L.C., Batista P., Monteiro N., Ribeiro J., Cipriano M.A., Henriques P., Fernando G. Carvalho A. Lymphocyte subsets in alcoholic liver disease. World Journal of Hepatology. 2013; 5 (2): 46-55. DOI: 10.4254/wjh.v5.i2.46.

12. Lombardo L., Capaldi A., Poccardi G., Vineis P. Peripheral blood CD3 and CD4 T-lymphocyte reduction correlates with severity of liver cirrhosis. Int. J. Clin. Lab. Res. 1995; 25: 153-156.

13. Naude C.E., Bouic P., Senekal M., Kidd M., Ferrett H.L., Fein G., Carey P.D. Lymphocyte measures in treat- ment-naHve 13-15-year old adolescents with alcohol use disorders. Alcohol. 2011; 45: 507-514. DOI: 10.1016/j. alcohol.2011.02.307.

14. Arosa F.A., Porto G., Cabeda J.M., Lacerda R., Re- sende D., Cruz E., Cardoso C., Fonseca M., Simses C., Rodrigues P. Expansions of CD8+CD28- and CD8+T- cRVbeta5.2+ T cells in peripheral blood of heavy alcohol drinkers. Alcohol. Clin. Exp. Res. 2000; 24: 519-527. DOI: 10.1111/j.1530-0277.2000.tb02020.x.

15. Zaldivar Fujigaki J.L., Arroyo Valerio A.G., Lуpez Al- varenga J.C., Gutierrez Reyes E.G., Kershenobich D., Hernandez Ruiz J. Alterations in аctivation, oytotoxic oapacity and trafficking profile of peripheral CD8 T-cells in young adult binge drinkers. PLoS One. 2015; 10 (7): e0132521. DOI: 10.1371/journal.pone.0132521.

16. Kaech S.M., Cui W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T-cell differentiation. Nat. Rev. Im- munol. 2012; 12 (11): 749-761.

17. Safadi R., Ohta M., Alvarez C.E., Fiel M.I., Bansal M., Mehal W.Z., Friedman S.L. Immune stimulation of hepatic fibrogenesis by CD8 cells and attenuation by transgenic interleukin - 10 from hepatocytes. Gastroenterology. 2004; 127 (3): 870-882. DOI: 10.1038/nri3307.

18. Karim S., Liaskou E., Hadley S., Youster J., Faint J., Adams D.H., Lalor P.F. An in vitro model of human acute ethanol exposure that incorporates CXCR3 - and CXCR4-dependent recruitment of immune cells. Toxicol. Sci. 2013; 132 (1): 131-141. DOI: 10.1093/t oxsci/ kfs337.

19. Szuster-Ciesielska A., Daniluk J., Bojarska-Junak A. Apoptosis of blood mononuclear cells in alcoholic liver cirrhosis. The influence of in vitro ethanol treatment and zinc supplementation. Toxicology. 2005; 212 (2-3): 124-134. DOI: 10.1016/j.tox.2005.04.009.

20. Muhanna N., Doron S., Wald O., Horani A., Eid A., Pap- po O., Friedman S.L., Safadi R. Activation of hepatic stellate cells after phagocytosis of lymphocytes: a novel pathway of fibrogenesis. Hepatology (Baltimore, Md). 2008; 48 (3): 963-977. DOI: 10.1002/hep.22413.

21. Couzigou P., Vincendeau P., Fleury B., Richard-Molard B., Pierron A., Bergeron J.L., Bezian J.H., Amouretti M., Bnraud C. Changes in circulating lymphocyte subsets in alcoholic hepatopathies. Respective role of alcohol, hepatocellular insufficiency and malnutrition. Gastroenterol. Clin. Biol. 1984; 8 (12): 915-919.

22. Matsuki F., Saegusa J., Miyamoto Y., Misaki K., Kum- agai S., Morinobu A. CD45RA-Foxp3(high) activated/ effector regulatory T cells in the CCR7+ CD45RA-CD27+ CD28+central memory subset are decreased in peripheral blood from patients with rheumatoid arthritis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2013; 438 (4): 778-783. DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.05.120.

23. Bhargava P. Novel therapies for memory cells in autoimmune diseases. Clin. Exp. Immunol. 2015; 180 (3): 353-360. DOI: 10.1111/cei.12602.

24. Zhang H., Meadows G.G. Chronic alcohol consumption in mice increases the proportion of peripheral memory T-cells by homeostatic proliferation. Journal of Leukocyte Biology. 2005; 78 (5): 1070-1080.

25. Min B., Foucras G., Meier-Schellersheim M., Paul, W.E. Spontaneous proliferation, a response of naive CD4 T cells determined by the diversity of the memory cell repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101 (11): 3874-3879.

26. Chou J.P., Effros R.B. T-cell replicative senescence in human aging. Curr. Pharm. Des. 2013; 19 (9): 1680-1698.

27. Appay V., Sauce D.. Naive T-cells: the crux of cellular immune aging? Exp. Gerontol. 2014; 54: 90-93. DOI: 10.1016/j.exger.2014.01.003.