Запрограммированная клеточная гибель лимфоцитов и нейтрофилов при алкоголизме

Теоретические исследования

Размещено на http://www.allbest.ru/

40

Запрограммированная клеточная гибель лимфоцитов и нейтрофилов при алкоголизме

С.А. Иванова, Н.А. Бохан

Томск, ГУ НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН

Апоптоз играет важную роль в реализации механизмов адаптации организма к воздействию стрессогенных факторов, в том числе хронической интоксикации. Программируемая клеточная смерть и ее морфологическое проявление - апоптоз - является механизмом выбраковки поврежденных клеток, поддерживающим нормальный клеточный гомеостаз во взрослом организме.

В последние годы в литературе появились данные, что этанол может индуцировать апоптоз (Olney J. W., 2001; Jung M. E. et al., 2005). Этанол может повреждать фактически любой орган и ткань в связи со способностью изменять целостность мембраны и ключевые биохимические процессы клеток. Этанол усиливает апоптотическую нейродегенерацию в мозге эмбрионов крыс и в гепатоцитах взрослых особей (Ikonomidou C. et al., 2000; Slomiany B. L. et al., 1994). Изолированные моноциты здорового человека после приема алкоголя проявляют признаки апоптотической смерти, также как и нейроны больных алкоголизмом (Freund J., 1994; Singhal P. C. et al., 1999). Апоптоз, ассоциированный с алкогольной цитотоксичностью, связан с увеличением внутриклеточного уровня прооксидантов, особенно в митохондриях (Adachi M. et al., 2002; Spyridopolous I. et. al., 2001). Ингибирование внутриклеточных антиоксидантов увеличивает этанолиндуцированный апоптоз, что позволяет установить корреляцию между окислительным стрессом и апоптозом. При алкоголизме выявляется дисбаланс про- и антиапоптических регуляторов, в частности, алкоголь вызывает увеличение содержания проапоптотических факторов - TNF-alfa, Fas-лигандов (Rodriguez D. A. et al., 2004; Hu J. H. et al., 2003; Nakahara T. et al., 2003).

Цель - изучение процессов апоптоза в лимфоцитах и нейтрофилах больных алкоголизмом при купировании абстинентного синдрома (АС).

Обследовано 30 мужчин в возрасте 31--57 лет, больных алкоголизмом (средняя продолжительность 15 лет) и 20 здоровых мужчин, соответствующих по возрасту. Обследование проводилось в динамике: при поступлении на фоне выраженного АС (первая точка) и после двух недель лечения (вторая точка). Обследование здоровых мужчин проводилось однократно. Лимфоциты обследуемых изолировались из свежей гепаринизированной венозной крови фиколл-гипаковым методом. Содержание клеток, экспрессирующих Fas-рецептор как маркер апоптоза, был исследован методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител к CD95 антигену.

Морфологические изменения нейтрофилов и лимфоцитов, характерные для апоптоза, оценивали методом световой микроскопии в мазках крови. Для оценки спонтанного апоптоза делали тонкие мазки из цельной крови на предметные стекла. Мазки фиксировали 5 минут в метаноле или 40 минут в этаноле и окрашивали по Романовскому. Подсчитывали количество клеток с признаками апоптоза в процентах от доли нейтрофилов или лимфоцитов в общей лейкоцитарной формуле. Индуцированный апоптоз исследовали под воздействием различных факторов и этанола при инкубации клеток in vitro. Концентрацию кортизола в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа с использованием наборов «Алкор-Био». Статистический анализ и обработку данных проводили с использованием пакета STATISTICA, версия 6. 0 для Windows.

Таблица 1Показатели апоптоза в лимфоцитах у больных алкоголизмом и здоровых доноров

Примечание. * - достоверные различия с группой контроля, ** - достоверные различия с первой точкой

адаптация апоптоз алкоголизм

Относительное содержание в кровотоке лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы готовности к Fas-зависимому апоптозу (CD95) у больных алкоголизмом, в первой и второй точках (16,32±1,39 и 15,43±5,12 %) превышает аналогичный показатель у здоровых (12,00±0,77 %, p<0,05). Абсолютное содержание CD95 лимфоцитов у больных алкоголизмом до и после терапии (555,44±106,38 и 373,35±82,43х10⁶кл/л) значительно выше по сравнению с контролем (123,48±20,43х10⁶ кл/л, p<0,05).

Наряду с оценкой готовности к апоптозу проведен подсчет клеток с морфологическими признаками апоптоза (фрагментация ядра и вакуолизация цитоплазмы) методом световой микроскопии. Процентное и абсолютное содержание лимфоцитов с морфологическими признаками фрагментации ядра у больных алкоголизмом двукратно превышают показатели в контроле. Процентное содержание апоптотических лимфоцитов у больных алкоголизмом 2,68±0,46 % - до лечения и 2,15±1,93 % - после лечения (0,97±0,35 % в группе контроля, p<0,05). Абсолютное содержание апоптотических лимфоцитов у пациентов с синдромом отмены составило 53,78±10,07* 106 и 63,37±16,14* 106 клеток после его купирования (9,98±0,65 % у здоровых мужчин, p<0,05).

Рассчитан индекс реализации апоптоза, т. е. доля клеток с морфологическими признаками апоптоза в процентах от общего числа клеток, экспрессирующих рецепторы готовности к апоптозу. Обнаружено, что индекс реализации апоптоза у больных алкоголизмом уменьшается после выхода из АС и составляет 13,44 % (21,03 % до лечения).

Таблица 2Действие гипертермии, преднизолона и этанола на апоптоз нейтрофилов и лимфоцитов in vitro

Примечание. * - р<0,05, ** - p<0,001 по сравнению со здоровыми лицами; ^# - p<0,05 по сравнению с инкубацией в тех же условиях при 20^оС

Уровень спонтанного апоптоза нейтрофилов в мазках, приготовленных сразу после взятия крови, у больных алкоголизмом до лечения достоверно отличался от значений у здоровых (0,69±0,26 и 0,25±0,12 %, p<0,05). Инкубация крови 4 часа при комнатной температуре вызывала увеличение в 2 раза количества клеток, подвергшихся апоптозу, у больных алкоголизмом и более чем в 3 раза у здоровых.

Длительное нагревание приводило к резкому снижению жизнестойкости нейтрофилов. Доля нейтрофилов с признаками апоптоза у здоровых значительно выше, чем у больных алкоголизмом (23,20±5,01 % и 4,63±1 %, p<0,05). При высокотемпературном культивировании образцов крови с добавлением преднизолона доля клеток с гранулированным хроматином ядра уменьшалась до 18,23±6,21 % у здоровых и 2,51±1,57 % у больных алкоголизмом; различия внутри каждой группы не были статистически значимы. Возможно, индукция синтеза белков теплового шока вызывает сбой внутриклеточных механизмов за счет образования дисульфидных связей в глюкокортикоидных рецепторах и сдерживает антиапоптотическое действие глюкокортикоидов на нейтрофилы.

Доля лимфоцитов с фрагментированным ядром у больных алкоголизмом после инкубации крови при различных условиях была в два раза ниже по сравнению с контролем. У здоровых доноров в отношении количества измененных лимфоцитов выявлены те же закономерности, что и для нейтрофилов: инкубация крови даже при комнатной температуре вызывала апоптоз лимфоцитов, максимальный эффект наблюдался от гипертермического воздействия.

Интересная закономерность получена при инкубации крови больных алкоголизмом и здоровых доноров с этанолом в течение 4 часов. Число нейтрофилов, подвергшихся апоптозу под действием этанола в крови больных алкоголизмом, в 2 раза превышало аналогичные показатели в контроле. Как известно, нейтрофилы по способности нарабатывать активированные кислородные метаболиты превосходят другие клетки организма. Этанол, являясь индуктором свободнорадикального окисления, воздействует на нейтрофилы, чувствительные к его влиянию, индуцирует митохондриальный путь запуска апоптоза. В то же время инкубация с этанолом не вызывает значимого увеличения запрограммированной клеточной гибели в популяции лимфоцитов. Из чего можно сделать вывод, что лимфоциты менее восприимчивы к апоптозу, опосредуемому через окислительный стресс.

В группе обследованных больных на фоне АС выявлено увеличение концентрации кортизола в сыворотке крови до 666,17±30,88 нмоль/л. При анализе распределения обследованных в зависимости от концентрации кортизола индивидуальные значения колебались от 370 до 847 нмоль/л. Большая часть больных имели значения от 520 до 700 нмоль/л, в то время как в группе психически и соматически здоровых средние значения составили 323,03+21,45 нмоль/л, индивидуальный разброс показателя колебался от 150 до 450 нмоль/л.

При проведении корреляционного анализа между показателями апоптоза и кортизолом выявлена положительная корреляция «кортизол - СD95», показывающая роль кортикостероидов в регуляции экспрессии маркера апоптоза на иммунокомпетентных клетках.

Возможно, состояние хронической алкогольной интоксикации, для которого характерен сдвиг гормонального баланса и длительное повышение уровня глюкокортикоидов, а также состояние хронической интоксикации вызывают у больных алкоголизмом уменьшение чувствительности к любым стимулам. Глюкокортикоиды выступают как факторы, реализующие стрессовую реакцию и как элемент антиоксидантной системы, повышающий защиту по типу отрицательной обратной связи. Усиление спонтанного апоптоза лимфоцитов и нейтрофилов у больных алкоголизмом может быть связано с усилением процессов перекисного окисления липидов и увеличением содержания в крови его активных продуктов, вызывающих нарушение целостности мембран и развитие признаков апоптоза. Можно предположить, что алкоголь повышает готовность лимфоцитов к апоптозу, но в процессе лечения активируются механизмы, контролирующие и ограничивающие процессы программируемой клеточной смерти, в результате индекс реализации апоптоза значительно уменьшается.

Литература

1. Adachi M., Ishii H. Role of mitochondria in alcoholic liver injury // Free Radic. Biol. Med. - 2002. - V. 32. - P. 487--491.

2. Freund G. Apoptosis and gene expression: perspectives on alcohol-induced brain damage // Alcohol. - 1994. - № 11. - P. 385--387.

3. Enhancement of germ cell apoptosis induced by ethanol in transgenic mice overexpressing Fas Ligand / J. H. Hu, J. Jiang, Y. H. Ma et al. // Cell. Res. - 2003. - V. 13. - P. 361--367.

4. Ikonomidou C., Bittigau P., Ishimaru M. J. Ethanol-induced neurogeneration and fetal alcohol syndrome // Science. - 2000. - V. 287. - P. 1056--1060.

5. Jung M. E. Gatch M. B., Simpkins J. W. Estrogen neuroprotection against the neurotoxic effects of ethanol withdrawal: potential mechanisms // Exp. Biol. Med. - 2005. - V. 230, № 1. - P. 8--22.

6. Nakahara T., Hashimoto K., Hirano M. Acute and chronic effects of alcohol exposure on skeletal muscle c-myc, p53, and Bcl-2 mRNA expression // Amer. J. Physiol Endocrinol Metab. - 2003. - V. 285. - P. 1273--1281.

7. Glutamate signaling and the fetal alcohol syndrome / J. W. Olney, D. F. Wozniak, V. Jevtovic-Todorovic et al. // Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. - 2001. - № 7. - P. 267--275.

8. Ethanol increases tumor necrosis factor-alpha receptor-1 (TNF-R1) levels in hepatic, intestinal, and cardiac cells / D. A. Rodriguez, C. Moncada, M. T. Nunez et al. // Alcohol. - 2004. - V. 33. - P. 9--15.

9. Slomiani B. L., Piotrovski J., Slomiani A. Supression of caspase-3 and nitric-oxide synthase-2 during buccal mucosal ulcer healing: effect of chronic alcohol ingection // IUBMB Life. - 1999. - V. 48. - P. 121--125.

10. Ethanol-induced macrophage apoptosis: the role of TGF-beta / P. C. Singhal, K. Reddy, G. Ding et al. // J. Immunol. - 1999. - № 162. - P. 3031--3036.

11. Alcohol inhances oxysterol-induced apoptosis in human endothelial cells by a calcium dependent mechanism / I. Spyridopolous, J. Wichhusen, B. Rabenshtein et al. // Arterioscler. Thromb. Vask. Biol. - 2001. - V. 21. - P. 439--444.

Размещено на Allbest.ru