Соотношение морфометрических показателей синаптических структур и характеристик синаптосомальных бензодиазепиновых рецепторов развивающегося мозга человека под влиянием материнского алкоголизма

Размещено на http://www.allbest.ru/

Соотношение морфометрических показателей синаптических структур и характеристик синаптосомальных бензодиазепиновых рецепторов развивающегося мозга человека под влиянием материнского алкоголизма

Шушпанова Т. В., Солонский А. В.

НИИ психического здоровья СО РАМН

634014, Томск, ул. Алеутская, 4

Число синаптических контактов по мере развития эмбрионального мозга возрастает, а свойства бензодиазепиновых рецепторов синаптосомальных мембран изменяются, что проявляется снижением аффинности рецепторов и увеличением их плотности. В клетках головного мозга эмбрионов, полученных от женщин, страдающих алкоголизмом, замедляется формирование синаптических структур по сравнению с нормой и трансформируются свойства синаптосомальных бензодиазепиновых рецепторов, что может быть причиной изменения нейромедиаторной трансмиссии. мозг ультраструктура алкоголизм бензодиазепиновый рецептор

Ключевые слова: мозг, ультраструктура, алкоголизм, бензодиазепиновые рецепторы, лиганд.

Correlation of morphometric indices of synaptic structures and characteristics of synaptosomal benzodiazepine receptors of developing human brain under influence of maternal alcoholism

Shushpanova T. V., Solonsky A. V. Mental Health Research Institute SB RAMSci. 634014, Tomsk, Aleutskaya Street, 4.Number of synaptic contacts along with development of fetal brain increases and properties of benzodiazepine receptors of synaptosomal membranes change manifesting in decrease of affinity of receptors and increase of their density. In cells of embryos' brains obtained from women with alcoholism, formation of synaptic structures slows down as compared with norm and properties of synaptosomal benzodiazepine receptors are transformed what may be cause of change of neuromediatory transmission.

Key words: brain, ultra-structure, alcoholism, benzodiazepine receptors, ligand.

Употреблениеалкоголявпериодбеременностиизменяетпроцессыразвитиямозгаплода, начиная с самых ранних стадий нейрогенеза иформирования его структур [1, 2, 8, 10, 15, 16, 18]. Экспериментальные исследования показали, что воздействие этанола лимитирует раннее развитие, задерживая или подавляя формирование и интеграцию нейронов, а также может нарушать сигнальные механизмы, которые регулируют синаптогенез [8,10,14,19].

В выяснении механизмов дизонтогенеза головного мозга в потомстве матерей, употреблявших алкоголь в период беременности, важное место занимают нейроморфлогические, в частности ультраструктурные, а также нейрохимические исследования мозга человека. Установлена способность этанола изменять нейрональную возбудимость при взаимодействии с рецепторными белками. Некоторые из них играют важную роль в реализации и опосредовании эффектов этанола в ЦНС [13]. Многие исследователи предполагают значительную роль ГАМК и ГАМКергическойнейромедиаторной передачи в механизмах действия этанола.

ГАМКа рецептор, являющийся частью ГАМКа-бензодиазепинового рецепторного комплекса (ГАМКа/БДР), является наиболее широко распространенным ингибиторным рецептором в ЦНС. Потенциация ингибиторного эффекта ГАМК лежит в основе седативного и анксиолитического эффектов бензодиазепинов и этанола. Существует предположение о возможном механизме действия этанола, заключающемся в гиперактивацииГАМКа/БДР [5,6,9,11,17,20], однако характер этой связи малоизучен. Тем более важно изучение характера этой связи, особенно в свете онтогенетических изменений развивающегося мозга, так как ГАМК является одним из основных кандидатов фактора роста в ЦНС [7,12]. ГАМК широко известна в современной литературе как нейротрофный агент, являющийся одним из ключевых медиаторов, необходимым для нейронального развития и участвующим в развитии мозга человека и животных [12]. Ранняя экспрессия мест связывания бензодиазепинов - БДР, модулирующих функцию ГАМКа рецепторов, предполагает, что именно эти рецепторы (ГАМКа/БДР) выполняют значительную функциональную роль на всем протяжении развития мозга плода. ГАМКа рецепторы и сопряженные с ними БДР могут обеспечивать различные функции в зависимости от стадии развития, в том числе и морфогенез нейронов [18,19].

Наши исследования продолжают изучение влияния алкоголя на процесс синаптогенеза и формирование бензодиазепиновых рецепторов в развивающемся мозга человека при алкоголизме матери.

Материал и методы

Изучался головной мозг эмбрионов и плодов человека 7--15 недель развития, которые были получены в соответствии с требованиями этического комитета, с согласия пациенток, в процессе проведения операций по прерыванию беременности по медицинским показаниям. Всего было получено 63 эмбриона: 33 - от больных алкоголизмом женщин и 30 - от здоровых женщин (контрольная группа). Возраст больных алкоголизмом был 26--39 лет, длительность заболевания варьировала от 3 до 13 лет. Во всех случаях была диагностирована II стадия алкоголизма (F10.201; F10.202 по МКБ-10). Диагноз установлен в результате клинического обследования сотрудниками отделения аддиктивных состояний НИИ психического здоровья СО РАМН. В контрольную группу вошли пациентки, не имевшие неврологических и психических заболеваний в анамнезе. Женщины контрольной группы были сопоставимы по возрасту с больными алкоголизмом. Для получения достоверной информации эмбриональный материал для исследования брали только в тех случаях, когда отсутствовали вредные воздействия, которые могли оказать дополнительное влияние на развитие мозга эмбрионов (радиация, химические вещества, некоторые лекарственные средства, а также заболевания матери в период беременности - грипп, краснуха, токсоплазмоз и т. д.),

Образцы головного мозга эмбрионов и плодов фиксировали и заливали в аралдит по описанной ранее нами методике. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме«Ultracut-E» (Австрия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали в электронных микроскопах «JEM-100B» и «JEM-100CX». Для исключения возможных ошибок снимки делали с одним и тем же увеличением, как правило, 36 000 или 48 000. Это связано с такими особенностями эмбриональной ткани, как незначительное количество синапсов на ранних стадиях развития и величина самих синаптических соединений.

Электронно-микроскопически исследовали промежуточный слой стенки переднего мозга, который представляет собой скопление нейробластов, глиобластов (включая микроглиальные клетки), между которыми начинают прорастать кровеносные сосуды. Морфометрическому анализу подвергали фотоотпечатки с негативов формата 6х9 см, полученных с помощью электронного микроскопа. Отпечатки с негативов делали контактным способом 1:1, затем изображение сканировали в градациях серого с разрешением 300 dpi, с сохранением в формате TIFF без компрессии. Часть негативов оцифровывали с помощью сканера без промежуточных бумажных фотокопий. На снимках при помощи программы «ScionImageforWindows», разработанной в NationalInstituteofHealth фирмой «ScionCorporation», были исследованы площадь пресинаптическойтерминали, ее периметр, а также длина постсинаптического уплотнения.

Свойства БДР исследовали методом радиорецепторного связывания селективного лиганда[³Н]-флунитразепама («Amersham», Ки) с грубой синаптосомальной фракцией ГМ эмбрионов по методике в нашей модификации [5,6], в конечных концентрациях 0,2--10 нМ. Конечная концентрация мембран по белку составила 0,3 мг/мл. Неспецифическое связывание определяли в присутствии нерадиоактивного лиганда в концентрации 10 мкМ. Радиоактивный анализ количества связанного лиганда проводили в сцинтилляционном -счетчике «Rack-beta» («LKB»). Константу диссоциации (Кд) и максимальное число мест специфического связывания (В_макс) определяли методом анализа кривых насыщения в координатах Скэтчарда.

Распределение признаков достоверно не отличалось от нормального, поэтому для статистической обработки данных применяли параметрический метод вариационной статистики (критерий Стьюдента) с использованием программы «Statistica 8.0», различия считали значимыми при p<0,05. Для изучения корреляционных связей применялся анализ Спирмана.

Результаты

По нашим данным, описанным ранее, на материале, полученном от женщин, больных алкоголизмом, установлено замедление формирования синаптических структур в головном мозге эмбрионов и плодов человека на разных стадиях онтогенеза [3, 4].

Даже при полностью сформированной структуре синаптического соединения на стадии развития 11--12 недель появление синаптических пузырьков в них запаздывает по сравнению с контролем; как правило, меньшей была и площадь активной зоны синапса.

Для проведения количественной оценки с помощью компьютерно-морфометрического анализа электронные микрофотографии синапсов эмбрионального мозга были подразделены на 4 группы соответственно сроку развития эмбрионов: 1-я группа - сроки развития 7-8 недель, 2-я группа - 9-10 недель, 3-я группа - 10-11 недель и 4-я группа - 11-12 недель. Соответствующее разделение производили в контрольной и основной изучаемых группах эмбрионов.Были проанализированы следующие параметры синапсов: 1 - периметр пресинаптическойтерминали, 2 - площадь пресинаптическойтерминали, 3 - длина срезов постсинаптического уплотнения. Соответствующее разделение производили в контрольной и основной изучаемых группах эмбрионов и плодов человека (см. рис. 1, 2, 3).

Результаты исследования показали, что на 7-8-й неделе развития длина постсинаптического уплотнения была наименьшей в изучаемых группах, различия статистически недостоверны (p>0,1). Недоступной для анализа в указанной группе оказались периметр пресинаптическойтерминали и ее площадь, так как к этому сроку развития пресинаптический отдел синаптических соединений локализуется, как правило, на крупных дендритах.Таким образом, на стадии 7-8 недель развития нами выявлено незначительное уменьшение длины постсинаптических уплотнений в опытной группе, но эти различия не достигают уровня значимости.

2-я группа (9 недель развития) характеризовалась рядом особенностей по сравнению с 1-й группой. Синаптические соединения в этом периоде более структурированы и встречались чаще, особенно на верхней границе промежуточного слоя. Длина постсинаптических уплотнений и периметр пресинаптическихтерминалей в контрольной и основной группах различались статистически достоверно (p<0,01) (рис. 1). Различия значений площади, измеренные для пресинаптическойтерминали в контрольной и основной группах, также оказались достоверными (p<0,01) (рис. 2).

Рис. 1. Статистический анализ морфометрических показателей периметра пресинаптическихтерминалей в контрольной и основной группах по неделям развития

Рис. 2. Статистический анализ морфометрических показателей площади пресинаптических терминале в контрольной и основной группах в динамике развития

Количественные параметры синаптических соединений на 9-й неделе развития в основной и контрольной группах отличались достоверно, причем в опытной группе показатели оказались ниже, что повторяет тенденцию, выявленную при анализе морфометрических показателей предыдущей группы. По нашим данным, алкоголь в этот период развития оказывает модифицирующее влияние на становление межклеточных взаимосвязей.

При изучении следующей группы (стадия развития 10 недель) также наблюдались отклонения в сторону уменьшения значений морфометрических параметров в основной группе по сравнению с контрольной. В этой группе отмечено уменьшение длины постсинаптических уплотнений (рис. 3) и площади пресинаптическихтерминалей (p<0,01) (рис. 2). Количественные параметры периметра пресинаптическихтерминалей (рис. 1) не отличались от контрольных значений.

Рис. 3. Статистический анализ морфометрических показателей длины постсинаптических уплотнений в контрольной и основной группах в динамике развития

В группе 11-12 недель развития были выявлены достоверные отличия морфометрических параметров длины постсинаптических уплотнений синаптических контактов (p<0,01) (рис. 3), уменьшение площади пресинаптическойтерминали в основной группе исследования (p<0,01) (рис. 2), а также периметра пресинаптическихтерминалей (p<0,01) (рис. 1).Кроме количественных показателей, было обращено внимание на то, что большинство проанализированных синапсов в сроки развития 11-12 недель были представлены аксодендритическими положительно изогнутыми синапсами с небольшим количеством синаптических пузырьков и одиночными митохондриями в пресинаптических отделах синапсов.

В результате проведения компьютерно-морфометрического анализа выявлены задержка развития синапсов и их структурна незрелость, которые, вероятно, связаны с прямым действием алкоголя на нервные клетки, в первую очередь за счет его мембранотропного действия. Изучение свойств БДР в развивающемся мозге эмбрионов и плодов человека в норме и под влиянием алкоголизма матери мы проводили, определяя характеристики связывания селективного лиганда[³Н]-флунитразепама с бензодиазепиновыми рецепторами синаптосомальных мембран, полученных из образцов ткани мозга, инашли определенные закономерности.

Исследование свойств БДР головного мозга человека при сроке развития 8-9 недель показало, что плотность мест специфического связывания [³Н]-флунитразепама (В_макс) была выше в основной группе, чем в контрольной (рис. 4). Отмечалось снижение аффинности рецепторов или их сродства к селективному лиганду [³Н]-флунитразепаму в основной группе, что выражалось в увеличении абсолютных значений показателя К_д (константа диссоциации лиганд-рецепторного комплекса) (рис. 5). Величина, характеризующая афффинность рецепторов, является обратной константе диссоциации лиганд-рецепторного комплекса - 1/К_д. Это свидетельствует о снижении аффинности рецепторов, т. е. сродства БДР и увеличении их числа в головном мозге эмбрионов человека под влиянием алкоголизации матери.

Рис. 4. Статистический анализ показателей плотности связывания [3H]-флунитразепама с синаптосомальными мембранами эмбрионального мозга человека в динамике в контрольной и основной группах соответственно неделям развития (р<0,005)

При сроке развития 10--11 недель в контрольной группе плотность бензодиазепиновых рецепторов (В_макс) повышалась с увеличением срока развития эмбрионов (рис. 4), в то же время отмечалось снижение сродства (аффинности) рецепторов к своему лиганду, что выражалось в увеличении абсолютных значений К_д (рис. 5). Полученные данные свидетельствуют об изменении аффинности и плотности рецепторов по мере роста и развития нервной ткани головного мозга эмбрионов. В основной группе при этом сроке развития сохранялась та же тенденция, что и при более ранней стадии развития плода, что выражалось в повышении плотности рецепторов и снижении их аффинности по сравнению с контролем. Однако следует отметить, что динамика изменений плотности рецепторов носит дискретный, нелинейный характер.

Рис.5. Статистический анализ показателей аффинности связывания [3H]-флунитразепама с синаптосомальными мембранами эмбрионального мозга человека в динамике в контрольной и основной группах соответственно неделям развития (р<0,005)

На 10-й неделе развития отмечаются незначительные изменения показателей характеристик связывания [³Н]-флунитразепама в контрольной и опытной группах. Плотность рецепторов увеличивается незначительно между 9-й и 10-й неделями развития плода, причем в основной группе под влиянием алкоголя на развивающийся мозг не выявлено достоверных различий плотности БДР при этом сроке развития. Отмечается некоторое торможение роста плотности рецепторов (рис. 4), особенно в основной группе, что имеет свое морфологическое и физиологическое выражение и коррелирует с показателями морфометрической оценки синапсов молодых нейронов: уменьшение площади пресинаптическихтерминалей (S) и длины постсинаптических уплотнений (L) (рис. 2, 3) в основной группе по сравнению с контрольной. Алкоголь уже в этот самый ранний период развития (8-9-я неделя по нашим данным) оказывает модифицирующее влияние на становление межклеточных взаимосвязей и формирование рецепторов и их функциональной и нейромедиаторной активности.

Как было изложено выше, изменение плотности БДР между сроками 8--9 недель и 10--11 недель незначительно. Напротив, при сроке развития 12--13 и 14--15 недель наблюдался более выраженный рост абсолютных значений показателя В_макс (рис. 4), что подтверждает значительное повышение плотности синаптических БДР в этот период. Почти на 200 % происходит увеличение плотности рецепторов в контрольной группе с 8--9 недель развития до 14--15 недель с некоторым замедлением на 10-й неделе.

Плотность рецепторов в основной группе оказалась выше, чем в контрольной, при соответствующих сроках развития и имеет наибольшие различия при более поздних сроках развития - 12--13 и 14--15 недель (рис. 4). Это также коррелирует с морфометрическими показателями синапсов. Следует отметить более сильное изменение морфометрических параметров длины постсинаптических уплотнений синаптических контактов (p<0,01), уменьшение площади пресинаптическойтерминали в основной группе исследования (p<0,01), а также периметра пресинаптическихтерминалей (p<0,01) (рис. 1,2,3), которые характеризуют степень контакта и зрелости формирующихся синапсов, в основной группе по сравнению с контрольной на более поздних сроках развития.

На фоне обнаруженного нами снижения образования синаптических структур в головном мозге плода на разных стадиях развития под влиянием материнского алкоголизма по сравнению с нормой (по данным морфометрической оценки) и одновременного снижения аффинностисинаптосомальных БДР можно оценить тенденцию увеличения плотности рецепторов как компенсаторный механизм адаптации нервной системы эмбриона и плода при алкоголизме матери в условиях функциональной недостаточности ГАМКергическойнейротрансмиссии.

Полученные нами данные подтверждают общую закономерность, заключающуюся в повышении числа рецепторов по мере возрастания срока развития эмбрионов и плодов человека в онтогенезе. Аффинность БДР также изменяется, отражая тенденцию к снижению по мере увеличения срока развития. Следовательно, сродство рецепторов к лиганду, характеризующее их чувствительность, оказывается максимальным на самых ранних сроках развития,а самыми чувствительными и уязвимыми к действию алкоголя являются ранние стадии развития мозга человека.

Таким образом, влияние алкоголизации матери приводит к изменению синаптогенеза и, как следствие, нейромедиаторных процессов в мозге потомства, в частности синаптосомальных БДР, модулирующих функцию ГАМКа рецепторов, может воздействовать на развитие ЦНС эмбриона и плода через эти рецепторы, что приводит к нарушению нейрофизиологических процессов в мозге (памяти, когнитивных функций, поведенческих реакций) и развитию психических расстройств.

Литература

1. Иваншина А. З. Развитие синаптических контактов в головном мозге человека на ранних стадиях эмбриогенеза // Журн. невропатологии и психиатрии. - 1976. - Вып. 7. - С. 983-989.

2. Ковецкий Н. С., Солонский А. В., Моисеева Т. Л. Нарушения развития головного мозга плодов, полученных от матерей, употреблявших алкоголь в период беременности // Журн. неврологии и психиатрии. - 1995. - № 3. - С. 58-63.

3. Солонский А. В. Влияние алкоголизации матери в период беременности на развитие синапсов коры головного мозга эмбрионов человека //Сибирский вестник психиатрии и наркологии. -2002. - № 4. -С. 25-29.

4. Солонский А. В., Логвинов С. В. Ультраструктурные и морфометрические особенности синаптогенеза мозга эмбрионов и плодов человека в условиях пренатального воздействия этанола // Бюл. сибирской медицины. -2008. - № 1. - С. 45-46.

5. Шушпанова Т. В. Свойства бензодиазепиновых рецепторов коры головного мозга крыс с разной степенью предпочтения к этанолу // Журн. невропатологии и психиатрии. - 1989. - Вып. 2. - С. 122-125.

6. Шушпанова Т. В., Семке В. Я. Свойства бензодиазепиновых рецепторов центрального и периферического типов в различных структурах головного мозга человека при алкоголизме // Бюл.эксперим. биологии и медицины. - 1999. - Т. 127. - Приложение 1. - С. 40--42.

7. Barker J. L., Behar T., Li Y. X., Liu Q. Y., Ma W., Maric D., Maric I., Schaffner A. E., Serafini R., Smith S. V., Somogyi R., Vautrin J. Y., Wen X. L., Xian H.GABAergic cells and signals in CNS development // Perspect Dev Neurobiol. - 1998. - V. 5. - P. 305-322.

8. Bookstein F. L., Streissguth A. P., Connor P. D. et al. Damage to the human cerebellum from prenatal alcohol exposure: the anatomy of a simple biometrical explanation // Anat. Record. New Anat. - 2006. - V. 289. - P. 195-209.

9. Buck K. J., Harris R. A. Benzodiazepine agonist and inverse agonist actions on GABAA receptor-operated chloride channels. II. Chronic effects of ethanol // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1990. - V. 253(2). -P. 713-719.

10. Crews F. T., Mdzinarishvili A., Kim D. et al. Neurogenesis in adolescent brain is potently inhibited by ethanol // Neuroscience. - 2006. - V. 137. - P. 437-445.

11. Davies M. The role of GABAA receptors in mediating the effects of alcohol in the central nervous system // Rev. Psychiatr. Neurosci. - 2003. - V. 28, № 4. - P. 263-274.

12. Emerit M., Raid M., Hamon M.Trophic effects of neurotransmitters during brain maturation //Biol. Neonate. - 1992. - V. 62. - P. 193--201.

13. Harris R. A. Ethanol actions on multiple ion channels: which are important? // Alcohol Clin. Exp. Res. - 1999. - V. 23 . - P. 1563-1570.

14. He J., Nixon K., Shetty A. K. et al. Chronic alcohol exposure reduces hippocampal neurogenesis and dendritic growth of newborn neurons // Eur. J. Neurosci. - 2005. - V. 21. - P. 2711-2720.

15. Ieraci A., Herrera D. G. Single alcohol exposure in early life damages hippocampal stem/progenitor cells and reduces adult neurogenesis // Neurobiol. Dis. - 2007. - V. 26. - P. 597 - 605.

16. Klintsova A. Y., Helfer J. L., Calizo L. H. et al. Persistent impairment of hippocampal neurogenesis in young adult rats following early postnatal alcohol exposure // Alcohol. Clin. Exp. Res. - 2007. - V. 31. - P. 2073-2082.

17. Lobo I. A., Harris R. A. GABA_A receptors and alcohol // Pharmacol. Biochem. Behav. - 2008. - V. 90, N. 1. - P. 90-94.

18. Nixon K. Alcohol and adult neurogenesis: roles in neurodegeneration and recovery in chronic alcoholism // Hippocampus. - 2006. - V. 16. - P. 287-295.

19. Singh A. K., Gupta S., Jiang V., Younus M., Ramzan M. In vitro neurogenesis from neural progenitor cells isolated from hippocampus region of the brain of adult rats exposed to ethanol during early development through their alcohol-drinking mothers // Alcohol and Alcoholism. - 2009. - V. 44. - P. 185-198.

20. Warren K. R., Calhoun F. J., May P. A., Viljoen D. L., Li T. K., Tanaka H. et al. GABAA receptors and alcohol // J. Psychiatry Neurosci. - 2003. - V. 28 (4). - P. 270-271.

Размещено на Allbest.ru