Оценка гемолитической активности вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Оценка гемолитической активности вакцинных штаммов

возбудителя сибирской язвы

Ю.О. Селянинов, И.Ю. Егорова

Проводили сравнительную оценку методов определения гемолитической активности возбудителя сибирской язвы. Обсуждается возможность межштаммовой дифференциации и изучения популяционного состава изолятов по типу гемолиза и степени продуцирования гемолизинов, экспрессируемых разными штаммами Bacillus anthracis, на основе использования модифицированной двуслойной агаровой среды.

Как известно, патогенность бактерий обусловлена способностью продуцировать экзо- и эндотоксины (1, 2). Как грамположительные (стафилококки, стрептококки, пневмококки, листерии и др.), так и грамотрицательные (эшерихии, псевдомонады и др.) бактерии различных видов синтезируют внеклеточные токсические белки -- гемолизины, разрушающие мембраны эритроцитов животных и человека. Данные литературы о способности возбудителя сибирской язвы продуцировать белки, обладающие гемолитической активностью, весьма противоречивы (3, 4). Это обусловлено, вероятно, тем, что большинство авторов связывают патогенность этого возбудителя с продуцированием токсина и капсульной субстанции, а роль гемолизинов в патогенезе сибирской язвы не так значительна, поэтому до настоящего времени практически не изучена.

При оценке гемолитической активности возбудителя сибирской язвы в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте и Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (Саратов) все изученные штаммы были разделены на две группы: гемнегативные (в основном вакцинные и атипичные по капсулообразованию) и гемпозитивные (вирулентные изоляты и вакцинные штаммы Ихтиман и Sterne) (5, 6). В ходе комплексных исследований корреляции между вирулентностью и экспрессией таких фенотипических признаков возбудителя сибирской язвы, как протеолитическая и гемолитическая активность, пигментосорбция, пигментосинтез и спорообразование, не отмечена наследственная обусловленность последних при реализации патогенетических процессов у мышей; у морских свинок выявлено достоверное снижение вирулентности изогенных вариантов штаммов, которые не обладают этими признаками (6, 7). Кроме того, показано, что иммунизация золотистых хомячков вакциной из штамма СТИ-1 защищает от заражения вирулентным штаммом Ч-7 и неэффективна в отношении рекомбинантного штамма Ч-7, в ДНК которого интегрирован ген AB цереолизина из штамма ВКМ-В164 Bacillus cereus, что является косвенным доказательством участия гемолизинов в проявлении патогенных свойств (8).

При определении гемолитической активности Bacillus anthracis следует учитывать, что продукция гемолизинов и возможность их обнаружения находятся в зависимости от целого ряда условий: типа гемолизина, состава питательной среды, качества и концентрации эритроцитов, чувствительности последних у разных видов животных, методики проведения тестов и др. В связи с этим в задачу нашей работы входила сравнительная оценка существующих методов и разработка более чувствительной тест-системы, позволяющей определять гемолитическую активность штаммов B. anthracis.

Описание методики. В работе использовали следующие вакцинные штаммы возбудителя сибирской язвы: 55-ВНИИВВиМ, СТИ, СТИ-1, Sterne (фирма Websters, Австралия), 34 F2, Ихтиман, М 71, 71/12, а также штаммы-сапрофиты № 96 и № 8035 близкородственного вида B. cereus. Культивирование проводили в чашках Петри и пробирках на плотных и жидких питательных средах -- МПА (мясопептонный агар), МПБ (мясопептонный бульон).

Количество жизнеспособных спор, полученных при культивировании возбудителя на картофельном агаре в течение 7 сут, определяли посредством высева проб из серийных (10-кратных) разведений на агаровую среду в чашки Петри. Гемолитическую активность B. anthracis оценивали следующими методами: стандартным, луночным (по Цыганковой), на однослойном (по Шевченко) и двуслойном агаре (по разработанной нами схеме). вакцина штамм сибирская язва

Стандартный метод (9). Бульонные культуры возбудителя сибирской язвы высевали петлей на кровяной агар (2-2,5 % агар Хоттингера или МПА с добавлением 5-10 % дефибринированной крови барана) и инкубировали при температуре 361 оС. После 24-48 ч инкубации зоны лизиса эритроцитов отсутствовали. При более продолжительном инкубировании наблюдалось просветление агара вокруг колоний, что, однако, могло быть результатом действия как гемолизинов, так и компонентов питательной среды.

Луночный метод (5). В двуслойном кровяном агаре (1 % подложечный и 0,7 % покрывной агар «Дифко» на физиологическом растворе с добавлением в последний 6 % эритроцитов барана, отмытых физиологическим раствором) пробойником диаметром 8 мм делали лунки (6-7 шт. на одну чашку Петри), дно которых запаивали 1-2 каплями расплавленного агара. В эти лунки вносили по 0,1 мл односуточной бульонной культуры и инкубировали при температуре 361 оС; через 24, 48, 72 и 96 ч по ширине зоны гемолиза (зона просветления вокруг лунок вследствие полного разрушения эритроцитов) определяли гемолитическую активность.

При этом все испытанные штаммы лизировали эритроциты крови барана, что, однако, не согласуется с данными Цыганковой, по которым вакцинные штаммы СТИ, 71/12 и другие были отнесены к группе гемолитически неактивных. Это, видимо, связано с различиями в методах подготовки эритроцитов барана, так как при использовании крови других видов животных и человека эти штаммы вызывали лизис эритроцитов (5). Луночный метод позволяет определять лишь суммарную гемолитическую активность всей популяции возбудителя, зависящую от репродуктивной способности изолятов B. anthracis, и не пригоден для клонального анализа при изучении популяционной гетерогенности или стабильности штаммов. К тому же рост колоний по краю лунки на покрывном слое агара в процессе инкубирования искажает достоверность оценки.

Тест - система на однослойном агаре (6). На поверхность 1,5 % L-агара, приготовленного на основе среды Лурия-Бертани и содержащего 5 % взвеси эритроцитов, 5-кратно отмытых в ASE-буфере (декстроза, цитрат натрия и хлористый натрий соответственно в концентрации 20,5; 7,9 и 4,2 г/л; рН 6,1), наносили посевной материал колоний B. anthracis (однократное касание стеклянный палочкой или иглой) и инкубировали. В связи с тем, что диффузия секретируемых гемолизинов в толщу 1,5 % L-агара, содержащего эритроциты, затруднена, инкубацию проводили в течение 48-72 ч. Гемолитическую активность возбудителя сибирской язвы определяли также по ширине зоны гемолиза вокруг колоний. При низкой и средней гемолитической активности изолятов и высокой репродуктивной способности бактерий зона роста колонии может перекрывать зону гемолиза или совпадать с ней, что искажает результаты анализа. Кроме того, при содержании 5 % взвеси эритроцитов количество экспрессируемых гидролизинов было недостаточным для их полного лизиса.

Следовательно, вышеописанные методики не позволяют в полной мере проанализировать гемолитическую активность различных штаммов B. anthracis, в том числе, имеющих пониженную продукцию этого токсина.

Тест - система на двуслойном агаре. При разработке более эффективного способа определения гемолитической активности возбудителя сибирской язвы нами в качестве основы была использована модифицированная двуслойная агаровая среда с оптимальным соотношением компонентов и подобраны условия постановки реакции. С целью повышения чувствительности эритроцитов к гемолизинам возбудителя их 3-кратно отмывали физиологическим раствором или 5-кратно ASE-буфером (10). Для определения гемолитической активности и типа отдельных колониеобразующих единиц B. anthracis в чашку с двуслойным агаром вносили споровую суспензию возбудителя в рабочем разведении 0,10,01 см3 (2-10 спор на одну чашку), равномерно распределяли посевной материал по поверхности агара, подсушивали 30-40 мин при комнатной температуре и инкубировали при 361 оС. Для оценки гемолитической активности и типа популяции возбудителя посевной материал колонии или бульонную культуру B. anthracis наносили стеклянной палочкой (иглой) на поверхность двуслойного кровяного агара и инкубировали. Тип гемолиза оценивали визуально по отсутствию или наличию зеленоватой окраски в зоне лизиса эритроцитов -- соответственно - или -гемолиз. Гемолитическую активность изолятов или штаммов B. anthracis оценивали через 48 ч по соотношению радиуса колонии (rк) и ширины зоны гемолиза:

При разных способах обработки эритроцитов существенных различий по чувствительности последних к гемолизинам не выявлено, но декстроза, содержащаяся в ASE-буфере, стимулировала репродукцию бактериальных клеток, приводя к разрастанию колоний, что в последующем затрудняло оценку результатов.

При посеве спор восьми штаммов B. anthracis на поверхности агара появлялись отдельные колонии. Через 24-48 ч вокруг колоний всех штаммов образовывалась четко ограниченная зона гемолиза: у пяти штаммов -- прозрачная (-тип), а у трех -- окрашенная в зеленоватый цвет (-тип) (табл.).

Ширина зоны гемолиза у штаммов варьировала от 0,75 до 5,3 мм, что отражало уровень гемолитической активности. Наибольшая гемолитическая активность выявлена у штаммов СТИ, М 71, 71/12, 34 F2, наименьшая -- у штаммов Ихтиман и Sterne. По данным Цыганковой, штаммы Ихтиман и Sterne относились к группе гемолитически активных, так как продуцировали гемолизины на уровне типичных полевых изолятов. По результатам наших исследований, степень гемолитической активности обоих штаммов была низкой. Это противоречие объясняется тем, что штаммы Ихтиман, Sterne и СТИ-1 по сравнению с остальными изученными штаммами обладали более высокой репродуктивной способностью, косвенным показателем которой является радиус колонии.

Оценка гемолитической активности вакцинных штаммов Bacillus anthracis при использовании модифицированной двуслойной агаровой среды

Штаммы B. cereus № 96 и № 8035 характеризовались ?-типом гемолиза и ползучим ростом, который был обусловлен подвижностью микроорганизмов. Кроме того, штаммы сапрофитов инкубировали при комнатной температуре, так как при 36?1 оС уже через 24 ч на поверхности агара образовывался монослой культуры.

Учитывая, что сыворотка крови обладает ингибирующим действием по отношению к гемолизинам, с целью сравнительной оценки активности ?- и вb-гемолизинов была приготовлена двуслойная среда, содержащая в покрывном слое агара 4 % дефибринированной крови кролика. Штаммы оценивали по вышеописанной методике. Через 24-48 ч штаммы, имеющие ?-тип гемолиза (Ихтиман, Sterne, 34 F2), вызывали деградацию эритроцитов, при этом зона гемолиза либо совпадала, либо слегка выступала за край колонии. Штаммы, обладающие ?-типом гемолиза, не вызывали лизиса эритроцитов даже через 72 ч инкубирования. Полученные данные свидетельствуют о том, что сыворотка крови полностью блокирует действие ?-гемолизинов и оказывает незначительное ингибирующее действие на ?-гемолизины.

Итак, восемь исследованных вакцинных штаммов B. anthracis продуцируют экзотоксины, которые вызывают лизис эритроцитов по ?- (Ихтиман, Sterne, 34 F2) или в?-типу (55-ВНИИВВиМ, СТИ, СТИ-1, М 71, 71/12), причем штаммы различаются по уровню гемолитической активности, что позволяет проводить их дифференциацию.

Таким образом, разработанная нами методика на основе использования модифицированной двуслойной агаровой среды дает возможность оценивать гемолитическую активность отдельных колониеобразующих единиц или популяций B. anthracis, определять тип гемолиза и степень ферментативной активности в любой из периодов развития колоний, дифференцировать штаммы, а также изучать стабильность и изменчивость изолятов возбудителя. При этом следует отметить высокую чувствительность и наглядность метода.

Литература

1. ЗавирюхаА.И., Степанюк О.П. Дифференциальная диагностика возбудителя сибирской язвы от ложносибиреязвенных бацилл. В сб.: Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР. М., 1978: 130-131.

2. СтепановА.С., АксеновД.А., ПархоменкоА.А. и др. Получение коллекции опосредованных транспозонами Tn917, Tn916 и Tn916E инсерционных мутантов возбудителя сибирской язвы. В сб.: Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний. Киров, 1991: 154-155.

3. ЛобзинЮ.В., ВолжанинВ.М., ЗахаренкоС.М. Сибирская язва. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2002, 2, 4: 104-127.

4. МарининЛ.И., ОнищенкоГ.Г., СтепановА.В. и др. Микробиологическая диагностика сибирской язвы, М., 1999.

5. ЦыганковаО.И. Гемолитическая и протеолитическая активность сибиреязвенного микроба. Автореф. канд. дис. Саратов, 1993.

6. ШевченкоО.В. Протеолитическая активность возбудителя сибирской язвы. Автореф. канд. дис. Саратов, 1999.

7. МикшисН.И., ЕреминС.А., БолотниковаМ.Ф. Корреляция вирулентности Bacillus anthracis с экспрессией признаков, кодируемых хромосомными генами. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1999

8. PomerantsevA.P., Staritsin N.A., MochovYu.V. e.a. Expression of cereolysine AB genes in Bacillus anthracis vaccine strain ensures protection against experimental hemolytic anthrax infection. Vaccine, 1997, 15, 17/18: 1846-1850.

9. Методические указания по лабораторной диагностике сибирской язвы у животных и людей, обнаружению возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и объектах внешней среды. М., 1989.

10. LepplaS.H. Agar plate methods for screening B. anthracis for mutants. Bacteriology division, 1988, 301: 663-667.

Размещено на Allbest.ru