Высокотехнологические подходы позволяют выявить конформационные изменения в молекуле альбумина у больных С первым эпизодом шизофрении

Размещено на http://www.allbest.ru/

Статья по теме:

Высокотехнологические подходы позволяют выявить конформационные изменения в молекуле альбумина у больных с первым эпизодом шизофрении

Узбеков М. Г., Сырейщикова Т. И., Бабушкина Т. А., Смолина Н. В., Калинина В. В., Добрецов Г. Е., Климова Т. П., Перегудов А. С., Мисионжник Э. Ю., Токарев В. А., ФГУ «Московский НИИ психиатрии» МЗСР РФ, Физический институт им. П. Н. Лебедева РАН, Институт элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова РАН, НИИ физико-химической медицины ФМБА, Москва, РФЯЦ-ВНИИ экспериментальной физики, Саров

Целью работы является описание результатов исследований с использованием высокотехнологических подходов. Субнаносекундная флуоресцентная спектроскопия альбумина сыворотки крови человека применена для изучения возможных конформационных нарушений этого белка у больных с первым эпизодом шизофрении (ПЭШ). Выявлены 3 связывающих центра с амплитудой затухания в 1, 3 и 9 наносекунд (нс). Установлены достоверные различия в центрах с амплитудой затухания в 3 нс между пациентами с ПЭШ и контролями. Показаны достоверные различия в концентрации и реакционной способности тиоловых групп молекулы альбумина между пациентами с ПЭШ и контролями. Выявлены четкие различия в ЯМР 1H спектрах альбумина между пациентами с ПЭШ и контролями. Ключевые слова: больные с первым эпизодом шизофрении, альбумин, субнаносекундная флуоресцентная спектроскопия, тиоловые группы, ЯМР 1H спектры.

High-tech approaches promote to recognize conformational changes in albumin molecule in first episode drug-naIve schizophrenic patients. Uzbekov M. G., Syreyshchikova T. I., Babushkina T. A., Smolina N. V., Kalinina V. V., Dobretsov G. E., Klimova T. P., Peregudov A. S., Misionzhnik E. Yu., Tokarev V. A.5. «Moscow Psychiatry Research Institute». 107258, Moscow, Poteshnaya Street, P. N. Lebedev's Physical Institute RASci. A. N. Nesmeyanov'sInstitute of Elementoorganic Compounds RASci. Physical-Chemical Medicine Research Institute FMBA, Moscow. RFNC All-Russian Experimental Physics Research Institute, Sarov.

The aim of the study was to describe our investigations where the high-tech approaches were used. Subnanosecond fluorescence spectroscopy of human serum albumin was employed for the investigation of possible conformational changes in this protein in first-episode drug-naive schizophrenic (FES) patients. There were revealed 3 binding sites with lifetime of 1, 3 and 9 nanoseconds (ns). There were significant changes in the binding site with lifetime of 3 ns in FES patients in comparison with controls. There were found significant differences in concentration and reaction ability of thiol groups of albumin molecule between FES patients and controls. High resolution NMR 1H spectra of blood serum and its albumin fraction of healthy donors and FES patients were studied. There were shown clear differences in NMR 1H spectra between these two groups that indicates to the conformational changes in albumin molecule in FES patients. Keywords: first-episodeschizophrenicpatients, albumin, subnanosecond.

Психическая патология в настоящее время превратились в большую медико-социальную проблему, которая в ближайшие годы будет только обостряться. Поэтому всестороннее исследование психической патологии должно стать одной из важнейших задач медицинской науки. Прогноз и оценка эффективности терапии основных психических заболеваний, шизофрении депрессии по важности и актуальности выдвигаются на первый план. Трудности поиска новых эффективных методов диагностики, дифференциальной диагностики, прогноза и оценки эффективности терапии являются в значительной мере следствием непонимания этиологии ограниченности в понимании патогенетических и патофизиологических механизмов развития психических расстройств.

В последние годы усилия исследователей сосредоточились на поиске биохимических маркеров основных психических заболеваний и, в значительно меньшей степени, биофизических. Понимание молекулярных процессов при шизофрении является фундаментальным требованием для разработки диагностических, дифференциально-диагностических и прогностических методов и высокого уровня терапии (1,2). Стало ясно, что важным звеном нарушения молекулярных процессов при развитии патологических процессов в организме могут быть конформационные изменения белков, т.е. ориентация белковой молекулы в пространстве. Примером служат прионы-белки с нарушенной конформацией, что приводит к психическим расстройствам (3). Очевидно, что для развития патологических процессов в организме важны не только изменения химической структуры белков, но не менее важными могут быть изменения конформации молекулы белка.

Недавно полученные нами данные показали, что при стрессе, шизофрении и некоторых видах депрессии изменяется конформация и, соответственно, физико-химические свойства главного транспортного белка крови-альбумина (4).

Альбумин-главный (до 50 % по массе) белок плазмы крови, выполняет в организме важные функции, благодаря уникальным свойствам сопрягает в организме множество метаболических процессов; активный участник множества процессов. Изменение конформации связывающих центровальбумина может явиться одним из неизвестных ранее и чрезвычайно важных фактор овпатогенеза заболеваний. Нормальное выполнение альбумином своих функций должно быть тесно связано с сохранением нормальной конформации: активные группы молекулы (аминогруппы, SH-группа, связывающие центры) альбумина должны быть доступными для взаимодействий с лигандами, т.е. иметь «нативную» конформацию.

В проблеме изучения альбумина существуют вопросы, которые многие годы обходили стороной: если при патологическом состоянии концентрация альбумина в крови нормальная, значит ли это, что молекула альбумина способна нормально выполнять свои функции? Не могло ли в альбумине возникнуть каких-либо изменений, которые способны повлиять на способность его центров связывать основные лиганды?

Для ответа на эти вопросы требовалось создать новую технологию анализа структурных изменений в молекулах альбумина, которая была бы, с одной стороны, высокочувствительной, с другой стороны, достаточно простой для использования клиническими лабораториями.

Цель - описание тех исследований, в которых использование высокотехнологических подходов способствовало выявлению конформационных изменений в молекуле альбумина у больных с первым эпизодом шизофрении (ПЭШ).

Материал. Группы пациентов обследованы клиническими, биохимическими и биофизическими методами; средний возраст - 28,2±9,5 года. (Число пациентов в каждой группе указано в соответствующих разделах.)

Во всех случаях диагностирована шизофрения в соответствии с критериями МКБ-10: параноидная(F20.0) и недифференцированная (F20.3). Длительность заболевания в среднем была равна 1,5 года. Не смотря на сравнительно длительный субпсихотический продромальный период заболевания, ни один больной не получал антипсихотическую терапию до поступления в клинику первого психотического эпизода Московского НИИ психиатрии.

Критерии включения в исследование: возраст старше 18лет; первый психотический эпизод (баллы по шкале PANSS более 60); диагноз шизофрении в соответствии с МКБ-10; отсутствие предшествующей антипсихотической фармакотерапии; стабильное соматическое здоровье.

Критерии исключения: злоупотребление алкоголем или наркотиками; тяжелые соматические заболевания; патологически измененные стандартные биохимические показатели; любая сопутствующая терапия психотропными препаратами до начала исследования.

Все больные дали информированное согласие на участие в исследовании. Исследование проводилось в соответствии с «Законом РФ о психиатрической помощи» (2004) и Хельсинской Декларацией для экспериментов, включающих людей.

По клинико-биохимическим показателям контрольные группы отнесены к группе здоровых, сопоставимых с больными ПЭШ по полу и возрасту.

Субнаносекундная флуоресцентная спектроскопия сывороточного альбумина человека. При помощи флуоресцентного зонда К-35, специфически связывающегося с альбумином сыворотки (5), было проведено исследование свойств связывающих центров альбумина сывороток больных ПЭШ(n=20) до начала терапии доноров (n=7)с помощью разрешенной во времени флуоресцентной спектроскопии. В Физическом институте им. П. Н. Лебедева РАН для выполнения флуоресцентных исследований была создана установка на основе пульсирующего источника света (лазер или LED) фирмы Pico-Quant с длиной волны излучения 405 нм или 459 нм и максимальной частотой импульсов 40МГц. Основная работа проведена с LED на частоте 10 MHz при максимальной оптической мощности 30мW. Флуоресценцию регистрировали при 535нм. В качестве детектора фотонов используется фотоэлектронный умножитель Hamamatsu(PMA-182). Для коррелированного во времени счета одиночных фотонов флуоресценции применялась PCI-Board Time Harp 200 (фирма Pico Quant). Время-амплитудный конвертор содержит 4096 каналов регистрации фотонов с шириной канала в 33 пикосекунды. Длительность импульсов возбуждающего излучения - около 700 пикосекунд, интервал повторения импульсов-100нс. Установка оснащена термостатированной кюветой, набором интерференционных фильтров для регистрации излучения в диапазоне от 450 до 650 нм и поляризаторами излучения. На базе персонального компьютера (типа AMDS empron) автоматизированы как процесс измерения, так и обработка экспериментальных данных (Программы Time Harp и Fluo Fit фирмы Pico-Quant) (6).

Если возбудить молекулы зонда К-35 коротким световым импульсом, то молекулы постепенно излучают поглощенные кванты света и флуоресценция затухает. Весь процесс занимает примерно 10--20нс. Для регистрации таких быстрых процессов была применена вышеуказанная специальная физическая техника. Если бы все молекулы зонда К-35, связанные с альбумином, находились в одинаковом окружении, то интенсивность флуоресценции (F) затухала бы со временем (t) по экспоненциальному закону:

, где

альбумин белок шизофрения сыроватка

А - амплитуда,ф - постоянная времени затухания.

Амплитуда (А) пропорциональна числу молекул зонда, обладающих такой флуоресценцией. Однако в случае комплекса К-35 с альбумином затухание описывается не 1 экспонентой, а суммой 3:

ф1близкак9нс,ф2-к3нс, ф3-к1нс.

Выяснилось, что соотношение для компоненты А2, А2(0,02 М)/А2(0,159 М) неодинаково в разных группах. Среднее значение и диапазон изменений параметра А2(0,02 М)/А2(0,159 М) в группах здоровых добровольцев и больных с первым эпизодом шизофрении составляли 1,43±0,03 и 1,31±0,02 (р<0,001). Результаты представлены на рисунке 1.

Таким образом, глобула альбумина сыворотки больных с первым эпизодом шизофрении и здоровых по-разному реагирует на увеличение ионной силы раствора. При этом соотношения для компонент А1 и А3 не различались между больными и донорами.

Рис. 1 - Влияние изменения ионной силы раствора на амплитуду компоненты «3 нс» у доноров и больных с первым эпизодом шизофрении

Примечание. По вертикальной оси - соотношение амплитуд А2 при низкой и высокой ионной силе, данные представлены как M±m.

Исследования показали, что три экспоненты объясняются тем, что связывающие центры альбумина различны и/или находятся в разном состоянии, поэтому и флуоресценция молекул зонда разная. При измерении затухания флуоресценции получается более многогранная картина состояния связывающих центров альбумина. Вместо одного суммарного, усредненного показателя - «эффективная концентрация альбумина», что мы получаем при стационарной флуоресцентной спектроскопии, - мы видим состояние трех типов центров и их возможные изменения при патологических процессах. Расчеты показали, что молекулы зонда первого типа (ф1около9нс) практически неподвижны в своем связывающем центре, молекулы второго типа (ф2около3нс) испытывают медленное тепловое движение, а молекулы третьего типа (ф3около1нс) движутся довольно быстро в своем связывающем центре. То есть свобода теплового движения в этих центрах значительно различается (7).

Представленные данные указывают, что применение новых технологических подходов - импульсной флуоресцентной спектроскопии и с субнано-ипикосекундным разрешением с наночастицей флуоресцентного зонда - позволяет выявить чрезвычайно тонкие, только возникающие нарушения в молекуле альбумина.

Состояние тиоловых групп альбумина сыворотки у больных ПЭШ. Показано, что пациенты ПЭШ еще до начала терапии имеют значительные метаболические нарушения (2), которые сопровождаются изменением активности ферментов, накоплением токсических продуктов в организме, развитием так называемого синдром аэндогенной интоксикации. Как следствие, большой интерес представляет состояние систем защиты против возникающей интоксикации и развивающегося окислительного стресса. При изучении этой проблемы обычно измеряются низкомолекулярные антиоксиданты и активность антиоксидантных ферментов (8). Однако концентрация и реакционная способность тиоловых групп альбумина сыворотки крови при ПЭШ никем не определялись. Сывороточный альбумин и восстановленную SH-группу в положении Cys-34. При обрывании цепи свободно радикального окисления этатиоловая группа окисляется безвозвратно. В физиологических условиях до 80 % определяемых высокомолекулярных тиолов плазмы составляют именно тиолы альбумина(9). Выполнение альбумином антиоксидантной функции зависит от доли его восстановленных тиолов и конформационного состояния молекулы альбумина. Таким образом, свойства тиоловой группы альбумина могут выступать маркерами его конформационных изменений, которые в итоге скажутся на выполнении альбуминоми его транспортных функций. В связи с этим изучение концентрации и реакционной способности SH-группа альбумина при ПЭШ имеет существенный интерес не только как фактор антиокислительной защиты, но и как важное звено метаболических процессов в организме.

Группу пациентов с ПЭШ составили 21человек; контрольная группа состояла из 10человек.

Концентрацию SH-групп определяли в классической реакции Эллмана (10). Реакционную способность SH-групп альбумина оценивали с помощью модификации реакции Эллмана-в отсутствии детергента, ускоряющего реакцию. Длительность измерений составляла 30минут. Математическую обработку данных проводили с помощью метода Гуггенгейма (11).

Установлено достоверное снижение концентрации тиолов альбумина сыворотки крови у больных ПЭШ по сравнению с контролем. При исследовании реакционной способности SH-групп, оставшихся неокисленным и в реакции с тиол-специфичным реагентом дитионит робензолом, показано снижение константы с коростиреакции(Kv)(на24 %; p=0,02)у больных ПЭШ по сравнению с контролем (табл. 1).

Таблица 1 - Средние значения концентрации тиолови реакционной способности тиолов альбумина у больных ПЭШ и в контрольной группе (p=0,02)

Так как альбумин составляет до половины всех белков сыворотки крови, участвует в транспорте многих соединений и в защите от свободнорадикального окисления, то изменение его функций может значительно влиять на изменение окислительно-восстановительных процессов в организме. SH-группа находится в молекуле альбумина в некоем углублении - «кармане» (12). Если конформация молекулы такова, что этот «карман» недоступен для взаимодействия с микроокружением, то, несмотря на наличие восстановленной SH-группы, молекула не будет участвовать в окислительно-восстановительных реакциях. Если же молекула развёрнута на столько, что SH-группа становится доступной для взаимодействия при малейшей концентрации свободных радикалов, то в итоге почти весь пултиолов альбумина окажется окисленным. Таким образом, изменение реакционной способности тиоловых групп альбумина говорит об изменении их «доступности» для взаимодействия с окислителями, а значит, об изменении конформационного состояния всей молекулы. В результате изменение конформационного состояния альбумина может отражаться на всех его многочисленных функциях.

Метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР1Н) альбумина сыворотки крови у больных ПЭШ. ЯМР1Н высокого разрешения в сильном магнитном поле позволяет обнаруживать и даже количественно определять важные метаболиты различных биологических жидкостей и изменение их состава при заболеваниях и в процессе их лечения (13). Для исследования методом ЯМР используют плазму крови или сыворотку. В спектрахЯМР1Н плазмы или сыворотки крови обнаруживают сигналы ряда низко и высокомолекулярных соединений: аминокислоты, кетоновые тела, сахара, а также креатин, креатинин, холестерин, холин, липопротеины и другие (14).

Методом ЯМР 1Н высокого разрешения исследованы спектры образцов сыворотки крови здоровых людей (4 чел.) и пациентов (19 чел.) с ПЭШ, а также альбумина, выделенного из этих образцов.

Спектры ЯМР1Н высокого разрешения сыворотки крови и водных растворов ЧСА были сняты на приборе Avance-600 (фирма Брукер) в режиме преднасыщения сигнала воды. Концентрация сыворотки крови, рассчитанная по концентрации альбумина в сыворотке, была равна 50мг/мл, концентрация альбуминовой фракции вводных растворах была равна 25мг/мл, количество D2Oс растворенным в ней фосфатным буфером, добавленной в образцы сыворотки и альбумина, было равно 10 % по объему (15). В спектрах сыворотки крови наблюдалось увеличение интенсивности CH2-протонов липидных сигналов. Это можно интерпретировать как увеличение фракции длинноцепочечных липидов у больных ПЭШ и относительное изменение фракций липидов низкой плотности (рис. 2а).

В спектрах водных растворов сывороточного альбумина больных ПЭШ наблюдалось увеличение интенсивности сигналов метильных протонов неэстерефицированных жирных кислот альбумина (рис. 2б). Это указывает либо на увеличение числа молекул жирных кислот, т.е. на изменение лигандной нагрузки альбумина, либо на возрастание подвижности метильных групп жирных кислот, т.е. на изменение конформации молекул альбумина.

Таким образом, спектры ЯМР1Н высокого разрешения сыворотки крови больных ПЭШ указывают на изменения соотношения между различными фракциями липидов, связанных с альбумином. В тоже время спектры ЯМР1Н высокого разрешения альбумина, выделенного из сыворотки крови больных ПЭШ, подтверждают предположение о разной лигандной нагрузке альбумина здоровых и больных ПЭШ, т.е. на изменение конфирмационного состояния молекулы альбумина у больных ПЭШ.

Разработка подходов и методов для выявления факторов риска возникновения психических нарушений, в частности шизофрении, является актуальной задачей. Это дало бы возможность клиницистам выявить продромальные, предклинические признаки заболевания, и провести профилактические меры, которые могут предотвратить развитие заболевания или, по крайней мере, уменьшить остроту и выраженность болезни.

Инновационные подходы с использованием высокотехнологических принципов, что продемонстрировано в настоящем исследовании, открывают широкие перспективы для создания новых диагностических, прогностических методов и способов оценки эффективности различных видов терапии психически больных людей.

Литература

1. Логинова Л. В., Смирнова Л. П., Коваль В. В., Фёдорова О. С., Семке А. В., Иванова С. А. Масс-спектрометрический анализ белков сыворотки крови больных шизофренией // Бюллетень СО РАМН. - 2011. - Т. 31, № 6. - С. 63--68.

2. Узбеков М. Г., Мисионжник Э. Ю., Шмуклер А. Б., Гурович И. Я., Грызунов Ю. А., Смолина Н. В., Калинина В. В., Соколова Т. Н., Москвитина Т. А., Шевченко В. А. Нарушение активности моноаминоксидазы и показателей эндогенной интоксикации у больных с первым эпизодом шизофрении // Журн. неврологии и психиатрии. - 2009. - Т. 109, вып. 5. - С. 48--52.

3. Prusiner S. B. Prions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1998. - V. 95, № 23. - P. 13363--13383.

4. Добрецов Г. Е., Грызунов Ю. А., Смолина Н. В., Родоман Г. В., Узбеков М. Г. Альбуминовый флуоресцентный тест: результаты клинических испытаний (обзор)// Эфферентная и физико-химическая медицина. - 2009. - Т. 1, № 1. - С. 16--26.

5. Миллер Ю. И., Добрецов Г. Е. Молекулярные основы флуоресцентного метода определения связывающей емкости альбумина сыворотки крови // Клинико-лаб. диагностика. - 1994. - Вып. 5. - С. 20--23.

6. Сырейщикова Т. И., Грызунов Ю. А., Смолина Н. В., Добрецов Г. Е., Комар А. А, Узбеков М. Г., Мисионжник Э. Ю., Молодецких А. В., Максимова Н. М. Пикосекундная флуоресцентная спектроскопия белков как новый подход к оценке эффективности терапии психических заболеваний // Альманах клинической медицины. - 2008. - Т. ХVII, № 1. - С. 94--96.

7. Добрецов Г. Е., Сырейщикова Т. И., Грызунов Ю. А., Смолина Н. В., Комар А. А. Особенности связывания флуоресцентного зонда К-35 с альбумином // Биофизика. - 2010. - Т. 55, вып 2. - С. 213--219.

8. Mahadik S. P., Mukherjee S. Free radical pathology and antioxidant defense in schizophrenia: a review // Schizophr. Res. - 1996. - V. 19. - P. 1--17.

9. Jocelyn P. C. Biochemistry of the SH group. - London,New York: Academic Press, 1972.

10. Ellman G. L. Tissue sulfhydryl groups // Arch.Biochem.Biophys. - 1959. - V. 82, № 1. - P. 70--77.

11. Guggenheim E. A. Thermodynamics - an Advanced Treatment for Chemists and Physicists. - Amsterdam: North-Holland Publishing Company, 1949.

12. Peters T. J. All about albumin: biochemistry, genetics and medical applications. - San Diego: Acad. Press, 1996.

13. Колоколова Т. Н., Савельев О. Ю., Сергеев Н. М. Метаболический анализ биологических жидкостей человека с помощью спектроскопии ЯМР 1H // Журн.аналит. химии. - 2008. - Т. 63, № 2. - С. 118--136.

14. Nicholson J. K., Foxall P. J., Spraul M., Farrant R. D., Lindon J. C. 750 Mhz 1H and 1H-13C NMR spectroscopy of human blood plasma // Anal. Chem. - 1995. - V. 67. - P. 793--811.

15. Бабушкина Т. А., Климова Т. П., Перегудов А. С., Грызунов Ю. А., Смолина Н. В., Добрецов Г. Е., Узбеков М. Г. Исследование спектров ЯМР 1Н высокого разрешения сыворотки крови и ее альбуминовой фракции у больных с первым эпизодом шизофрении // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 152, № 12. - С. 695--698.

16. Loginova L. V., Smirnova L. P., Koval V. V., Fyodorova O. S., Semke A. V., Ivanova S. A. Mass-spektrometricheskiyanalizbelkovsyivorotkikrovibolnyihshizofreniey // Byulleten SO RAMN. - 2011. - T. 31, N 6. - S. 63--68/

17. Uzbekov M. G., Misionzhnik E. Yu., Shmukler A. B., Guro-vich I. Ya., Gryizunov Yu. A., Smolina N. V., Kalinina V. V., Sokolova T. N., Moskvitina T. A., Shevchenko V. A. Narushenieaktivnostimonoaminoksidazyiipokazateleyendogennoyintoksikatsii u bolnyih s pervyimepizodomshizofrenii // Zhurn. nevrologiiipsihiatrii. - 2009. - T. 109, vyip. 5. - S. 48--52.

18. Dobretsov G. E., Gryizunov Yu. A., Smolina N. V., Rodo-man G. V., Uzbekov M. G. Albuminovyiyfluorestsentnyiy test: rezultatyiklinicheskihispyitaniy (obzor) // Efferentnayaifiziko-himicheskayameditsina. - 2009. - T. 1, N 1. - S. 16--26.

19. Miller Yu. I., Dobretsov G. E. Molekulyarnyieosnovyiflyuorestsentnogometodaopredeleniyasvyazyivayuscheyemkostialbuminasyivorotkikrovi // Kliniko-lab. diagnostika. - 1994. - Vyip. 5. - S. 20--23.

20. Syireyschikova T. I., Gryizunov Yu. A., Smolina N. V., Dobretsov G. E., Komar A. A, Uzbekov M. G., Misionzhnik E. Yu., Molodetskih A. V., Maksimova N. M. Pikosekund-nayafluorestsentnayaspektroskopiyabelkovkaknovyiypodhod k otsenkeeffektivnostiterapiipsihicheskihzabolevaniy // Almanahklinicheskoymeditsinyi. - 2008. - T. HVII, N 1. - S. 94--96.

21. Dobretsov G. E., Syireyschikova T. I., Gryizunov Yu. A., Smolina N. V., Komar A. A. Osobennostisvyazyivaniyafluorestsentnogozonda K-35 s albuminom // Biofizika. - 2010. - T. 55, vyip 2. - S. 213--219.

22. Kolokolova T. N., Savelev O. Yu., Sergeev N. M. Me-tabolicheskiyanalizbiologicheskihzhidkosteycheloveka s pomoschyuspektroskopiiYaMR 1H // Zhurn. analit. himii. - 2008. - T. 63, N 2. - S. 118--136.

23. Babushkina T. A., Klimova T. P., Peregudov A. S., Gryi-zunov Yu. A., Smolina N. V., Dobretsov G. E., Uzbekov M. G. IssledovaniespektrovYaMR 1N vyisokogorazresheniyasyivorotkikroviieealbuminovoyfraktsii u bolnyih s pervyimepizodomshizofrenii // Byull. eksperimentalnoybiologiiimeditsinyi. - 2011. - T. 152, N 12. - S. 695--698.

Размещено на Allbest.ru