Влияние нативной PIP5K2A и мутантной, ассоциированной с шизофренией N251SPIP5K2A на активность нейрональных EAAT3 глутаматных транспортёров

Размещено на http://www.allbest.ru/

Томск, ГУ НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН

Влияние нативной PIP5K2A и мутантной, ассоциированной с шизофренией ^N251SPIP5K2A на активность нейрональных EAAT3 глутаматных транспортёров

О.Ю. Федоренко

С.А. Иванова

А.В. Семке

Резюме

мутация возбудимость шизофрения

Согласно предшествующим исследованиям, ген, кодирующий фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназу (PIP5K2A), ассоциирован с шизофренией. У больных шизофренией обнаружена специфическая мутация ^N251SPIP5K2A, которая не встречается у здоровых людей. Подобным образом дефектный возбуждающий аминокислотный транспортёр EAAT3 вовлечён в развитие шизофрении. В настоящей работе исследовалось участие PIP5K2A в регуляции EAAT3 активности. EAAT3 экспрессировался в Xenopus ооцитах либо без, либо с PIP5K2A, и активность EAAT3 транспортёра оценивалась по глутамат (2 мМ) индуцированному току (Iglu) стандартным двухэлектродным Voltage Clamp методом. В EAAT3 экспрессирующих ооцитах Iglu был увеличен при коэкспрессии с диким типом PIP5K2A. Одновременная экспрессия мутантной, ассоциированной с шизофренией ^N251SPIP5K2A значительно снижала Iglu в ооцитах, экспрессирующих EAAT3. Таким образом, ^N251SPIP5K2A оказывает ингибирующий эффект на EAAT3. Настоящее исследование раскрыло новый механизм EAAT3 регуляции, который может вносить свою роль в нарушение регуляции возбудимости у больных шизофренией.

Ключевые слова: шизофрения, глутамат, мутация, нейровозбудимость

Abstract

According to previous observations, the gene encoding the phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase II alpha (PIP5K2A) is associated with schizophrenia. Specifically, the mutation ^N251SPIP5K2A has been discovered in schizophrenic partients but not in healthy individuals. Defective excitatory amino acid transporter EAAT3 has similarly been implicated in the development of schizophrenia. The present study thus explored, whether PIP5K2A is involved in the regulation of EAAT3 activity. EAAT3 has been expressed in Xenopus oocytes either without or with PIP5K2A and EAAT3 transporter activity estimated from glutamate (2 mM) induced current (I_glu) in two electrode voltage clamp experiments. In EAAT3 expressing oocytes, I_glu was enhanced by coexpression of wild type PIP5K2A. Coexpression of the schizophrenia associated mutant ^N251SPIP5K2A significantly decreased I_glu in oocytes expressing EAAT3. Thus, ^N251SPIP5K2A exerts an inhibitory effect on EAAT3. The present observation discloses a novel mechanism of EAAT3 regulation, which may contribute to the deranged regulation of excitability in schizophrenic patients. Key words: schizophrenia, glutamate, mutation, neuroexcitability.

Введение

В результате проведённых недавно независимых фармакогенетических исследований обнаружена ассоциация между мутацией в гене, кодирующим фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназу (N251S)-PIP5K2A и развитием шизофрении [1, 6, 14]. PIP5K2A генерирует фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат, который представляет собой сигнальную молекулу, участвующую в регуляции клеточных мембранных белков [2, 3]. Нейрональный Na+-связанный аминокислотный транспортёр EAAT3 аналогичным образом вовлечён в патофизиологию шизофрении [4, 7, 8, 11]. EAAT3 транспортёр экспрессирован в различных тканях, включая гематоэнцефалический барьер [12], нейроны [5, 10], ретинальные ганглиональные клетки [13] и глиальные клетки [9, 15]. Функции EAAT3 транспортёра заключаются в обратном захвате глутамата из экстраклеточного пространства.

Цель работы - изучение роли нативной PIP5K2A и мутантной, ассоциированной с шизофренией ^N251SPIP5K2A в регуляции нейронального глутаматного транспортёра EAAT3.

Материалы и методы. В качестве экспрессирующей модели использовались Xenopus ооциты, в которые инъецировалась 3,5 нг кРНК, кодирующей глутаматный транспортёр EAAT3. Одновременно в часть ооцитов инъецировалась 5 нг кРНК, кодирующей PIP5K2A или ^N251SPIP5K2A. EAAT3 был субклонирован в ооцитном экспрессирующем векторе pBluescript SK (Stratagene). В качестве рестрикционного фермента для линеаризации использовался NotI (New England BioLabs). Для очистки линеаризованной ДНК использовался набор NucleoSpin Extract II (MACHEREY-NAGEL). Синтез кРНК выполнен in vitro с использованием набора mMessage mMachine T7-polymerase kit (Ambion).

PI(4,5)P5K2A/pBluescript получен из немецкого ресурсного центра для генетических исследований RZPD (Deutsche Ressourcenzentrum fьr Genomforschung; IRAKp961N0632Q, Регистрационный No. BC018034). ДНК была линеаризована с помощью BamHI (New England BioLabs). Для очистки линеаризованной ДНК использовался набор QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). In vitro синтез кРНК выполнен с использованием набора mMessage mMachine T7-polymerase kit (Ambion).

Мутантная форма ^N251SPIP5K2A была получена двухступенчатой полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием праймеров: прямой мутагенезный праймер ATGACAACAGCAAGAAGGTC, обратный мутагенезный праймер GACCTTCTTGCTGTTGTCAT, прямой внешний праймер TCGGGAGCACGGCGGTGGA и обратный внешний праймер AGTACACCTCCTTCCTAGG.

После экспрессии глутаматного транспортёра и соответствующих ферментов измерялся ток Iglu через EAAT3 транспортёры, индуцированный транспортом глутамата через клеточную мембрану ооцитов стандартным двухэлектродным Voltage Clamp методом с использованием Turbo Tec 10CX (NPI, Tamm, Германия) усилителя, ITC-16 интерфейса, объединённым с pCLAMP 8,0 программным обеспечением (Axon Instruments Inc. Molecular Devices, Калифорния, США) для получения и анализа данных. Регистрация тока проводилась при исходном потенциале -60 мВ. Перфузионный раствор содержал 96 мM NaCl, 2 мM KCl, 1,8 мM CaCl2, 1 мM MgCl2, 5 мM HEPES (pH 7,6). Глутамат добавлялся в концентрации 2 мМ. Скорость перфузии составляла 20 мл/мин. и полное обновление раствора камеры достигалось за 10 сек. Графический анализ и статистическая обработка результатов выполнялись с использованием Origin 6.0 программного обеспечения («Microcal», Германия). Данные представлены в среднее арифметическое ± стандартная погрешность среднего, n - число ооцитов. Все эксперименты повторялись по крайней мере в 3 опытных сериях, во всех повторах были получены качественно одинаковые результаты. Данные были анализированы с использованием ANOVA и результаты с p<0,05 рассматривались как статистически значимые.

Результаты и обсуждение. В Xenopus ооцитах, экспрессирующих возбуждающий аминокислотный транспортёр EAAT3, глутамат (2 мМ) индуцировал направленный внутрь клетки ток (I_glu), указывающий на электрогенное вхождение Na⁺ и глутамата (рис. 1). В неинъецированных Xenopus ооцитах подобный ток не регистрировался. Таким образом, Xenopus ооциты не экспрессируют эндогенные электрогенные глутаматные транспортёры. На рисунке 1 представлены M±m (2 мМ) индуцированных нормализованных токов (I_glu) в Xenopus ооцитах, экспрессирующих EAAT3 без (белый столбик, n=36) или с (чёрный столбик, n=40) дополнительной коэкспрессии PIP5K2A. * означает статистически значимую разницу по отношению к току в Xenopus ооцитах, экспрессирующих EAAT3 в одиночку.

Влияние нативной PIP5K2A на нейрональные EAAT3 глутаматные транспортёры

При коэкспрессии EAAT3 и так называемого «дикого» типа PIP5K2A получен стимулирующий эффект по сравнению с одиночной экспрессией EAAT3. В EAAT3 экспрессирующих Xenopus ооцитах дополнительная экспрессия PIP5K2A сопровождалась значительным повышением I_glu (рис. 1). Таким образом, PIP5K2A повышает активность глутаматных EAAT3 транспортёров.

Поскольку EAAT3 экспрессированы в нейронах [5, 10], ретинальных ганглиональных клетках [13] и глиальных клетках [9, 15], они, осуществляя обратный захват глутамата и аспартата, могут, таким образом, снижать нейротоксичность в этих клетках. Настоящее исследование открыло абсолютно новый механизм регулирования нейрональных глутаматных транспортёров EAAT3, а именно стимуляцию EAAT3 фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназой (тип 2 альфа).

Влияние мутантной ^N251SPIP5K2A на нейрональные EAAT3 глутаматные транспортёры

Дальнейшая серия экспериментов была предпринята, чтобы выяснить, имеет ли мутантная форма ^N251SPIP5K2A аналогичный стимулирующий эффект, которым обладает «дикий» тип PIP5K2A.

Рис. 1. Коэкспрессия PIP5K2A стимулирует электрогенный глутаматный транспорт в EAAT3 экспрессирующих Xenopus ооцитах

Дефектная ^N251SPIP5K2A киназа предположительно должна нарушать функцию EAAT3. На рисунке 2 проиллюстрировано, что дополнительная экспрессия ^N251SPIP5K2A в EAAT3-экспрессирующих Xenopus ооцитах приводила к значительному снижению I_glu.

На рисунке представлены средние M±m глутамат (2 мМ) индуцированных нормализованных токов (I_glu) в Xenopus ооцитах, экспрессирующих EAAT3 без (белый столбик, n=35) или с (чёрный столбик, n=31) дополнительной коэкспрессии ^N251SPIP5K2A. * означает статистически значимую разницу по отношению к току в Xenopus ооцитах, экспрессирующих EAAT3 в одиночку.

Рис. 2. Коэкспрессия неактивной ^N251SPIP5K2A снижает электрогенный глутаматный транспорт в EAAT3 экспрессирующих Xenopus ооцитах

Таким образом, в противоположность «дикому» типу PIP5K2A, мутантная ^N251SPIP5K2A снижала активность EAAT3. Неспособность мутантной ^N251SPIP5K2A стимулировать EAAT3 может объясняться нарушенной киназной активностью, приводящей к снижению образования PI(4,5)P₂. Полученные данные не исключают других возможных объяснений ингибирующего эффекта ^N251SPIP5K2A на EAAT3, в том числе более непосредственного влияния на EAAT3. Так как мутация ^N251SPIP5K2A ассоциирована с шизофренией [1, 6, 14], нарушение регуляции EAAT3 может вносить свой вклад в патофизиологию этого заболевания.

Литература

1. Bakker S.C., Hoogendoorn M. L., Hendriks J. et al. The PIP5K2A and RGS4 genes are differentially associated with deficit and non-deficit schizophrenia // Genes Brain Behav. - 2007. - N. 6. - P. 113--119.

2. Brown D.A., Hughes S.A., Marsh S.J. et al. Regulation of M (Kv7.2/7.3) channels in neurons by PIP2 and products of PIP2 hydrolysis: significance for receptor-mediated inhibition // J Physiol. - 2007. - V. 582. - P. 917--925.

3. Delmas P., Brown D.A. Pathways modulating neural KCNQ/M (Kv7) potassium channels // Nat. Rev. Neurosci. - 2005. - N. 6. - P. 850--862.

4. Deng X., Shibata H., Takeuchi N. et al. Association study of polymorphisms in the glutamate transporter genes SLC1A1, SLC1A3, and SLC1A6 with schizophrenia // Am. J. Med. Genet. Neuropsychiatr. Genet. - 2007. - V. 144. - P. 271--278.

5. Furuta A., Takashima S., Yokoo H. et al. Expression of glutamate transporter subtypes during normal human corticogenesis and type II lissencephaly // Brain. Res. Dev. Brain. Res. - 2005. - V. 155. - P. 155--164.

6. He Z., Li Z., Shi Y. et al. The PIP5K2A gene and schizophrenia in the Chinese population-a case-control study // Schizophr Res. - 2007. - V. 94. - P. 359-365.

7. Huerta I., McCullumsmith R.E., Haroutunian V. et al. Expression of excitatory amino acid transporter interacting protein transcripts in the thalamus in schizophrenia // Synapse. - 2006. - V. 59. - P. 394--402.

8. Kim J.H., Do S.H., Kim Y.L. et al. Effects of chronic exposure to ethanol on glutamate transporter EAAT3 expressed in Xenopus oocytes: evidence for protein kinase C involvement // Alcohol Clin. Exp. Res. - 2005. - V. 29. - P. 2046--2052.

9. Maragakis N.J., Dietrich J., Wong V. et al. Glutamate transporter expression and function in human glial progenitors // Glia. - 2004. - V. 45. - P. 133--143.

10. Nieoullon A., Canolle B., Masmejean F. et al. The neuronal excitatory amino acid transporter EAAC1/EAAT3: does it represent a major actor at the brain excitatory synapse? // J. Neurochem. - 2006. - V. 98. - P. 1007--1018.

11. Nudmamud-Thanoi S., Piyabhan P., Harte M. K. et al. Deficits of neuronal glutamatergic markers in the caudate nucleus in schizophrenia // J. Neural. Transm. Suppl. - 2007. - P. 281--285.

12. O'Kane R.L., Martinez-Lopez I., DeJoseph M.R. et al. Na(+)-dependent glutamate transporters (EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. A mechanism for glutamate removal // J. Biol. Chem. - 1999. - V. 274. - P. 31891--31895.

13. Schniepp R., Kohler K., Ladewig T. et al. Retinal colocalization and in vitro interaction of the glutamate transporter EAAT3 and the serum- and glucocorticoid-inducible kinase SGK1 // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2004. - V. 45, № 5. - P. 1442--1449.

14. Schwab S.G., Knapp M., Sklar P. et al. Evidence for association of DNA sequence variants in the phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase IIalpha gene (PIP5K2A) with schizophrenia // Mol. Psychiatry. - 2006. - V. 11. - P. 837--846.

15. van Landeghem F.K., Weiss T., von Deimling A. Expression of PACAP and glutamate transporter proteins in satellite oligodendrocytes of the human CNS // Regul. Pept. - 2007. - V. 142. - P. 52--59.

Размещено на Allbest.ru