Молекулярно-генетический профиль дофаминовой нейромедиаторной системы у наркологических больных

Размещено на http://www.allbest.ru/

Молекулярно-генетический профиль дофаминовой нейромедиаторной системы у наркологических больных

Кибитов А.О.*^* Кибитов Александр Олегович, к.м.н., рук. лаборатории молекулярной генетики тел. 8(499)2410465, e-mail: druggen@mail.ru

Национальный научный центр наркологии МЗСР РФ

119002, Москва, М. Могильцевский пер., 3

Введение

С точки зрения медицинской генетики [3], зависимость от психоактивных веществ (ПАВ) является частью обширного класса болезней с наследственным предрасположением. Для них характерны прогредиентность течения, ремиттирующий характер и нарастание тяжести симптоматики с возрастом больного. По результатам семейных и близнецовых исследований, вклад наследственных факторов в развитие болезней зависимости от ПАВ составляет, по разным оценкам, 40--70 % [8, 14, 17].

Нейрохимической основой зависимости от ПАВ считается хроническая дисфункция дофаминовой (ДА) нейротрансмиттерной системы мозга, в первую очередь затрагивающая систему подкрепления [5, 7, 9]. С биологической точки зрения, состояние врожденной предрасположенности к наркологическим заболеваниям можно описать как комплекс генетически детерминированных особенностей нейрохимических (в первую очередь дофаминергических) систем мозга, благодаря которым при злоупотреблении ПАВ состояние зависимости развивается быстро и протекает злокачественно.

С развитием молекулярной генетики сложных мультифакториальных заболеваний полигенной природы, в том числе и болезней зависимости от ПАВ, становится понятно, что риск развития зависимости от ПАВ является следствием влияния большого числа генов, влияющих на ряд функций мозга и действующих аддитивно, а каждый из генов вносит небольшую долю в суммарный риск [17]. Большая часть генов-кандидатов, влияющих на формирование зависимости, были первоначально предложены в результате экспериментальных исследований на животных.

Отправной точкой исследования послужило предположение, что врожденная предрасположенность к развитию зависимости от ПАВ проявляется на уровне генома в виде определенных структурных, а следовательно, и функциональных, особенностей генов, контролирующих дофаминовую нейромедиацию. Совокупность таких вариантов можно описать как специфический молекулярно-генетический профиль (генопрофиль) по генам ДА системы у индивидуумов с выраженной наследственной предрасположенностью.

Мы предположили, что в случае реального существования связи определенных вариантов полиморфных локусов генов, входящих в генопрофиль, с генетической предрасположенностью к болезням зависимости, будет наблюдаться статистически достоверное накопление либо элиминация определенных аллелей, генотипов и гаплотипов (элементов генопрофиля) у больных наркологическими заболеваниями по сравнению с контрольной группой здоровых. В этом случае возможно построение верифицированного молекулярно-генетического профиля болезней зависимости от ПАВ с использованием выявленных элементов. Если какие-либо элементы являются патогенетическими маркерами предрасположенности, то сдвиги частот их встречаемости, вероятно, окажутся близкими для больных, страдающих зависимостью от разных видов ПАВ, что подтвердит единство этиопатогенеза болезней зависимости [1, 4].

Результаты ассоциативных исследований связи полиморфизма генов ДА системы и болезней зависимости от ПАВ привели к противоречивым результатам [5, 6, 10, 11, 12, 13, 15, 16]. Важными ограничениями и причинами расхождения данных считаются недостаточный объем выборок, их стратификация (расслоение) по этническому и половому признакам, клиническая гетерогенность выборок. Алкоголизм и наркомания в таких исследованиях рассматриваются часто отдельно. В нашем исследовании мы попытались преодолеть эти ограничения путем набора выборки достаточно большого объема, тщательного контроля этнической однородности, ограничения исследования лицами славянской этнической принадлежности (русскими), ограничения участников исследования мужским полом, включения в исследование только стационарных наркологических больных, параллельного сравнительного анализа больных алкоголизмом и героиновой наркоманией.

Цель - построение и сравнительный анализ молекулярно-генетического профиля ДА системы у больных алкоголизмом и героиновой наркоманией, верификация построения профиля и оценка диагностической эффективности генопрофиля и его элементов.

Материалы и методы. Проведено открытое, сравнительное, ретроспективное, ассоциативное исследование (типа "случай-контроль") с участием мужчин, этнических русских, не родственных между собой. Стационарные пациенты клиники ННЦ наркологии составили 2 диагностические когорты: 1) "алкоголизм" (448 пациентов с диагнозом "Зависимость от алкоголя" II--III стадии (F10.2 по МКБ-10), средний возраст 37,5±6,2 года; 2) "опийная (героиновая) наркомания (255 пациентов с диагнозом "Зависимость от опиатов (героин) (F11.2 по МКБ-10), средний возраст 27,3±4,4 года. Пациенты с верифицированной психопатологией (шизофрения, эндогенные депрессивные расстройства, суицидальные попытки) исключались из исследования. Контрольную группу составил 281 доброволец мужского пола (средний возраст 38,5±7,2 года), не имеющие диагностических признаков наркологической патологии.

Контроль этнической гомогенности проводили в процессе опроса и по результатам анализа фамилий, имен и отчеств участников. Набор участников производился в 2000--2009 гг. Все они были проинформированы о характере научного исследования и дали информированное согласие на забор крови для генотипирования. Исследование одобрено Локальным этическим комитетом ННЦ наркологии. Большинство участников исследования - жители Москвы и Московской области.

Построение генопрофиля базируется на знаниях о принципах работы ДА системы и ее роли в патогенезе зависимости от ПАВ и предполагает включение таких элементов, нарушения в работе которых являются критическими как для работы системы в целом, так и для развития собственно заболевания. В нашем исследовании мы включили в генопрофиль 6 основных генов, контролирующих центральную дофаминовую нейромедиацию на нескольких уровнях или звеньях (табл. 1).

Таблица 1

Элементы генопрофиля ДА системы и их функциональность

Для генотипирования были выбраны 10 полиморфных локусов 6 ключевых генов, кодирующих основные элементы ДА системы (табл. 1). Образцы ДНК, полученные из венозной крови путем фенол-хлороформной экстракции, генотипировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом, как описано нами ранее. По результатам генотипирования рассчитаны абсолютные частоты (число индивиддумов-носителей) и относительные частоты (процентная доля встречаемости) элементов генопрофиля: аллелей и генотипов по изученным полиморфным локусам для всех генов, а также для гаплотипов (гены DRD2, DRD4, DAT1 и DBH). Далее был проведен сравнительный анализ частот встречаемости элементов между каждой диагностической когортой и контрольной группой, а также между двумя диагностическими когортами.

Статистическая обработка. Для выявления различий частот аллелей использовалась статистика 2 с доверительным интервалом 5 % для таблицы 2х 2. При анализе частот генотипов и гаплотипов применяли метод иерархической агломеративной кластеризации частот, позволяющий выделить в итоге 2 группы генотипов с максимально сходными частотами (кластеры генотипов) для последующего анализа с помощью статистика 2 для таблицы 2х 2. Для коррекции множественных сравнений, возникающих в процессе кластеризации, использовали инвертированный вид поправки Бонферрони путем умножения значений р, полученных при сравнении двух итоговых кластеров, на n (число сравнений). Различия признавались достоверными при итоговых значениях р<0,05. Относительный риск (отношение шансов, OR, odds ratio) оценивали как вероятность попадания носителя того или иного аллеля/генотипа/гаплотипа в одну из групп сравнения с 95 % доверительным интервалом (CI 95 %).

Результаты и их обсуждение. Ген DRD2 (рис. 1). В когорте больных алкоголизмом по сравнению с контрольной группой выявлено достоверное повышение частот Taq генотипа (A1/A2) (31,3 и 22,32 %; р=0,027; OR=1,58 [CI 95 % 1,09; 2,28]) и гаплотипа (A1/A2; N1/N1) (19,37 и 10,73 %, р=0,009; OR=1,95 [CI 95 % 1,22; 3,14]). В когорте больных героиновой наркоманией по сравнению с контрольной группой выявлено достоверное повышение частоты Taq генотипа (A1/A2) - (34,14 и 22,32 %, р=0,008; OR=1,8 [CI 95 % 1,2; 2,69]) и гаплотипа (А 1/А 2; N1/N1)- (19,67 и 10,73 %, р=0,004; OR=1,93 [CI 95 % 1,28; 2,91]). Диагностические когорты не различались между собой.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Универсальные генетические маркеры риска развития зависимости от ПАВ

Ген DRD4. В когорте больных алкоголизмом по сравнению с контрольной группой выявлено достоверное повышение частоты кластера аллелей V48 (А 4+А 7+А 8) (87 и 82 %, р=0,033; OR=1,46 [CI 95 % 1,09; 1,95] и снижение частоты кластера генотипов V48 (2/2+2/4+3/4) (15 и 23 %, р=0,024; OR=1,68 [CI 95 % 1,14; 2,46]). В когорте больных героиновой наркоманией по сравнению с контрольной группой повышены частоты: кластера аллелей V48 (А 2+А 4+А 7) (94 и 89 %, р=0,006; OR=2,0 [CI 95 % 1,27; 3,15]), аллеля V120 S (19,8 и 14 %, р=0,02; OR=1,52 [CI 95 % 1,07; 2,17]), генотипа V120 (SS) (6,7 и 2,4 %, р=0,057 тренд на границе значимости), при этом снижена частота кластера генотипов V48 (3/4+4/8) (5 и 11 %, р=0,016; OR=2,55 [CI 95 % 1,28; 5,06]).

В когорте больных алкоголизмом по сравнению с когортой больных наркоманией повышены частоты: кластера аллелей V48 (А 5+А 6+А 8) (5 и 2 %, р=0,02; OR=2,37 [CI 95 % 1,23; 4,57], аллеля V120 L (86,41 и 80,15 %, р=0,01; OR=1,57 [CI 95 % 1,11; 2,24]), кластера гаплотипов (V48+V120) (2/7; SL+3/4; LL+4/7; LL+4/8; LL) (26 и 15 %, р=0,006; OR=2,11 [CI 95 % 1,3; 3,42]). При аналогичном сравнении снижены частоты: генотипа V48 (2/4) (10 и 16 %, р=0,029; OR=1,76 [CI 95 % 1,12; 2,76]) и генотипа V120 (SS)(7 и 1 %, р=0,003; OR=5,58 [CI 95 % 1,7; 18,35]).

Ген DAT. В когорте больных алкоголизмом по сравнению с контрольной группой выявлены слабые тенденции к повышению ряда частот: V40 аллеля А 9 (23,33 и 19,27 %, р=0,09), генотипа 9/10 (31,5 и 23,96 %, р=0,088), гаплотипа V40+Msp (9/10; СТ) (8,93 и 4,61 %, р=0,088). Когорта больных наркоманией не отличалась от контрольной группы. Диагностические когорты не различались между собой.

Ген DBH. Когорта больных алкоголизмом не отличалась от контрольной группы. В когорте больных героиновой наркоманией по сравнению с контрольной группой выявлено достоверное повышение частоты аллеля -1021 С (83,13 и 74,71 %, p=0,008, OR=1,66 [CI 95 % 1,14; 2,42] и снижение частоты генотипа -1021 (ТТ) (3,1 и 10,9 %, р=0,01, OR=3,55 [CI 95 % 1,34; 9,37]. Выявлено повышение частоты аллеля (-1021) С (83,13 и 72,70 %, р=0,0005, OR=1,84 [CI 95 % 1,3; 2,61] и генотипа (-1021) (СС) (69,38 и 55,34 %, р=0,008, OR=1,82 [CI95 % 1,2; 2,75]) среди больных наркоманией по сравнению с больными алкоголизмом.

Ген COMT. В когорте больных алкоголизмом по сравнению с контрольной группой отмечается незначительное повышение частоты генотипа LL (32,15 и 25,46 %), не достигающее статистической значимости (р=0,09). Когорта больных наркоманией не отличалась от контрольной группы. Диагностические когорты не различались между собой.

Ген TH. (рис. 1). В когорте больных алкоголизмом по сравнению с контрольной группой повышена частота кластера генотипов (6/6+7/9+8/10) - (20 и 12 %, р=0,009, OR=1,88 [CI95 % 1,23; 2,89]). В когорте больных героиновой наркоманией по сравнению с контрольной повышена частота кластера генотипов (6/6+7/9+8/10) - (22 и 12 %, р=0,005, OR=2,08 [CI95 % 1,31; 3,32]).

Результаты исследования позволили выявить отличия когорт пациентов от контрольной группы и друг от друга по вариабельности частот элементов генопрофиля и оценить возможность использования элементов генопрофиля ДА системы как маркеров генетического риска развития зависимости от ПАВ (табл. 2).

Наследственная предрасположенность является латентно существующим в популяции генетическим феноменом "спектрального" характера и не может считаться абсолютно детерминирующим фактором, однозначно приводящим к манифестации заболевания. Следовательно, в любой группе контрольных индивидуумов существует доля субъектов с предрасположенностью разной степени выраженности. Как следствие, в рамках нашей гипотезы эти субъекты являются носителями генопрофиля зависимости от ПАВ. Присутствие таких носителей в любой группе здоровых лиц снижает достоверность различий в частотах встречаемости элементов генопрофиля, а в случае незначительных различий частот нивелирует эти различия.

Таблица 2

Специфичность элементов генопрофиля в качестве маркеров для оценки индивидуального генетического риска развития наркологических заболеваний

Примечание. ? - Высокая специфичность маркера; _ - средняя специфичность маркера.

С другой стороны, обнаружение достоверных различий между группами пациентов и контрольной группой говорит о реально существующем сдвиге частот, фактически более значительном, чем выявляемые номинальные значения. С этой точки зрения, особую ценность представляет сравнение частот элементов генопрофилей зависимости между группами пациентов.

В нашем исследовании выявлена устойчивая ассоциация полиморфизма гена DRD2 с наркологическими заболеваниями: в обеих диагностических когортах обнаружено достоверное повышение частот генотипа А 1/А 2 и гаплотипа (А 1/А 2; N1/N1), а сравнение когорт алкоголизма и героиновой наркомании между собой не обнаружило различий, что может служить подтверждением генетического единства зависимости от разных видов ПАВ [1, 4]. Вероятно, полиморфный локус NcO, находящейся в кодирующей области гена, оказывает воздействие на структуру DRD2 рецептора, однако это воздействие проявляет себя только при наличии определенного генотипа по локусу TaqI. Последний лежит вне кодирующей области и может оказывать свое воздействие как регулятор транскрипции гена.

Подобный результат получен и в отношении полиморфного локуса гена тирозингидроксилазы (ТН), что может служить основанием для использования локуса HUMTH01-VNTR гена тирозингидроксилазы как патогенетического маркера наследственной предрасположенности к зависимости как от алкоголя, так и от опиатов. Возможное влияние вариантов локуса на регуляцию транскрипции гена ТН [16] объясняет возможный механизм формирования состояния биологической предрасположенности к зависимости от ПАВ в рамках дофаминовой гипотезы патогенеза зависимости.

Показательно, что продукты этих генов играют наиболее значимые роли в организации и контроле функции всей ДА системы. Описан механизм регуляции уровня экспрессии гена тирозингидроксилазы по приципу обратной связи, где системным индикатором выступает именно DRD2 рецептор [18]. Вероятно, что уровень генетического риска развития болезней зависимости от ПАВ связан со специфическим, врожденным уровнем регуляции работы ДА системы на уровне механизмов, контролирующих генную экспрессию.

Таким образом, построенный нами на основании теоретических предпосылок генопрофиль болезней зависимости оказался эффективным инструментом молекулярно-генетической диагностики генетического риска зависимости от ПАВ, все элементы профиля оказались связаны с болезнями зависимости, хотя и в разной степени. Ряд элементов генопрофиля универсальны как для алкоголизма, так и для наркомании, отдельные элементы сообщают специфичность оценке риска. Этот факт делает возможным успешное применение генопрофиля в качестве диагностической системы для оценки как общего, так и специфического (отдельно алкоголизма и героиновой наркомании) риска. Дальнейшие исследования помогут уточнить роль каждого из элементов генопрофиля в формировании специфических вариантов клинического фенотипа зависимости от ПАВ.

Литература

1. Анохина И.П., Веретинская А.Г., Васильева Г.Н., Овчинников И.В. О единстве биологических механизмов индивидуальной предрасположенности к злоупотреблению различными психоактивными веществами // Физиология человека. - 2000. - Т. 26, № 6. - С. 76--83.

2. Анохина И.П., Коган Б.М. Нарушения различных звеньев регуляции катехоламиновой регуляции при алкоголизме // Вопросы наркологии. - 1988. - № 3. - С. 3--6.

3. Бочков Н.П. Клиническая генетика. - М. : Гэотар-Мед, 2002. - С. 202--226.

4. Кибитов А.О., Чупрова Н.А. Генетическое единство алкоголизма и опийной наркомании: показатели семейной отягощенности // Вопросы наркологии. - 2012. - № 4. - С. 29--42.

5. Berggren U., Fahlke C., Aronsson E., Karanti A., Eriksson M., Blennow K., Thelle D., Zetterberg H., Balldin J. The taqI DRD2 A1 allele is associated with alcohol-dependence although its effect size is small // Alcohol Alcohol. - 2006. - Sep.-Oct. - № 41 (5). - Р. 479--485.

6. Cao L., Li T., Liu X. Association study of heroin dependence and catechol-O-methyltransferase gene // Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. - 2003. - Apr. - № 20 (2). - Р. 127--130.

7. Comings D. E., Blum K. Reward deficiency syndrome: genetic aspects of behavioral disorders // Prog. Brain. Res. - 2000. - № 126. - Р. 325--341.

8. Crabbe J. C., McSwigan J. D., Belknap J. K. The role of genetics in sustance abuse. Biological, psychological and environmental factors / Ed. S. M. Calisio, S. A. Maisto. - N. Y. : Plenum Press, 1985. - P. 13--64.

9. Dreher J. C., Kohn P., Kolachana B., Weinberger D. R., Berman K. F. Variation in dopamine genes influences responsivity of the human reward system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2009. - Jan. 13. - № 106 (2). - Р. 617--622.

10. D'Souza U. M., Russ C., Tahir E., Mill J., McGuffin P., Asherson P. J., Craig I. W. Functional effects of a tandem duplication polymorphism in the 5'flanking region of the DRD4 gene // Biol. Psychiatry. - 2004. - Nov. 1. - № 56 (9). - Р. 691--697.

11. Foley P. F., Loh E. W., Innes D. J., Williams S. M., Tannenberg A. E., Harper C. G., Dodd P. R. Association studies of neurotransmitter gene polymorphisms in alcoholic Caucasians // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2004. - Oct. - № 1025. - Р. 39--46.

12. Franke P., Nцthen M. M., Wang T., Knapp M., Lichtermann D., Neidt H., Sander T., Propping P., Maier W. DRD4 exon III VNTR polymorphism-susceptibility factor for heroin dependence? Results of a case-control and a family-based association approach // Mol. Psychiatry. - 2000. - Jan. - № 5 (1). - Р. 101--104.

13. Franke P., Schwab S. G., Knapp M., Gansicke M., Delmo C., Zill P., Trixler M., Lichtermann D., Hallmayer J., Wildenauer D. B., Maier W. DAT1 gene polymorphism in alcoholism: a family-based association study // Biol. Psychiatry. - 1999. - Mar. 1. - № 45 (5). - Р. 652--654.

14. Goodwin D. W. Familial alcoholism // Subst. Alcohol Actions Misuse. - 1983. - № 4. - P. 129--136.

15. Kohnke M. D., Kolb W., Kцhnke A. M., Lutz U., Schick S., Batra A. DBH(*)444G/A polymorphism of the dopamine-beta-hydroxylase gene is associated with alcoholism but not with severe alcohol withdrawal symptoms // J. Neural. Transm. ? 2006. ? Jul. ? № 113 (7). ? Р. 869--876.

16. Meloni R., Biguet N. F., Mallet J. Post-genomic era and gene discovery for psychiatric diseases: there is a new art of the trade? The example of the HUMTH01 microsatellite in the Tyrosine Hydroxylase gene // Mol. Neurobiol. ? 2002. ? Oct.-Dec. ? № 26 (2--3). ? Р. 389--403.

17. Messas G. P., Vallada Filho H. P. The role of genetics in alcohol dependence // Rev. Bras. Psiquiatr. ? 2004. ? May. ? № 26. ? Suppl 1. ? Р. 54--58.

Размещено на Allbest.ru