Особенности содержания NOх в сыворотке крови и в моче и активность NO-синтазы в глазном яблоке при экспериментальной диабетической ретинопатии

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Особенности содержания NOх в сыворотке крови и в моче и активность NO-синтазы в глазном яблоке при экспериментальной диабетической ретинопатии

В.Н. Сердюк, И.В. Савицкий, В.В. Семенко

Эндотелиальная дисфункция - неотъемлемое звено патогенеза диабетической ретинопатии. Цель работы - исследование NO-S в глазном яблоке и КОх в сыворотке крови и в моче при экспериментальном сахарном диабете 1-го типа. Полученные результаты о повышении уровня NOx в биологических жидкостях наряду со снижением гистохимической активности NO-S в глазном яблоке свидетельствуют о нарушении функции клеток эндотелия. Определение соотношения между активностью NO-синтазы в гистологических срезах глазного яблока и концентрацией NOхв крови и моче является патогенетически важным для оценки своевременности и эффективности применения донаторов оксида азота для комплексного лечения экспериментальной диабетической ретинопатии.

Ключевые слова: сахарный диабет, экспериментальная модель, диабетическая ретинопатия, эндотелиальная дисфункция, NO-S, NOх.

ОСОБЛИВОСТІ ВМІСТУ NOх У СИРОВАТЦІ КРОВІ ТА В СЕЧІ І АКТИВНІСТЬ NO-СИНТАЗИ В ОЧНОМУ ЯБЛУЦІ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІЙ ДІАБЕТИЧНІЙ РЕТИНОПАТІЇ. В. М. Сердюк, І. В. Савицький, В. В. Семенко

Ендотеліальна дисфункція - невід'ємна ланка патогенезу діабетичної ретинопатії. Мета роботи - дослідження N0-8 в очному яблуці і NOх в сироватці крові та в сечі при експериментальному цукровому діабеті 1-го типу. Отримані результати щодо підвищення рівня N0x у біологічних рідинах поряд зі зниженням гістохімічної активності N0-синтази в очному яблуці свідчать про порушення функції клітин ендотелію. Визначення співвідношення між активністю N0-синтази в гістологічних зрізах очного яблука і концентрацією N0х в крові та сечі є патогенетично важливим для оцінки своєчасності та ефективності застосування донаторів оксиду азоту для комплексного лікування експериментальної діабетичної ретинопатії.

Ключові слова: цукровий діабет, експериментальна модель, діабетична ретинопатія, ендотеліальна дисфункція, активність N0-8, ЫОх.

THE FEATURES OF CONTENT OF NOx IN BLOOD SERUM AND IN URINE AND NO-SYNTASE ACTIVITY IN THE EYE APPLE AT EXPERIMENTAL DIABETIC RETHYOPATHY. V. M. Serdyuk, I. V. Savytskyi, V. V. Semenko

Introduction. Increasing prevalence of diabetes in developed countries (which is 4-5 % of the total population) causes an increase in the incidence of diabetic retinopathies and, as a consequence, blindness of the population.

Goal.To study the contents of NOx in serum blood and in urine and NO-syntase activity in eye apple at experimental diabetic rethyopathy.

Materials. The study was conducted on white Wistar rats weighing 180-200 g. The animals were ranked into 2 groups: 1 group - 20 animal not exposed to any influence; 2 group - 30 animals, modeled type 1 diabetes mellitus (an alloxane model). The duration of the experiment was 30 days.

Results.Results of the study in the animals of the control group. When the NO-S activity was determined histo- chemically, a moderate activity of NO-synthase was revealed. The NOx content in blood serum is 22.45±1.04 mmol/l, in the urine the NOx content is 15.09±0.71 mmol/l. Results of the study in animals with a model of diabetes mellitus. At the end of the experiment, 8.07±0.33 mmol/L of glucose was determined in the blood of rats with a model of diabetes mellitus, which is significantly higher than in the control group (5.11±0.22 mmol/l, p<0.001). Based on the histochem- ical evaluation, we noted a weak activity of NO-S in the eyes of rats with a model of diabetes mellitus. Simultaneously, the change in the NOx content in plasma and in urine is determined. In serum the NOx content is 38.41±1.1 mmol/l, in the urine the NOx content is 25.82±2.40 mmol/l (changes compared to controls are significantly reliable, p<0.001).

Conclusions. In experimental modeling of diabetes mellitus, a decrease of NO-S activity in the eyeball tissues is observed already on the 30th day from the beginning of the experiment, that indicates a disturbance of the synthesis of the nitric oxide cycle. An increase of the level of NOx in the blood and in the urine is the result of disruption of endothelial cells functions and indicates the development of endothelial dysfunction.

Key words: diabetes mellitus, experimental model, diabetic retinopathy, endothelial dysfunction, NO-S, NOx.

По данным литературы, нарушения функций эндотелия и эластичности артерий напрямую связаны с развитием сосудистых осложнений сахарного диабета (СД) 1-го и 2-го типа [1, 2, 3]. Каждая стадия диабетической ретинопатии (ДР) связана с патологическими изменениями сосудистого звена, в нарушении нормального функционирования которого ключевую роль играет состояние его эндотелия. Одним из основных патогенетических звеньев эндотелиальной дисфункции (ЭД) является нарушение синтеза оксида азота (N0) [5]. Диабетическая ретинопатия (ДР) как причина снижения зрения и слепоты у больных является следствием не только воздействия длительной гипергликемии, но может прогрессировать и в состоянии компенсации углеводного обмена [4], что указывает на необходимость изучения ранних маркеров нарушения функции эндотелия, особенно в эксперименте, когда под влиянием гипергликемии не успели сформироваться поздние стадии ДР, а компенсация углеводного обмена не будет их «маскировать».

Общепринятым является тот факт, что нарушение синтеза N0 является маркером дисфункции эндотелия, оказывающим различного рода биорегуляторные влияния на структуру и функции сосудов, а также клеток крови. Ь-аргинин является одним из источников N0, превращаясь в цитрулин под воздействием фермента NО-синтазы (N0-8) [8, 9, 10, 11]. Сумма эндогенных нитратов и нитритов (К0х) является конечным продуктом синтеза NО и в то же время при активации нитритредуктазного пути становится донаторами оксида азота [5]. Исходя из вышесказанного, N0-8 и N0х являются важными маркерами диагностики состояния эндотелиальной функции.

Цель исследования. Исследование активности N0-8 в глазном яблоке и уровня N0х в крови у крыс при экспериментальном СД.

Материалы и методы. Исследования проведены на белых крысах линии Вистараутобредного разведения массой тела 180-200 г. Животные были ранжированы на 2 группы. 1-я группа (20 животных) были интактными (они не подвергались никакому воздействию и служили контролем), 2-я группа (30 животных) была опытной, у которых моделировали СД 3-хкратным внутрибрюшинным, с интервалом в 5 дней, введением аллоксана в дозе 7,5 мл. Инъекции аллоксана осуществляли на фоне свободного доступа животных к 5 % раствору фруктозы. Продолжительность эксперимента составила 30 суток. Экспериментальная работа была выполнена в соответствии с «Правилами выполнения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Приказом МЗ Украины № 249 от 01.03.2012 и Законом Украины № 3447-ГУ «О защите животных от жестокого обращения» (с изменениями от 15.12.2009 и от 16.10.2012). По окончании эксперимента животных выводили из опыта путём декапитации под лёгким эфирным наркозом: забирали 5 мл крови, в сыворотке которой определяли уровень глюкозы с использованием биохимического полуавтоматического анализатора «Микролаб-300» (Нидерланды) ферментативным (глюкозооксидазным) методом и содержание NOxв крови и разовой порции мочи методом восстановления нитратов до нитритов с дальнейшим диазотированием с помощью реакции Грисса и спектрофотометрическим определением нитритов [12]. Производили энуклеацию. Одно глазное яблоко замораживали в жидком азоте (-196 °С), из полученных блоков изготовляли криостатные срезы толщиной 11 мкм, на которых гистологическим методом определяли активность NO-S по методике Ллойда [13].

Оценивали цвет гранул и фона, а также сравнительную плотность распределения гранул:

- серое, серовато-желтое окрашивание мелких гранул формазана свидетельствует о следовой активности NO-S в теле клетки; фоновое окрашивание сероватое или серовато-фиолетовое также свидетельствует о следовой активности NO-S;

- серо-желтоватое окрашивание мелких и средних гранул в клетке и серовато-желтоватое окрашивание фона - слабая активность NO-S;

- желтое, желто-коричневое окрашивание мелких и средних гранул в клетках на желтоватой или песочной фоновой окраске рассматривается как умеренная активность NO-S;

- желто-коричневое или коричневое окрашивание крупных или средних гранул при желтоватой фоновой окраске свидетельствует о высокой активности NO-S.

Математико-статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью описательной статистики (M±m), межгрупповые сравнения показателей проводили с помощью критерия Стьюдента для независимых выборок. Уровень статистической значимости различий считали при р<0,05.

Результаты и их обсуждение. Результаты исследования у животных контрольной группы. При определении активности NO-S здоровых крыс гистохимическим методом выявлено следующее: эритроциты в лакунах сосудистого слоя желто-коричневые. Мелкие желто-песочные гранулы и мелкие серо-черные гранулы по краю лакуны распределены негусто. В гранулярном и ганглионарном слое фон серо-желтоватый, встречаются клетки, содержащие серые и серо-желтые гранулы в умеренном количестве. Фон сетчатой оболочки серовато-желтовато-коричневый (рис. 1). В целом, можно говорить об умеренной активности NO-S.

Содержание глюкозы в сыворотке крови, а также NOxв сыворотке крови и моче представлены в таблице.

Результаты исследования у животных с экспериментальной моделью СД. В ходе эксперимента в сыворотке крови и в моче крыс с моделью СД было обнаружено, что концентрация КОх в моче и концентрация глюкозы в крови были достоверно выше, чем в группе контроля (табл.), отличия статистически высоко значимы (р<0,001). Гистохимическая оценка активности N0-8 в тканях глазного яблока показала следующее: сосудистая оболочка характеризовалась серо-желтоватой фоновой окраской и наличием отдельных мелких серо-черных гранул по контуру сосудистых лакун. В гранулярных слоях фоновая окраска бледно-серая или серо-фиолетовая, единичные серо-желтоватые или серо-черные гранулы. В ганглионарном слое отдельные клетки с серыми или серо-черными гранулами в цитоплазме. В целом можно говорить о слабой активности N0-8 в тканях глаза крыс с моделью СД (рис. 2). диабетическая ретинопатия сосудистый

Полученные результаты показали снижение активности КО-синтазы (гистологически) на фоне повышения содержания КОх (биохимически) в биологических жидкостях. Это свидетельствует о начале развития эндокринальной дисфункции (ЭД) сосудов глазного яблока уже через 30 суток от начала эксперимента [14, 15].

По данным литературы, N0 является важным модератором метаболизма, который осуществляет регуляцию внутриклеточных и межклеточных процессов. В первую очередь это касается регуляции внутриклеточной концепции Са2+, вазодилатации, инактивации Бе2+-зависимых ферментов (рибонуклеотидредуктазы, аконитазы (8еи-аконитатгидратаза катализирует обратимую изомеризацию цитрата в изоцитрат через образование промежуточного соединения - трикарбоновой кислоты цисаконитата) и др.), экспрессии генов, участия в межклеточной сигнализации в нейронах мозга (где N0 выступает в роли ретроградного мессенджера), препятствию агрегации тромбоцитов путем активации их растворимой гуанилатциклазы, участия в регуляции NАDPH-оксидазной системы и модуляции имунного ответа. При нарушении продукции оксида азота проявляется его цитотоксичность [6, 7]. Повышение концентрации N0х при снижении активности N0-синтазы подтверждает возможность переходного этапа от N0-синтазного до нитритредуктазного пути синтеза N0 при ДР. Так как активность N0-синтазы еще не полностью заблокирована, то на этом этапе (непролиферативной ДР) метаболическая коррекция ДР будет весьма эффективной. На сегодняшний день известны два пути синтеза оксида азота - N0-синтазный и нитритредуктазный. Эндотелиальные клетки способны синтезировать N0 из аргинина с помощью N0-синтаз [8, 9, 10]. N0-синтазный механизм образования оксида азота - это его синтез в присутствии кислорода [16], так как молекулярный О2 используется как для синтеза N0, так и для Ь-цитрулина [17]. В условиях дефицита кислорода начинает работу нитритредуктазный механизм синтеза N0 при участии дезоксиформгемсодержащих белков гемоглобина, миоглобина, цитохромоксидазы и цитохрома Р-450 [5, 18, 19].

На наш взгляд, соотношение активности N0- тазы и уровня суммарных нитратов и нитритов в биологических жидкостях можно расценивать как диагностический маркер степени гипоксии. Дефицит О2 угнетает N0-синтазный путь и является стимулятором нитритредуктазного пути синтеза N0. Вышеуказанное соотношение позволяет определить то, какой из путей синтеза N0 задействован на данном этапе прогрессирования ЭД. Начальные гипоксические изменения структур глаза при экспериментальном СД 1-го типа были зафиксированы нами ранее. При гистологическом исследовании нами были определены спазм сосудов, отек эндотелиоцитов и отсутствие лакун, что позволяет нам исключить возможность снижения активности КО-синтазы по механизму обратной связи из-за переизбытка выработки оксида азота [20].

Рис. 1. Белочная оболочка глаза здоровой крысы. Гистохимическое определение активности N0-8. Умеренная активность. Окр.: по Ллойду. Увеличение: х 100

Рис. 2. Белочная оболочка глаза крысы с моделью сахарного диабета. Гистохимическое определение активности N0-8. Слабая активность. Окр.: по Ллойду. Увеличение: х 100

Таблица 1. Содержание глюкозы в сыворотке крови и NOxв сыворотке крови и в моче животных (M±m)

Примечание:

КОх - сумма эндогенных нитратов и нитритов;

р - достоверность различий по сравнению с контролем

Патогенетически важным с точки зрения диагностики стадии ДР является определение соотношения между активностью КО-синтазы и концентрацией КОх. Это позволяет определить эффективность применения метаболической коррекции ДР в эксперименте. Клинически введение донаторов N0 может быть эффективным при его синтезе по МО-синтазно-му пути и будет способствовать коррекции ЭД. В то же время при полном переходе на нитритредуктазный путь применение донаторов N0 не даст прогнозируемого терапевтического эффекта.

По собственным полученным данным, повышение содержания КОх является результатом активации нитритредуктазного механизма, о чем свидетельствует достоверное повышение концентрации нитратов и нитритов не только в крови, но и в моче на фоне ранее выявленных нами структурных нарушений эндотелиоцитов (набухание) [20].

Мы определяли КОх в биологических жидкостях биохимическим методом, а активность КО-синтазы - гистологическим. Выбор гистологического метода идентификации (в тканях среза белочной оболочки глаза), а не биохимического метода оценки активности КО-синтазы в данном случае является обоснованным, так как мы исследуем признаки ДР. Морфологический метод является более информативным из-за своей селективности (были выбраны сосуды глаза как место определения активности синтазы). Биохимическое определение энзима дало бы информацию о его содержании в организме, и не была бы представлена картина состояния его активности в структурах глаза.

Изменения, полученные нами при определении активности КО-синтазыгистологически, как и при биохимическом определении КОх в крови и моче имеют важное клиническое значение, так как являются диагностическим методом определения механизма синтеза оксида азота в экспериментальной модели СД 1-го типа. Полученные результаты служат основой для дальнейшего патогенетического обоснования применения донаторов КО в коррекции ЭД при СД.

Выводы

При экспериментальном моделировании СД 1-го типа уже на 30-е сутки с момента начала опыта наблюдается снижение активности NO-синтазы в тканях глазного яблока, что свидетельствует о нарушении синтеза цикла оксида азота. Повышение уровня NOxв сыворотке крови и в моче является результатом нарушения функций клеток эндотелия и свидетельствует оразвившейся ЭД.

Литература

1. Балаболкин М. И. Роль гликирования белков, окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений при сахарном диабете / М. И. Балаболкин // Сахарный диабет. - 2002. - № 4. - C. 8-16.

2. Кособян Е. П. Вазомоторная функция эндотелия и эластичность артериальной стенки у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа на разных стадиях диабетической ретинопатии / Е. П. Кособян, И. Я. Ярек-Мартынова, А. С. Парфёнов, М. В. Шестакова // Проблемы эндокринологии. - 2012. - № 4. С.22-26.

3. BonettiP O.EndothelialDysfunction: A Marker of Atherosclerotic Risk / P. O. Bonetti, L. O. Lerman, A. Lerman // Arterioscler Thromb Vascular Bio. - 2003. - Vol. 23. -P. 168-175.

4. Воробьева И. В. Роль дисфункции эндотелия в патогенезе диабетической ретинопатии у больных сахарным диабетом 2 типа. Обзор / И. В. Воробьева, Д. Н. Гигинеишвили // Офтальмология. - 2012. Т 9, № 3. - С. 9-12.

5. Реутов В. П. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих / В. П. Реутов, Е. Г. Сорокина, В. Е. Охотин, Н. С. Косицын. - М.: Наука, 1997. - 156 с.

6. Белушкина Н. Н. Ингибирование агрегации тромбоцитов человека новым классом активаторов гуанилатциклазы, генерирующих оксид азота / Н. Н. Белушкина, Н. Б. Григорьев, И. С. Северина // Биохимия. - 1994. - Т 59, № 11. - С. 1689-1697.

7. Bastian N. R. Induction of iron-derived EPR signals in murine cancers by nitric oxide / N. R. Bastian, C. Y. Yim, J. B. Jr. Hibbs, W. E. Samlowski // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269, № 7. - P. 5127-5131.

8. Марков Х. М. Патогенетические механизмы первичной артериальной гипертензии у детей и подростков / Х. М. Марков // Вестник РАМН. - 2001. № 2. - С.46-48.

9. Марков Х. М. Молекулярные механизмы дисфункции сосудистого эндотелия / Х. М. Марков // Кардиология. - 2005. - № 12. - С. 62-67.

10. Gerova M. Nitric oxide compromised hypertension: facts and enigmas / M. Gerova// Physiol. Res.- 2000. Vol. 49. - P. 27-35.

11. Попова А. А. Эндотелиальная дисфункция и механизмы ее формирования / А. А. Попова, Е. Н. Березикова, С. Д. Маянская, Н. Ф. Яковлева // Сибирское медицинское обозрение. - 2010. - № 4. С. 7-11.

12. Комаревцева И. А. Уровень оксида азота в тканях, сыворотке крови, мононуклеарных и мезенхимальных стволовых клетках / И. А. Комаревцева, Е. А. Орлова, М. В. Тарасова [и др.] // Український журнал клінічної та лабораторної медицини. - 2009. - Т. 4, № 4 - С. 133-137.

13. Ллойда З.Гистохимия ферментов (лабораторные методы) / З. Ллойда, Р. Госсрау, Т. Шиблер. - М.: Мир, 1982. - 272 с.

14. Пархоменко А. Н. Клинико-прогностическое значение полиморфизма гена эндотелиальной no-синтетазы у больных с острыми коронарными синдромами / А. Н. Пархоменко, Я. М. Лутай,

15. О. И. Иркин [и др.] // Медицина неотложных состояний - 2014. - № 3 (58). - С. 45-53.

16. Савицкий И. В. Динамика эндотелиальной дисфункции под воздействием нитратной загрузки / И. В. Савицкий, Т. В. Горбач, И. В. Мястковская [и др.] // Journal of Education, Health and Sport. - 2016. - Т 6, № 2. - C. 337-348.

17. Hammer D. NMDA receptors increase OH radicals in vivo by using nitric oxide syntase and protein kinase C / D. Hammer, W. D. Parker, J. P. Bennet // Neuro Rep. - 1993.- Vol. 5, № 2. - P. 72-74.

18. Schmidt H. W The role of nitric oxide in physiology and pathophysiology / H. W. Schmidt, H. Hofmann, P. Ogilvie // B. Heidelberg: Springer., 1995. - P. 75-86.

19. Реутов В. П. Физиологическая роль цикла окиси азота в организме человека и животных / В. П. Реутов, Л. П. Каюшин, Е. Г. Сорокина // Физиология человека. - 1994. - Т. 20, № 3. - С. 165-174.

20. Реутов В. П. Компенсаторно-приспособительные механизмы при нитритной гипоксии у крыс / В. П. Реутов, Е. Г. Сорокина, В. Г. Пинелис [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1993. - № 11. - С. 506-508.

21. Семенко В. В. Розробка експериментальної алоксанової моделі цукрового діабету / В. В. Семенко, В. М. Сердюк, І. В. Савицький // Міжнародний ендокринологічний журнал. - 2017. - Т. 13., № 4. - С. 34-39.

Размещено на Allbest.ru