Молекулярные мишени лекарственных препаратов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ (ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России)

По направлению подготовки «Промышленная фармация»

Кафедра: Фармакогнозии

Контрольная работа

По дисциплине Медико-фармацевтические исследования и управление жизненным циклом лекарственных средств на тему:

“Первый этап жизненного цикла лекарственного средства: поиск мишени, виды мишеней для ЛС, компьютерное конструирование и виртуальный скрининг молекулы-кандидата (поиск прототипа)”

Выполнил учащийся:

Магистрант 1ой группы заочного отделения

Рязань, 2020 год

Оглавление

1. Сигналы для поиска новых лекарственных препаратов

2. Молекулярные мишени лекарственных препаратов

3. Сетевая фармакология

4. Скрининг биологической активности

5. Компьютерное конструирование и виртуальный скрининг

6. Поиск и конструирование лигандов, действующих на конкретную молекулярную мишень

7. Поиск активных лигандов путем экспериментального скрининга

8. Дизайн веществ на основе структуры макромолекулы-мишени

9. Дизайн веществ на основе структуры лигандов

Список используемой литературы

1. Сигналы для поиска новых лекарственных препаратов

В настоящее время поиск новых фармакологических веществ тесно связан с понятием молекулярной мишени (target). Под «мишенью» подразумевают «биологическую (макро)молекулу или надмолекулярную систему, участвующую в развитии заболевания или других (желательных или нежелательных) изменениях состояния организма, с которой связывается и взаимодействует физиологически активное вещество - лиганд. В качестве биомишеней могут выступать белки, нуклеиновые кислоты, липиды и др.». Классический процесс поиска новых фармакологических веществ можно представить схематически как совокупность экспериментальных и теоретических процедур (Рис. 1)

Рис. 1. Классический путь поиска новых фармакологических веществ

Вначале определяют заболевание, для которого предполагается искать потенциальные терапевтические средства, и возможные фармакологические мишени, воздействие на которые может привести к нормализации патологического процесса. Далее разрабатывают методы экспериментального тестирования биологической активности in vitro. Если связанные с заболеванием молекулярные мишени неизвестны, необходимо создать фармакологические модели для тестирования веществ на экспериментальных животных или на изолированных органах/тканях in vivo. Осуществляется синтез соединений, сходных по структуре с веществами, для которых изучаемая биологическая активность уже была установлена, либо с их возможными аналогами (например, ингибиторы ферментов синтезируют по аналогии со структурой субстратов; агонисты и антагонисты рецепторов - по аналогии со структурой эндогенных лигандов и т.п.). В случае, если дизайн веществ-аналогов невозможен, осуществляется случайный скрининг химических соединений, принадлежащих к различным химическим классам, что создает базу для последующей оптимизации структуры и свойств фармакологических веществ.

2. Молекулярные мишени лекарственных препаратов

Согласно существующим оценкам, число белков человека, являющихся молекулярными мишенями разрешенных к медицинскому применению лекарств, составляет порядка 700. Однако, в геноме человека имеется около 20 тысяч генов, что с учетом альтернативного сплайсинга и посттрансляционных модификаций позволяет оценить число потенциальных фармакологических мишеней, как превышающее 2 млн. Помимо этого, фармакологическими мишенями являются белки бактерий, вирусов и других микроорганизмов. Одним из дополнительных механизмов фармакологической модуляции биологических функций является ингибирование белок-белковых взаимодействий, что, учитывая огромное число (комбинаторику) возможных попарных сочетаний белков, многократно увеличивает количество потенциальных мишеней. Кроме того, фармакологическими мишенями являются и другие биологические молекулы, в частности, ДНК и РНК, что также вносит существенный вклад в данную оценку. Одним словом, мы имеем дело с колоссальным количеством потенциальных фармакологических мишеней, и привести более-менее обоснованные данные относительно их числа в настоящее время не представляется возможным. Можно, однако, подсчитать количества фармакологических мишеней, валидность которых для терапии конкретного заболевания подтверждена с различной степенью достоверности. Так, например, в постоянно обновляемой коммерчески доступной базе данных Clarivate Analytics Integrity используются следующие категории мишеней: (Validated Conditions) - мишень, ассоциированная с механизмом действия одного или нескольких фармакологических веществ, находящихся в стадии активной разработки на доклинических или клинических этапах исследований или уже зарегистрированных или разрешенных к медицинскому применению для лечения рассматриваемого заболевания. C (Candidate Conditions) - мишень, ассоциированная с механизмом действия одного или нескольких фармакологических веществ, находившаяся ранее в стадии активной разработки на доклинических или клинических этапах исследований, однако в настоящее время не разрабатываемая с целью лечения рассматриваемого заболевания. E (Exploratory Conditions) - мишень, ассоциированная с механизмом действия одного или нескольких фармакологических веществ, находящихся на стадии биологических испытаний с целью лечения рассматриваемого заболевания. На 2019 г. в базе данных Integrity содержалось 2558, 4209 и 6073 мишеней, относящихся к категориям V, C и E, соответственно. 2283 мишени категории V относятся к типу «Белок» (Protein), а 275 - к типу «Ген» (Gene). 3443 мишени категории C относятся к типу «Белок», а 766 - к типу «Ген». 4727 мишени категории E относятся к типу «Белок», а 1346 - к типу «Ген». На рис. 2 представлены данные по числу различных категорий мишеней в 2018-2019 г.г. (все числа указаны на 1 января конкретного года). Приведенные на рисунке данные указывают на интенсивность проведения исследований в этой области, что приводит к постоянному росту числа мишеней всех трех категорий. В то же время, видно, что темпы роста мишеней категории «Validated» заметно ниже по сравнению с мишенями категорий «Candidate» и «Exploratory». Это свидетельствует о том, что возникающие на ранних этапах работы гипотезы о перспективности тех или иных мишеней далеко не всегда подтверждаются в последующих доклинических и клинических исследованиях

Рис. 2. Рост числа различных категорий мишеней в 2008-2019 г.г. Темная заливка - Validated; градиентная заливка - Candidate; штриховая заливка - Exploratory

Не все потенциальные мишени, однако, имеют одинаковые шансы быть использованными для разработки лекарственных препаратов. Для оценки возможности разработки фармакологических веществ, действующих на конкретную молекулярную мишень, предложен специальный термин «druggability», характеризующий «пригодность» мишени для поиска или конструирования действующих на него лигандов. «Druggability» - это пригодность биомишени для разработки лекарства - существование или возможность создания химических соединений, обладающих сродством к данной биомишени и способных произвести в результате связывания с ней благоприятный терапевтический эффект». В соответствии с данным определением, необходимо одновременное выполнение двух условий. Первое условие связано с наличием в структуре макромолекулы-мишени сайтов, с которыми могут специфически связываться какие-либо лиганды, что позволяет разрабатывать методы для предсказания «druggability» конкретных мишеней на основе анализа особенностей ее пространственной структуры. Второе условие выходит за рамки только лишь наличия структурной комплементарности определенных участков макромолекулы-мишени и ее лиганда: необходимо, чтобы связавшееся с мишенью фармакологическое вещество определенным образом модулировало функцию мишени: очевидно, что эффекты ингибиторов и активаторов ферментов, агонистов и антагонистов рецепторов существенно отличаются. Более того, для проявления определенного фармакотерапевтического эффекта на уровне организма нужно, чтобы воздействие на мишень не привело к существенному изменению функционирования регуляторной сигнальной сети, одним из элементов которой является данная мишень. Такого рода изменения возможны за счет наличия в регуляторных сигнальных сетях обратных связей, приводящих к активации альтернативных путей передачи сигнала, либо даже благодаря перестройке конфигурации регуляторной сети в целом, что обеспечивает устойчивость ключевых биологических процессов. Таким образом, при оценке «druggability» конкретной мишени и выявлении наиболее перспективных мишеней для терапии определенных заболеваний следует использовать подходы так называемой «сетевой фармакологии».

3. Сетевая фармакология

В XX веке разработка новых лекарств в значительной мере была основана на концепции «магической пули», в рамках которой задачей исследователей было создание фармакологических веществ, избирательное действие которых на конкретные фармакологические мишени приводило к нормализации патологических процессов. В настоящее время установлено, что большинство фармакологических веществ взаимодействует с несколькими или даже со многими молекулярными мишенями в организме, что в случае «желательных» (on-target) мишеней, может приводить к аддитивным/синергетическим фармакотерапевтическим эффектам, а в случае «нежелательных» (off-target, antitarget) мишеней обуславливать возникновение побочных эффектов. Регуляторные сети являются наиболее подробным видом описания сигнальных путей в клетке, ассоциированных с биологическими процессами, а также с регуляцией ответа клетки на внешние стимулы, например, на воздействие фармакологическими веществами. Анализ и моделирование поведения таких сетей в норме и при патологиях является основой для выявления перспективных мишеней действия лекарственных препаратов. С этой целью применяют статические и динамические подходы. Статический анализ регуляторных сетей позволяет осуществлять исследование топологии регуляторных сетей с выявлением закономерностей в ее структуре и выявлять наиболее значимые участки регуляторной сети при развитии заболевания, исходя из топологии регуляторной сети и/или на основе данных об экспрессии генов. Статические методы анализа дают возможность работать с обширными регуляторными сетями, исследовать топологию сети, представленную различными мотивами, но не обеспечивают моделирование динамики, включая влияние совокупности положительных и отрицательных обратных связей на процессы в клетке, что не позволяет прогнозировать возможные ответы клетки на определенные стимулы.

Для динамического моделирования наиболее широко используются дифференциальные уравнения, которые применимы только к сравнительно небольшим участкам регуляторной сети, в связи с недостатком экспериментальных данных, описывающих кинетику процесса. Динамические методы моделируют биологические процессы во времени, что позволяет учитывать возможные альтернативные механизмы регуляции, например, активацию пролиферации опухолевых клеток при ингибировании комбинаций вершин, что препятствует достижению желаемого результата при терапии опухолевых заболеваний. При таком моделировании биологических систем широко используют обыкновенные дифференциальные уравнения либо уравнения в частных производных. Основные ограничения таких подходов обусловлены необходимостью наличия полных и точных данных о концентрациях, скоростях реакций, коэффициентах диффузии, и некоторых других параметрах. Как правило, этот вид информации доступен не для всех элементов регуляторной сети, поэтому используют приближенные оценки, получаемые путем моделирования (simulation). При этом стараются определить наиболее правдоподобные «сценарии» (fitting) поведения регуляторной сети, которые обеспечивают разумное согласие расчетных характеристик наблюдаемых в эксперименте эффектов.

4. Скрининг биологической активности

Все большее внедрение в фармацевтическую отрасль современных технологий позволяет совершенствовать методы создания лекарственных средств. К таким методам следует отнести комбинаторную химию, компьютерное моделирование молекул, виртуальный скрининг, высокоэффективный панельный скрининг. Путем скрининга и случайных наблюдений в свое время были найдены ценные препараты, вошедшие в медицинскую практику. Впервые фармакологический скрининг применил немецкий ученый Герхард Домагк, который проводил поиск антимикробных средств среди соединений, синтезированных для крашения тканей. У одного из этих красителей -- красного стрептоцида и было обнаружено противомикробное действие. Так были открыты сульфаниламидные средства. Проведение скрининга -- это чрезвычайно трудоемкий и затратный процесс: для обнаружения одного лекарственного средства исследователю приходится тестировать несколько сотен или тысяч соединений. Так, Пауль Эрлих при поиске противосифилитических средств изучил около тысячи органических соединений мышьяка и висмута, и только один препарат -- сальварсан (арсфенамин) оказался достаточно эффективным.

Скрининг биологической активности включает в себя следующие этапы:

1. Виртуальный скрининг;

2. Синтез вещества с заданной структурой;

3. Панельный скрининг.

Виртуальный скрининг -- это процесс отбора соединений, которые имеются только в электронном виде. Метод виртуального скрининга основывается на том, что ожидаемая биологическая активность напрямую связана со структурой соединения. С помощью таких методов становится возможным предсказание биологической активности как уже имеющегося набора соединений, так и еще не существующих в природе веществ, т. е. еще до синтеза прогнозировать их действие на живые организмы. Например, производные хинолина обладают противотуберкулезной активностью; производные 2-8-бензилпиримидинов используются для создания антигистаминных лекарственных средств; производные 1,5-оксадиазола проявляют гипотензивное действие. Виртуальный скрининг включает следующие этапы:

1. Подготовка модели биомишени (расстановка зарядов на атомах);

2. Подготовка баз данных структур органических соединений (расчет физико-химических свойств, моделирование пространственной структуры соединения, расчет зарядов на атомах);

3. Препроцессинг баз данных (процесс удаления структур по физико-химическим критериям: липофильности, молекулярной массе, по предсказанной токсичности и т. д.);

4. Молекулярный докинг -- метод молекулярного моделирования, основанный на предсказании наиболее выгодного положения молекул в пространстве относительно друг друга;

5. Постпроцессинг сформированных баз потенциальных лигандов с помощью моделей QSAR, в результате чего мы получаем сфокусированную библиотеку потенциальных лигандов для данной биомишени.

QSAR -- аббревиатура, которая является сокращением от английского Quantitative Structure Activity Relationships, что в переводе на русский язык обозначает Количественное Cоотношение Cтруктура -- Активность (КССА). В методологии QSAR выделяют прямую и обратную задачи. Прямая задача QSAR заключается в предсказании активности на основе знания структуры соединения. Обратной задачей QSAR является конструирование химических структур с заданными величинами активностей. В методе QSAR структурная формула представляется в математическом виде- модели QSAR, с помощью которой можно описать как биологическую активность, так и любое свойство соединения. Модель QSAR представляет собой линейную зависимость свойство-структура. С помощью метода QSAR становится возможным синтез соединений с заданным комплексом свойств. Помимо виртуального скрининга, основанного на поиске лигандов, существует виртуальный скрининг биологической активности с использованием фармакофоров. Фармакофор -- структурный элемент или фрагмент молекулы, обеспечивающий фармакологическую активность соединения. Фармакофорная модель представляет собой набор точек в пространстве с определенными физико-химическими свойствами, местами связывания и расстояниями между ними. Виртуальный скрининг с использованием фармакофорной модели предполагает отбор молекул, удовлетворяющих требованиям данной модели относительно функциональных групп и расстояний между ними. После подбора структуры соединения осуществляют синтез вещества, а затем проводят исследование его биологической активности с помощью панельного скрининга.

В 60-е годы ХХ века разработаны методы иммуноферментного анализа, с помощью которых проводился анализ одного образца на одном биочипе. Такой процесс занимал большое количество времени. В последующие годы технология изучения биологической активности совершенствовалась: изучалось 16 образцов, включенных в один планшет; планшеты объединили, и стало возможным изучение 64 образцов за раз. В настоящее время анализ биологической активности проводится на биочипе. Биочип -- это матрица, на которую наносятся биологические макромолекулы, т. е. биомишени (ДНК, белки, в том числе и ферменты, клетки), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе. В качестве биомишеней могут выступать олигонуклеотиды, фрагменты геномной ДНК, РНК, белки, полипептиды, рецепторы антител, лиганды, олигосахариды и т. д. Биочип позволяет определить активность сразу 96 соединений (в отличие от ИФА). Матрицы для биочипа -- это стеклянный или гелевый слайд (стандартного размера 25х75х1 мм). Биочипы объединяют в планшет, размеры которого неограничены. Рассмотрим процессы определения биологической активности с помощью ИФА и анализа на биочипе. Анализ биологической активности на иммуночипе начинается с этапа пробоподготовки путем разведения сыворотки. Затем проводят термостатирование и отмывку (для выделения участка или фрагмента молекулы). Добавляют анализируемое вещество, проводят термостатирование с конъюгатом, отмывку продукта и обработку результатов анализа. При проведении анализа с помощью биочипа отсутствуют стадии пробоподготовки, термостатирования и отмывки, т. е. на поверхность биочипа помещают уже готовую биомишень, затем добавляют вещества, биологическую активность которых необходимо изучить. Происходит связывание анализируемых веществ с биомишенью. Добавляют фосфоресцентный метчик, после чего испускается световой сигнал. По характеру свечения или его отсутствию судят о той или иной биологической активности. В качестве сигнальных реактивов или фосфоресцентных метчиков используют длительно люминесцирующие металлопорфирины и комплексоны ионов лантаноидов. Преимущества использования биочипов в анализе биологической активности. Стоимость определения биологической активности с помощью биочипа в разы ниже, чем при использовании набора для ИФА. Использование биочипов в анализе биологической активности позволяет проанализировать одновременно большое количество соединений за короткий период времени. К недостаткам анализа с помощью биочипов следует отнести материал, из которого они изготовлены (гелевые биочипы подходят для анализа, в котором в качестве биомишеней выступает ДНК, но не белок, это связано с их структурой. Из-за этого возможны искажения результатов анализа). Описанные методы дают возможность провести следующие доклинические испытания: Провести исследования на биологическую активность:

1. Изучить токсичность, мутагенность, кардиотоксичность;

2. Исследовать анальгетическую активность;

3.Исследование протововоспалительной активности (влияние на эффекты медиаторов воспаления).

Изучить модели заболеваний:

1. Изучение модели заболевания: Болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона;

2. Изучение онкологических заболеваний (ксенографты);

3. Изучение поведенческих моделей: антидепрессантной, антипсихотической, каталептической, антиамнестической активностей Также с помощью описанных методов можно изучить свойства веществ:

1. растворимость в воде;

2. липофильность (logP);

3. проницаемость через ГЭБ;

4. связывание с белками плазмы крови.

Предсказание направления активности соединений имеет особое значение, так как современная фармакология работает более чем с двумя тысячами видами биологической активности. Использование методов рационального досинтетического отбора является необходимым условием успешной реализации исследовательских программ по разработке новых лекарств.

5. Компьютерное конструирование и виртуальный скрининг

Одной из важных и интересных проблем современной науки является поиск и разработка новых лекарств. В чем заключается основной принцип создания лекарств?

Для многих болезней известны белки, которые определяют весь ход заболевания. Эти белки могут служить мишенями для лекарственных веществ - лигандов, которые связываются с активными центрами белков и изменяют их работу. Разработка новых соединений и составляет ключевой этап в создании лекарств.

С конца 80х годов прошлого века для поиска новых химических соединений использовался метод высокопроизводительного скрининга, или перебора. Суть этого метода заключается в том, что происходит перебор большого количества соединений и отбор тех, которые наилучшим образом соединяются с данным белком-мишенью. Современный аналог высокопроизводительного перебора - виртуальный скрининг, проводится с использованием суперкомпьютеров и позволяет перебирать десятки тысяч соединений из баз данных.

Каким же образом проводится поиск лигандов? Для поиска лигандов используют методы молекулярного моделирования, главным из которых является докинг. Докинг - это поиск положения молекулы лиганда в активном центре белка-мишени, которое соответствует наибольшей энергии связывания лиганда с белком. Чем сильнее лиганд связывается с белком, тем лучше будет лекарство на его основе. С математической точки зрения - это поиск глобального минимума свободной энергии.

Как известно, наиболее выгодная конформация молекулы - конформация с наименьшей энергией. Для расчета этой энергии нужно иметь представление о межмолекулярных и внутримолекулярных взаимодействиях. Созданы программы, которые моделируют эти взаимодействия (например, программа SOL). В программе SOL используется модель “силового поля” MMFF94. Это поле представляет собой набор классических потенциалов. Полная потенциальная энергия системы равна сумме энергии электростатического взаимодействия между атомами, энергии взаимодействия Ван-дер-Ваальса, энергии растяжения связи, энергии деформации валентного угла, энергии перекрестного взаимодействия (она обусловлена одновременным растяжением связи и деформацией валентного угла), энергии вращения вокруг связи и энергии взаимодействия, обусловленной выходом атома из плоскости (угол Вильсона - угол между связью и плоскостью). Расчет этих сил проводят в два этапа. Первый этап заключается в типизации атомов. Каждому атому приписывается тип, который зависит от порядкового номера этого атома в таблице Менделеева и от локального химического окружения этого атома (например, углерод С может быть алкильный, винильный, ароматический и т.д.). Второй этап - генерация всех групп атомов. Группы составляют для расчета длины связей (их также используют для расстановки парциальных зарядов на атомах) и различных углов (валентного, торсионного и угла Вильсона). Величины этих сил определяются с учетом типа атома и типа химической связи (одинарная, двойная, тройная). Расстановку силовых параметров на основе силового поля MMFF94 производит программа FARS (Fire Algorithm for Rings Search).

В свободной энергии образования комплекса белок-лиганд есть две составляющие: энтальпийная и энтропийная. Энтальпийная составляющая определяется потенциальной энергией взаимодействия белка и лиганда (электростатические и Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия между белком и лигандом и энергия внутреннего напряжения лиганда) с учетом влияния растворителя. Энтропийная составляющая учитывается путем добавления положительного слагаемого (его величина пропорциональна числу вращательных степеней свободы лиганда).

В процессе докинга белок представляется в виде жёсткой конструкции. Атомам белка приписываются типы и они создают вокруг себя поля (электростатическое, Ван-дер-Ваальсово), атомы лиганда под воздействием этих полей приобретают энергию, эти энергии суммируются. Внутренняя энергия напряжения лиганда - это сумма потенциалов атомов лиганда в соответствии с силовым полем.

Программа докинга разбивается на две стадии: первая - поиск наилучшего положения лиганда и вторая - оценка свободной энергии связывания белка с лигандом в найденном оптимальном положении.

На сегодняшний день одним из наиболее успешных алгоритмов поиска глобального минимума является генетический алгоритм. Этот алгоритм используется в программе SOL.

Главная задача этого алгоритма: оптимизировать положение лиганда таким образом, чтобы общая энергия была минимальной. При этом оптимизируются внутренние степени свободы лиганда (они отвечают за внутреннию энергию напряжения лиганда) и степени свободы, связанные с положением лиганда в активном центре белка-мишени (они отвечают за энергию лиганда в поле белка).

В чем заключается суть этого алгоритма? Он моделирует процесс эволюции по Дарвину. Есть популяция особей - лигандов. Естественный отбор отбирает особи с минимальной полной энергией лиганда. Генотип каждой особи-лиганда - это хромосома. Число генов в хромосоме - это число степеней свободы лиганда. Величина каждого гена соответствует степени свободы лиганда. Таким образом, хромосома однозначно определяет положение лиганда в пространстве. Положение лиганда в пространстве - фенотип.

Путем некоторых математических преобразований проводится перевод генотипа в фенотип. Затем для каждого фенотипа может быть вычислена полная энергия.

Первоначально популяция особей-лигандов создается заполнением генов всех хромосом при помощи генератора случайных чисел. После этого подсчитывается энергия для каждой особи, лучшие особи с минимальной энергией отбираются и формируют новое поколение. С новым поколением можно провести следующие операции. Кроссинговер - создание новой хромосомы их двух родительских путем случайного объединения их генов. Также на особи-лиганды можно подействовать оператором мутации, который случайно изменяет значение гена в хромосоме. Часть особей - с наименьшей энергией - не изменяют (прямой перенос), чтобы сохранить лучшие решения.

Чем удобен генетический алгоритм? Дело в том, что найти локальный минимум энергии конфрмации молекулы довольно просто, достаточно немного улучшать уже найденные решения. Но генетический алгоритм осуществляет процессы кроссинговера и сильные мутации, что позволяет найти именно глобальный минимум, который может очень далеко отстоять от локального минимума и соотвествовать совсем другой конформации молекулы.

Разработанная программа докинга SOL успешно применялась для разработки прямых ингибиторов тромбина. Нарушение процесса свертываемости крови - одна из распространенных

проблем в современной медицине. Ключевым ферментом в системе свертываемости крови является тромбин. Он активирует превращение растворимого фибриногена в нерастворимый фибрин, который и составляет основу тромба. Поэтому наиболее очевидный путь предотвращения тромбообразования - это ингибирование тромбина. В настоящее время в медицинской практике для этих целей используется гепарин. Но гепарин лишь активирует природный ингибитор тромбина - антитромбин ATIII. Поэтому при недостатке антитромбина введение гепарина не подавляет активность тромбина. Следовательно, поиск прямого ингибитора тромбина является очень важной задачей.

В результате исследования было рассмотрено около шести тысяч потенциальных ингибиторов тромбина, для них был проведен докинг и оценена энергия связывания. При этом первый ингибитор был синтезирован с двадцатой попытки. Таким образом, вместо экспериментального перебора шести тысяч соединений было синтезировано всего двадцать. Это очень сократило и время, и затраты на разработку.

Другой областью применения докинга является разработка синтетических вакцин. Цель - выявить эпитопы возбудителя (они наиболее сильно связываются с белками главного комплекса гистосовместимости MHC). Тогда можно будет вместо введения в организм возбудителя вводить искусственно синтезированные эпитопы.

Программа SOL позволяет позиционировать лиганды в белки-мишени с высокой точностью. Но модель силового поля, описанная выше, является упрощенной схемой описания меж- и внутримолекулярных взаимодействий. Для достижения большей точности моделирования следует использовать методы квантовой химии. Естественно, такие сложные вычисления можно проводить только на суперкомпьютерах.

Методами квантовой химии был разработан класс ингибиторов интегразы ВИЧ (этот белок играет ключевую роль в репликации вируса в организме). При связывании этих ингибиторов с белками важную роль играет образование хелатных (координационных) связей. Эти связи образуются только при определенной конформации молекул, которые можно рассчитать с помощью очень точных квантово-механических расчетов. Для таких расчетов необходимо применение суперкомпьютеров.

Таким образом, усовершенствование методов компьютерного моделирования и прогресс в создании новых суперкомпьютеров для реализации этого моделирования позволит существенно упростить процесс и повысить эффективность разработки новых лекарств.

6. Поиск и конструирование лигандов, действующих на конкретную молекулярную мишень

После того, как в рамках ориентированного на фармацевтическую разработку конкретного проекта выбрано заболевание и в первом приближении определена молекулярная мишень (мишени), воздействие на которую (которые) может привести к нормализации рассматриваемой патологии, приступают к поиску и/или конструированию лигандов. В зависимости от исходной информации и ресурсов, которыми располагает исследователь, применяют один из четырех подходов.

Если неизвестны ни 3D структура мишени, ни структурные формулы лигандов, используют экспериментальные методы комбинаторной химии и высокопроизводительного скрининга.

Если 3D структура мишени установлена, но структурные формулы лигандов не известны, используют методы конструирования лекарств de novo.

Если установлена 3D структура мишени и известны структурные формулы некоторых лигандов, используют методы, основанные на структуре мишени (Target-Based Drug Design).

Если 3D структура мишени не установлена, но структурные формулы некоторых лигандов известны, используют методы, основанные на структуре лигандов (Ligand-Based Drug Design).

7. Поиск активных лигандов путем экспериментального скрининга

Случайный скрининг биологической активности активно применялся в фармацевтических разработках во второй половине XX столетия. Ярким примером такого подхода является программа тестирования действия веществ на опухолевые клеточные линии DTP, осуществляемая Национальным раковым институтом США (NCI/NIH Developmental Therapeutics Program). Эта исследовательская программа была начата в 1955 году в рамках работы Cancer Chemotherapy National Service Center, который принимал присланные исследователями со всего мира образцы химических соединений для тестирования цитотоксической активности на опухолевых клеточных линиях (наиболее известное название этой панели тестов - «60 cell lines», хотя в реальности тестирование осуществлялось на большем числе различных клеточных линий). За прошедшие годы в рамках данной программы создан репозиторий, содержащий информацию о более чем 600 тысячах природных и синтетических веществ, биологическая активность которых была изучена на опухолевых клеточных линиях и в других тестах (в частности, на антиретровирусную активность)]. Данные о примерно 250 тысячах соединений находятся в свободном доступе; примерно для 200 тысяч веществ на основе специального соглашения могут быть получены образцы для тестирования их биологической активности. Необходимо отметить, что отбор для тестирования веществ, полученных в университетах и научно-исследовательских институтах различных стран, осуществляется специалистами Национального ракового института с учетом уже накопленных знаний и с использованием специально разработанного алгоритма COMPARE, т.е. скрининг не является полностью случайным. В Советском Союзе попытка создать аналогичную систему для регистрации и широкомасштабного биологического тестирования веществ синтетического и природного происхождения была предпринята в 1972-1991 г.г. Предполагалось, что все химические институты и университеты будут направлять на государственную регистрацию новые химические соединения, и наиболее перспективные из них будут отбираться для проведения биологических испытаний. В рамках этого проекта В. В. Авидоном с сотр. были заложены основы для компьютерной оценки проявления конкретных видов биологической активности представленными на государственную регистрацию химическими соединениями. С распадом СССР реализация данного проекта была прекращена, однако многие возникшие в рамках него идеи получили дальнейшее развитие.

Дизайн веществ de novo

Если пространственная структура макромолекулы-мишени установлена экспериментальными методами (рентгеноструктурный анализ - РСА, ЯМР высокого разрешения, молекулярное моделирование), но структурные формулы лигандов не известны, используют конструирование лекарств de novo. Как правило, при этом применяют методы дизайна лекарств, основанные на структуре фрагментов.

Если используются маленькие фрагменты, то можно провести картирование активного центра (binding site) белка и построить модель фармакофора, на основе которой медицинский химик сумеет сконструировать структурную формулу молекулы с учетом возможностей ее синтеза. Так, например, с использованием набора лигандов, содержащих характерные функциональные группы (ион формиата, аммиак, ион аммония, метанол, метиламин), нами был построен фармакофор активного центра алкогольде-

гидрогеназы (КФ 1.1.1.1) - фермента, принимающего участие в клеточном цикле метаболизма низкомолекулярных спиртов.

В настоящее время, методы дизайна лекарств de novo получили существенное развитие: конструирование молекул, предположительно связывающихся с активным центром, осуществляется автоматически на основе сравнительно больших фрагментов (building blocks), с учетом возможностей их синтеза, оценок лекарственного подобия (drug-likeness), растворимости, фармакодинамических и фармакокинетических параметров, низкой токсичности. Более того, методы, основанные на структуре фрагментов (Fragment-Based Drug Design) могут применяться и без использования информации о пространственной структуре макромолекулы-мишени. лекарственный препарат фармакология молекулярный

Конструирование новых структур из фрагментов позволяет проанализировать существенно бульшую долю химического пространства в отношении определенной биологической активности. Так, для структур с молекулярной массой около 200 а.е.м. насчитывается примерно 1010 различных вариантов, в то время как для молекулярной массы 500-600 а.е.м. существует в общей сложности около 1040-1080 различных химических структур.

8. Дизайн веществ на основе структуры макромолекулы-мишени

В настоящее время одним из наиболее популярных методов поиска новых фармакологических веществ является подход, основанный на анализе структуры макромолекулы-мишени (англ.: Target-Based Drug Design или Structure-Based Drug Design). Поскольку именно пространственная структура молекул является определяющей при взаимодействии низкомолекулярного лиганда с молекулой макромолекулы-мишени, анализ их непосредственного взаимодействия методами молекулярного моделирования предоставляет исследователю ценную информацию, ко-

торая может быть использована для поиска и конструирования новых фармакологических веществ с требуемыми свойствами.

Применение данного подхода требует наличия информации о пространственной (3D) структуре макромолекулы-мишени, которая может быть либо определена экспериментально (РСА, ЯМР и другие методы), либо рассчитана теоретически на основе молекулярного моделирования. В последнем случае наиболее надежными являются модели, основанные на гомологии аминокислотной последовательности целевой мишени и белка, 3D структура которого определена экспериментально (считается, что степень идентичности первичной структуры макромолекул должна быть не ниже 30%.

При подготовке структуры белка для проведения докинга необходимо дополнить молекулу отсутствующими атомами водорода, достроить «потерянные» боковые цепи аминокислотных остатков, уточнить данные об ароматичности молекулярных фрагментов, устранить некорректные значения валентности, учесть возможное наличие молекул воды, скорректировать имеющиеся разрывы в структуре белка. Как указывается в учебном посо-

бии, в представленных в PDB данных о пространственной структуре белков-мишеней такого рода ошибки встречаются нередко.

Далее, необходимо определить область белка, по отношению к которой будет осуществляться докинг. Как правило, для этой цели из полноразмерной 3D структуры белка вычленяют куб, в котором находится предполагаемое место связывания. Если в PDB имеется структура для комплекса белка с лигандом (субстратом или ингибитором), выбор области осуществляется с учетом этой информации. Для выбранной области строят трехмерную сетку потенциалов, в узлах которой записывают потенциалы взаимодействия атомов лиганда с атомами белка. На область докирования могут устанавливаться дополнительные ограничения, например, принудительное позиционирование отдельных функциональных групп; исключенные области - зоны, где запрещено размещение лиганда или его фрагментов; вращаемые группы у аминокислотных остатков, для которых характерно наличие подвижных относительно торсионных углов боковых цепей; и др.

Следующим этапом является подготовка библиотеки лигандов, для которых предполагается оценить «аффинность» взаимодействия с конкретной мишенью. Это может быть сравнительно небольшой набор потенциально активных соединений, которые уже синтезированы, исходя из представлений конкретного исследователя, либо виртуальная библиотека «нарисованных» им структур, которые планируются к синтезу. С другой стороны, это может быть сравнительно большая библиотека структур коммерчески доступных образцов лекарственно-подобных соединений, содержащая информацию о миллионах молекул. В последнем случае, чтобы уменьшить время, необходимое для проведения соответствующих компьютерных расчетов, как правило, используют различные методы фильтрации. Тем не менее, предварительный анализ как сравнительно небольшого набора структурных формул, так и большой библиотеки молекул, для которых предполагается проведение докинга, и исправление выявленных погрешностей абсолютно необходимы. Иначе полученный результат будет соответствовать известному принципу информатики GIGO (Garbage In, Garbage Out), то есть - «Мусор на входе - мусор на выходе» (при неверных входных данных будут получены неверные результаты, даже если сам по себе алгоритм правилен).

На первом этапе метод докинга позволяет оценить предпочтительную конформацию и расположение лиганда в сайте связывания белка-мишени, обеспечивающие образование стабильного комплекса. На втором этапе осуществляется оценка аффинности связывания с использованием оценочных функций.

9. Дизайн веществ на основе структуры лигандов

Дизайн лекарств на основе структуры-лигандов (Ligand-Based DrugDesign) исторически является первым рациональным подходом к поиску фармакологически активных веществ. Анализ эмпирических результатов тестирования биологической активности различных веществ в процессе фармакологических и токсикологических исследований позволил сформулировать заключение, что «сходные вещества вызывают сходные эффекты». На этой основе уже в середине XIX века предпринимаются попытки связать химическую структуру и физико-химические свойства веществ с их биологической активностью. В 1848 г. J. Blake предположил, что биологическая активность соли определяется ее основным или кислотным компонентом, а не солью в целом (отметим, что теория электролитической диссоциации была предложена Аррениусом только в 1884 г.). В середине XIX века Brown и Fraser показали, что некоторые конвульсанты меняют свою активность и превращаются в миорелаксанты, когда третичный атом азота в их молекуле при метилировании становится четвертичным. Ричардсон при исследовании влияния различных функциональных групп на биологическую активность пришел к выводу, что существует некий общий закон, связывающий структуру с активностью. В 1869 году он писал: «Я уверен, что наступит время, когда книги, называемые «фармакопеи», будут построены на основе рассуждений, и когда химик и врач будут действовать заодно».

В настоящее время (Q)SAR модели - классификационные или количественные модели, широко используются в фармацевтических исследованиях и разработках для прогнозирования биологической активности (в том числе взаимодействия с мишенями) химических соединений. Традиционно, классификационное SAR моделирование применяют для разделения соединений на активные и неактивные по отношению к определенному свойству молекул (например, антигипертензивное, канцерогенное, мутагенное, анксиолитическое действие и т.д.). QSAR модели применяют для оценки количественных величин активности (например, IC50). Модели строят на основеданных о биологической активности химических соединений, полученных экспериментально.

Применение (Q)SAR моделей в поиске новых фармакологических веществ основано на том, что фармакологические эффекты конкретного соединения, вызываемые его взаимодействием с молекулярной мишенью, зависят от особенностей его структуры. Следовательно, описав структуру соединения набором характерных элементов (молекулярных дескрипторов) и проанализировав ряд соединений, обладающих одинаковыми свойствами, на основании схожести их структурной организации можно построить зависимость, вероятнее всего прогнозирующую проявление конкретного свойства. Построенная зависимость может быть использована для оценки наличия величины данного свойства для новых соединений и отбора «кандидатов», согласно прогнозу, обладающих данным свойством.

Таким образом, необходимыми элементами при построении (Q)SAR зависимостей являются дескрипторное описание химической структуры, представление биологической активности, математический метод для анализа взаимосвязей «структура-активность», наличие обучающей выборки.

В настоящее время разработано несколько тысяч различных структурных дескрипторов, включая структурные фрагменты, топологические индексы, различные физико-химические параметры, квантово-химические характеристики, и др.

Для создания (Q)SAR модели, достоверно отражающей реальные процессы взаимодействия между фармакологической мишенью и химическим соединением, требуется репрезентативная обучающая выборка. Скорость накопления данных об известных взаимодействиях для различных классов соединений многократно увеличилась после внедрения технологии высокопроизводительного скрининга (High-Throughput Screening, HTS) как инструмента прикладных или академических исследований. Параллельно с увеличением скорости накопления данных появляются электронные ресурсы, агрегирующие получаемую информацию и предоставляющие к ней доступ. Полученные данные проходят фильтрацию на основе их качества и возможности использования для моделирования. От тщательности подготовки обучающей выборки непосредственно зависит качество построенных моделей и, соответственно, шансы на успех при использовании этих моделей для поиска новых фармакологических веществ и оптимизации их характеристик.

Список используемой литературы

1. Промышленная фармация. Путь создания продукта: монография / Ж.И. Аладышева, В.В. Береговых, Н.Б. Демина [и др.]; под ред. А.Л. Хохлова и Н.В. Пятигорской. - М.: 2019. - 394 с.

2. Лиманский, Е. С. Инструментальные методы скрининга биологической активности / Е. С. Лиманский, Е. С. Погорелова. -- Текст : непосредственный // Молодой ученый. -- 2015. -- № 11 (91). -- С. 497-499.

3. Грицкова И. А., Марков А. Г., Станишевский Я. М., Быков В. А., Прокопов НИ., Хачатурян ИВ., Мягкова М. А., Каплун А. П. Исследование свойств полимерных микросфер различной природы, используемых при создании тест-систем для определения С-реактивного белка // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника, 2005, № 1-2, С. 69-75.

4. Иванов, А.С. Биоинформатика: путь от генома до лекарства in silico / А.С. Иванов, В.В. Поройков, А.И. Арчаков // Вестник РНИМУ. - 2003. - Т. 30, № 4. - с. 19-23.

5. Каменская, М.А. Информационная биология [Текст]: М.А. Каменская. - М.: Издательский центр «Академия», 2006. - 368 С.

6. Жизненный цикл лекарственных средств [Текст]: под ред. Ю.В. Олефира, А.А. Свистунова. - М.: Медицинское информационное агентство, 2018. - 280 с.

7. Садовничий В. А., Сулимов В. Б. Суперкомпьютерные технологии в медицине.

8. Григорьев Ф. В., Романов А.Н., Кондакова О. А., Лущекина С. В., Сулимов В. Б. Алгоритм расстановки силовых параметров на атомах органических молекул и белков в рамках силового поля MMFF94 // Вычислительные методы и программирование. 2006. Т.7 128-136

Размещено на Allbest.ru