Аналіз динаміки розвитку мікроциркуляторного русла на всіх термінах субкутанної імплантації волокнистого полімерного каркасу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Аналіз динаміки розвитку мікроциркуляторного русла на всіх термінах субкутанної імплантації волокнистого полімерного каркасу

ДВНЗ «Івано-Франківський національний медичний університет»,

м. Івано-Франківськ

НДР «Комплексна оцінка та оптимізація методів прогнозування, діагностики та лікування стоматологічних захворювань у населення різних вікових груп»

Резюме

мікроциркуляторний матрикс імплантація біополімерний

Проблема, що стоїть перед тканинною інженерією полягає в тому, щоб оптимізувати виділення, розмноження і диференціювання клітин, сконструювати матрикси або системи доставки, сприяючи підтримці, координації регенерації тканин у трьох вимірах. Одним із важливих критеріїв, який повинен враховуватись при конструюванні матриксу - його здатність утворювати оптимальну підложку для підсадки клітинних субстратів. Мета дослідження - експериментально оцінити характер розвитку мікроциркуляторного русла на всіх термінах субкутанної імплантації біополімерного волокнистого матриксу.

Дослідження проводилось на 20 лабораторних тваринах (кролі), які були поділені на 2 групи. Першій групі порівняння: 10-ом тваринам проводилось оперативне втручання, яке включало формування «кишені» в підшкірній клітковині та накладання швів. Другій групі: 10-ом тваринам проводилась підшкірна імплантація біополімерного матриксу в ділянку спини між лопатками. Для дослідження брали 9 сегментів: один центрально розташований і по 4 сегменти з парацентральної та з периферичної зон.

Статистичний аналіз результатів здійснено за допомогою комп'ютерних програм Microsoft Exel та Statistica 5.5 (Multiple Rйgression) із використанням методів варіаційної статистики, кореляції.

Отримані результати свідчать про відсутність як гострої, так і хронічної реактивної запальної інфільтрації, а також як гострої, так і хронічної реакції відторгнення імплантата як чужорідної субстанції у імплантованій ділянці тварини. Створений нами волокнистий матрикс завдяки своїй гігроскопічності та пористості створює своєрідний місток для проростання та розвитку капілярної сітки.

Ключові слова: біополімер, біоімплантат, судинна сітка.

Резюме

Пантус А.В., Рожко Н.М., Багрий Н.Н., Ковальчук Н.Е., Козовий Р.В.

АНАЛИЗ ДИНАМИКИ РАЗВИТИЯ МИКРОЦИРКУЛЯТОРНОГО РУСЛА НА ВСЕХ СРОКАХ СУБКУТАННОИ ИМПЛАНТАЦИИ ВОЛОКНИСТОГО ПОЛИМЕРНОГО КАРКАСА

Проблема, стоящая перед тканевой инженерией заключается в том, чтобы оптимизировать выделение, размножение и дифференцировку клеток, сконструировать матрикс или системы доставки, способствуя поддержанию, координации регенерации тканей в трех измерениях. Одним из важных критериев, который должен учитываться при конструировании матрикса - его способность образовывать оптимальную подложку для подсадки клеточных субстратов. Цель исследования - экспериментально оценить характер развития микроциркуляторного русла на всех сроках субкутанной имплантации биополимерного волокнистого матрикса.

Исследование проводилось на 20 лабораторных животных (кролики), которые были разделены на 2 группы. Первой группе сравнения: 10 животным проводилось оперативное вмешательство, которое включало формирования «кармана» в подкожной клетчатке и наложения швов. Второй группе: 10 животным проводилась подкожная имплантация биополимерного матрикса в область спины между лопатками. Для исследования брали 9 сегментов: один центрально расположен и по 4 сегмента с парацентральной и из периферической зон.

Статистический анализ результатов осуществлено с помощью компьютерных программ Microsoft Exel и Statistica 5.5 (Multiple Rйgression) с использованием методов вариационной статистики, корреляции.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии как острой, так и хронической реактивной воспалительной инфильтрации, а также как острой, так и хронической реакции отторжения имплантата как чужеродной субстанции в имплантированных участке животного. Созданный нами волокнистый матрикс благодаря своей гигроскопичности и пористости создает своеобразный мостик для прорастания ткани и формирования капилярной сетки в трех мерном пространстве.

Ключевые слова: биополимер, биоимплантат, сосудистая сетка.

Resume

Pantus A.V., Rozhko M.M., Bagrii M.M., Kovalchuk N.E., Kozovyi R.V.

ANALYSIS OF DYNAMICS OF MICROCIRCULATORY CHANNEL DEVELOPMENT ON ALL TERMS OF SUBCUTANEOUS IMPLANTATION OF FIBROUS POLYMER MATRIX

The problem facing tissue engineering is to optimize the selection, reproduction and differentiation of cells, to construct matrices or delivery systems, contributing to the maintenance, coordination oftissue regeneration in three dimensions. One of the important criteria that must be taken into account when constructing a matrix is its ability to form an optimal substrate for substrate substrate. The purpose of the study is to experimentally assess the nature of the development of the microvasculature in all periods of subcutaneous implantation of a biopolymer fibrous matrix.

The study was conducted on 20 laboratory animals (rabbits), which were divided into 2 groups. The first group of comparison: 10 animals were given an operative intervention, which included the formation of "pockets" in the subcutaneous tissue and suturing. In the second group: 10 animals were subcutaneously implanted biopolymer matrix in the back area between the shoulder blades. To study 9 segments were taken: one centrally located and 4 segments from paracentral and peripheral zones.

Statistical analysis of the results was performed using computer programs Microsoft Exel and Statistica 5.5 (Multiple Regression) using methods of variation statistics, correlation.

The obtained results indicate the absence of both acute and chronic reactive inflammatory infiltration, as well as acute and chronic rejection of the implant as a foreign substance in the implanted part of the animal. The fibrous matrix created by us, due to its hygroscopicity and porosity, creates a peculiar bridge for the germination of the tissues and the formation of a microvasculature in three dimensional space.

Key words: biopolymer, bioimplant, collagen fibers.

Постановка проблеми і аналіз останніх досліджень

На даний час у медицині та біоінженерії з кожним роком зростає інтерес до біополімерів. Матеріали в тканинній інженерії для створення біоімплантатів, повинні володіти спектром спеціальних властивостей і надавати інженерним або мікроінженерним конструкціям характеристик, властивих живим тканинам, а саме: здатність до самовідновлення, здатність змінювати будову і властивості в відповідь на фактори навколишнього середовища [1]. Проблема, що стоїть перед тканинною інженерією, полягає в тому, щоб оптимізувати виділення, розмноження і диференціювання клітин, сконструювати каркаси або системи доставки, сприяючи підтримці, координації регенерації тканин у трьох вимірах [2, 3]. Одним із важливих критеріїв, який повинен враховуватись при конструюванні матриксу - його здатність утворювати оптимальну підложку для підсадки клітинних субстратів, у поєднанні з оптимальною гемодинамікою всередині скафолда [4, 5].

Мета дослідження. Експериментально оцінити характер розвитку мікроциркуляторного русла на всіх термінах субкутанної імплантації біополімерного волокнистого матриксу.

Матеріали та методи дослідження

Для проведення досліджень було використано розроблений нами волокнистий матрикс із гранул 100% чистого полілактиду. Матрикс розробляли методом фазового розділення полімеру. Товщина волокнистого матриксу в середньому становила 30 мм. Діаметр волокон становив від 0,7 мкм до 10 мкм.

Вище вказані матрикси піддавались гамма стерилізації. Герметично запаковані в подвійну упаковку для стерилізації скафолди рівномірно вкладались під електронний пучок з енергією частинок 4 мега електрон вольт (МеВ) і протяжністю імпульсів 4,5 мікросекунд (мкс). Кожен пакет «Medico m» стандартизований EN 8685, ISO 11140-1, ISO 11607-1, в який був запакований полімер товщиною 0,6 мм. При опроміненні кількість імпульсів змінювалась від 4-70.

Стерилізація відбувалась за наступними параметрами:частота роботи прискорювача складала 250 Гц, максимальна енергія електронів становила 5 МеВ, максимальна потужність пучка становила 5 кВт, тривалість імпульсів 4,5 мкс, імпульсний струм до 1,5 А, потужність гальмуючого випромінювання на відстані 1 м від мішені становила - 104 Р/сек. Доза опромінення об'єкта становила до 50 кГр з розрахунку об'єму та щільності матеріалу. Згідно норм максимально допустима доза 50 кГр, при максимальній енергії електронів 5 МеВ. Обробка електронами з енергією менше 10 МеВ не викликала ядерних трансмутацій, тобто не призводила до виникнення радіоактивних ізотопів і не створювала залишкового радіаційного фону об'єкту. Після стерилізації біополімерні матрикси хірургічним шляхом імплантувались під шкіру лабораторної тварини. Дослідження проводилось на 20 лабораторних тваринах (кролі), які були поділені на 2 групи. Першій групі порівняння:10-ом тваринам проводилось оперативне втручання, яке включало формування «кишені» в підшкірній клітковині та накладання швів. Другій групі: 10-ом тваринам проводилась підшкірна імплантація біополімерного матриксу в ділянку спини між лопатками. Забір матеріалу проводили на 1,2,3 місяцях хірургічним шляхом матрикс разом із прилеглими тканинами видалявся з тіла тварини.

Всі маніпуляції з експереентальними тваринами проводили з дотриманням правил відповідно до «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей» [6].

Для здійснення загального гістологічного дослідження матрикс з оточуючими тканинами розсікали взаємно перпендикулярними розрізами на 25 однакових сегментів. Для дослідження брали 9 сегментів: один центрально розташований і по 4 сегменти з парацентральної та з периферичної зон. Отримані ділянки імпланту фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну (Р^7,0). Час фіксації складав 24 години. В подальшому шматочки досліджуваних органів поміщали в висхідну батарею спиртів для дегідратації, далі у хлороформ, суміш хлороформ-парафін (1:1), парафін (при температурі 37°С). Після парафінової препідготовки, шматочки заливали в парафін. Виготовлення серійних парафінових зрізів товщиною 4-6 мкм проводилося на санному мікротомі. Забарвлення препаратів здійснювалося гематоксиліном і еозином [7].

Гістологічні препарати досліджувались світлооптично на мікроскопі Leica DME під різними збільшеннями об'єктива й окуляра. Морфометричні показники визначали за допомогою системи для отримання мікроскопічних зображень гістологічних мікропрепаратів (мікроскоп Leica DME та цифрова фотокамера "Nikon P5100") та програми аналізу зображень Image Tool 2.0 for Windows на кафедрі патоморфології та судової медицини Івано-Франківського національного медичного університету. Статистичний аналіз результатів здійснено за допомогою комп'ютерних програм Microsoft Exel та Statistica 5.5 (Multiple Regression) із використанням методів варіаційної статистики, кореляції.

Результати дослідження

При патоморфологічному дослідженні периферичних зон імплантів 1,2 та третього місяців терміну відзначається розвиток сполучної тканини та судин у міжволокнистих просторах імплантованого каркасу, що показало чіткий взаємозв'язок між топографією розташування судин, терміном імплантації, показниками площі сполучної тканини на одну судину, показниками площі поперечного перерізу судин, та товщиною стінок судин (Табл.1, 2, 3).

Таблиця 1. Показники площі сполучнотканинного матриксу на одну судину на всіх термінах субкутанної імплантації

Таблиця 2Показники площі поперечного перерізу судин на всіх термінах субкутанної імплантації

Таблиця 3 Показники середньої товщини стінок судин на всіх термінах субкутанної імплантації

Судини в сполучній тканині 1 місяця імплантації розташовуються нерівномірно в середньому на одну судину припадає 49345,18+4,22 мкм2 площі. Середній калібр становив 697,61+3,99 мкм2, при нормі 597,24+3,12 мкм2. Судини, здебільшого капілярного типу, з тонкими стінками, середньою товщиною 3,2+0,14 мкм, з чіткою базальною мембраною.

При патоморфологічному дослідженні кровоносної системи периферичної ділянки імплантованих волокнистих полімерних матриксів двомісячного терміну в сполучній тканині виявляються здебільшого дрібні судини площею поперечного перерізу 2458,87+3,23 мкм2 яка збільшилась в порівнянні з першим місяцем імплантації. Пропорційно зросла і товщина стінок судин 6,87+3,76 мкм, та площі сполучної тканини на 1 переріз судини 79913,72+3,12 мкм2. Слід також відзначити, що в перикапсулярних зонах зростає щільність судинного русла, що становить 75080,86+4,23 мкм² площі сполучної тканини на один переріз судини.

При патоморфологічному дослідженні кровоносної системи периферичної ділянки імплантованих волокнистих полімерних матриксів тримісячного терміну у пухкому та компактному шарі сполучнотканинних волокон візуалізуються судини площею перерізу 3480,68+3,56мкм2, товщиною стінки 13,5+1,22 мкм., які пропорційно збільшились в порівнянні з першим та другим місяцями імплантації. Згідно даних (таблиці 1) в порівнянні з поперердніми термінами зросла площа сполучної тканини на 1 переріз судини 90988,20+4,67 мкм².

При патоморфологічному дослідженні 1 місячного терміну парацентральних зон імплантів у сполучній тканині виявляються тонкостінні судини капілярного типу, артеріоли, венули. Середня товщина стінок даних судин становить 3,09+0,17мкм, площа поперечного перерізу - 739,56+4,32 мкм², проти 2,97+0,13мкм та 728,45+3,98 мкм² у контролі. В порівнянні з периферчними ділянками даного терміну товщина стінки зменшується, а площа поперечного перерізу судин навпаки збільшується. За даними морфометричного дослідження, на один переріз судини припадає 37698,96+4,32 мкм² сполучнотканинного матриксу, що є меншим від показників периферичних ділянок 1 місячного терміну імплантації.

У парацентральних ділянках волокнистого каркасу 2 місячного терміну в товщі жирової тканини візуалізуються різного калібру судини. Здебільшого судини дрібного калібру типу капілярів, площею поперечного перерізу 2552,04+4,12 мкм2, тонкостінні (5,73+0,22 мкм). При порівнянні з периферичними ділянками даного терміну імплантації спостерігається зменшення товщини стінки судин при збільшені їхньої площі поперечного перерізу. На одному переріз судини становить 58769,85+3,98 мкм2 площі тканини, що є меншим у порівнянні з периферичним відділом.

Поміж сполучнотканинними волокнами парацентральних зон волокнистого матриксу 3 місячного терміну імплантації візуалізуються різного калібру судини середньою площею поперечного перерізу 4524,9+2,79мкм², яка в порівнянні з периферичним відділом збільшується. Здебільшого судини за типом капілярів, артеріол (на один переріз судини припадає 84875,36+4,87 мкм2 площі сполучної тканини), які мають округлий поперечний переріз, товщину стінки 7,0+1,04 мкм. Аналіз даних показників показав зменшення обидвох в порівнянні з периферичним відділом даного терміну імплантації.

При патоморфологічному дослідженні центральних зон імплантів 1 місячного терміну встановлено, що простори між волокнами імпланта заповнюються сполучною тканиною, у якій виявляються повнокрівні переважно дрібного калібру судини. В порівнянні з парацентральною та периферичною зонами спостерігається збільшення показників площі поперечного перерізу судин до 1321,23+4,75 мкм², при зменшенні товщини стінки судин - 2,65+0,16мкм. У інтактних тварин ці ж показники дорівнювали 934,23+4,05 мкм² та 2,44+0,14мкм. Встановлено, що кількість судин на одиницю площі є дещо більшою від норми в випадках пухкого розташування волокон, що становить 20915,92+3,59 мкм² сполучної тканини на один поперечний переріз судини. В інших випадках на один поперечний переріз судини припадає 24797,47+3,33 мкм² сполучної тканини, що є меншим від показників периферичних зон та парацентральних 1 місячного терміну. Методом морфометричного та статичничного аналізів достовірно встановлено збільшення щільності судинного русла в зонах навколо синтетичних волокон (19872,94+4,32 мкм² площі сполучної тканини на один переріз судини) відносно глибше розташованої сполучної тканини, що описано в пухкій та більш щільнішій сполучній тканинах.

При патоморфологічному дослідженні центральних зон імплантів двомісячнго терміну в сполучній тканині в просторах між волокнами наявні різного калібру судини. Судини, які розташовуються в сполучній тканині, за даними морфометричного дослідження, мають середню площу поперечного перерізу 3268,46+4,75 мкм², товщиною стінки 4,95+0,14 мкм. Обидва показники пропорційно змінювались від периферії до центру, а саме як правило пеший показник зростав а другий навпаки зменшувався в порівнянні з периферичною ділянкою та парацентральною. Серед даних судин, одні більш дрібніші з ядрами ендотеліоцитів овальної форми, з чіткою базальною мембраною, в просвіті невелика кількість еритроцитів. Поряд із цим, візуалізуються судини більш крупного калібру за типом венул із тонкими стінками, заповнені еритроцитами, з витягнутими вздовж базальної мембрани ядрами. Показник площі сполучної тканини на 1 переріз судин зменшувався до 53247,58+3,13 мкм2 в порівнянні з периферичними та парацентральними ділянками. У тварин контрольної групи морфометричний аналіз проводили з фрагментів сполучної тканини взятих з різних ділянок післяопераційної зони. Площа поперечного перерізу судин у цій групі становила 2188,67+4,32 мкм2, а на один переріз судини припадало 49345,65+3,13 мкм2 площі сполучної тканини.

У сполучній тканині центральних зон імпланта 3 місячного терміну відзначаються судини різного калібру: капіляри, артеріоли, венули. Середня площа поперечного перерізу судин становить 6040,34+3,19мкм², товщина стінки - 6,28+1,26 мкм. Перший показник пропорційно зростав в порівнянні з парацентральною та периферичною зонами, другий навпаки зменшувався. Зменшення до 85014,29+4,32 мкм2 також відмічалось в показника площі сполучної тканини на 1 переріз судини в порівнянні з периферичною зоною імпланту і на оному рівні з парацентральною ділянками даний показник утримувався.

Аналіз та обговорення результатів

Отже на основі проведеного аналізу динаміки змін показників судин можна зробити висновок про рівномірний закономірно-пропорційний розвиток мікроциркуляторногорусла всередені волокнистого матриксу. Даний висновок підтверджується рядом показників, а саме пропорційне зменшення товщини стінок судин на всіх термінах та зонах дослідження із збільшенням площі їхнього поперечного перерізу від периферії до центру свідчить про розгалуженість капілярної сітки від більш крупних судин на периферії і до дрібніших у центрі. З іншої сторони дана особливість будови також вказує на активну гемодинаміку у центрі волокнистого матриксу що може бути пов'язано з активними біосинтетичними процесами у парацентральних та центральних ділянках. Також такий тип будови пояснюється початком гідролізу матеріалу як компенсаторний механізм спрямований на активне виведення продуктів гідролізу із тканин для забезпечення біологічної рівноваги між синтезом та руйнуванням. Зменшення показників площі сполучної тканини на 1 переріз судини вказувало на пропорційно зростаючу кількість судин від периферії до центру.

Висновки

1. Відсутність значної кількості нейтрофільних лейкоцитів, збільшеної кількості макрофагів і лімфоцитів свідчить про відсутність як гострої, так і хронічної реактивної запальної інфільтрації, а також як гострої, так і хронічної реакції відторгнення імплантат як чужорідної субстанції в імплантованій ділянці тварини.

2. Створений нами волокнистий матрикс завдяки своїй гігроскопічності та пористості створює своєрідний місток для проростання тканин та формування капілярної сітки в трьохвимірному просторі.

Література

1. Preimuschestva vremennyih nesyemnyih frezerovannyih i polimerizovannyih plastmassovyih protezov na implantatah (2013) Olesova VN, Dovbnev VA, Evstratov OV, Zveryaev AG, Zuev MD, Lesnyak AV [i dr.]. Klinichiskie issledovaniya 1: 25-26 [in Russian]

2. Andryushechkina TN, Berchenko GN, Gioeva YUA, Zoryan EV, Atrushkevich VG Vliyanie kompleksnyih antigomotoksicheskih preparatov na tkani parodonta v aktivnom periode ortodonticheskogo lecheniya:eksperimentalno-morfologicheskoe i klinicheskoe issledovanie. Klinicheskaya stomatologiya 2015 4: 42-49 [in Russian]

3. Balin VN, Balin DV, Iordanishvili AK, Muzyikin MI Osteostimuliruyuschee deystvie ksenogennogo kostnogo materiala na reparativnyiy osteogenez (eksperimentalno-morfologicheskoe issledovanie). Stomatologiya 2015 94(2): 5-9 [in Russian]

4. Hayashi CH, Gudino CV, Gibson FC, Genco CA (2010) Review: pathogen-induced inflammation at sites distant from oral infection: bacterial persistence and induction of cells pecific innate immune inflammatory pathways. Mol. Oral. Microbiol 5(25): 305-316

5. Deev RV, Isaev AA, Kochish AYU, Tihilov RM (2016) Kletochnyie tehnologii v travmatologii i ortopedii: puti razvitiya. Kletochnaya transplantologiya i tkanevaya injeneriya 3(6): 22-33 [in Russian]

6. Poriadok provedennia naukovymy ustanovamy doslidiv, eksperymentiv na tvarynakh. Ofitsiinyi visnyk Ukrainy. Ofits. vyd. (2012) 24:82 [in Ukrainian]

7. Bahrii MM, Dibrova VA, Popadynets OH, Hryshchuk MI Metodyky morfolohichnykh doslidzhen:monohrafiia. Vinnytsia:Nova knyha (2016):328 [in Ukrainian]

Размещено на Allbest.ru