Studiowanie wplywu Mycoplasma pneumoniae i CARDS-toksyna na ekspresji prozapalczywych cytokin komorkami respiratora nabloneka in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Studiowanie wplywu Mycoplasma pneumoniae i CARDS-toksyna na ekspresji prozapalczywych cytokin komorkami respiratora nabloneka in vitro

Kastsiuk Sviatlana

doktor medycyny, professor

Bialoruska Akademia Medyczna

Ksztalcenia Podyplomowego, Minsk

Annotation

Dla oceny patogennego dzialania Mycoplasma pneumoniae i CARDS-toksyny przeprowadzaly ocen§ ekspresji prozapalczywych cytokin TNF -a, IL - 6, RANTES i IL - 33. W badaniach, przeprowadzonych in vitro, z uzyciem komorkowej linii raka pluc czlowieka A549, ustalono, ze obecnosc proteiny A powierzchniowo (SP - A) towarzyszy zwi^kszeniem poziomow ekspresji TNF -a, IL - 6, RANTES i obnizeniem poziomow ekspresji IL - 33 komorkami respiratora nabloneka.

Kluczowe siowa: Mycoplasma pneumoniae; respirator nabionek; ekspresja genцw; cytokiny.

Abstract

For estimation of Mycoplasma pneumoniae and CARDS-toxin pathogenic influence it was analyzed the expression of proinflammatory cytokines TNF-a, IL-6, RANTES and IL-33. In the in vitro researches with the use of human lung carcinoma cell line A 549 it was established that the presence of surfactant protein A (SPA) is associated with TNF-a, IL-6, RANTES over expression and leads to IL-33 decreasing expression by respiratory epithelium cells.

Keywords: Mycoplasma pneumoniae; respiratory epithelium; gene expression; cytokines.

Аннотация

патогенный цитокин карцинома легкое

Для оценки патогенного действия Mycoplasma pneumoniae и CARDS-токсина проводили оценку экспрессии провоспалительных цитокинов TNF-a, IL-6, RANTES и IL-33. В исследованиях, проведенных in vitro, с использованием клеточной линии карциномы легких человека A549, установлено, что присутствие протеина А сурфактанта (SP-A) сопровождается увеличением уровней экспрессии TNF-a, IL-6, RANTES и снижением уровней экспрессии IL-33 клетками респираторного эпителия.

Ключевые слова: Mycoplasma pneumoniae; респираторный эпителий; экспрессия генов; цитокины.

Wstup. Mycoplasma pneumoniae jest jednym z czynnikow etiologicznych rozwoju pozaszpitalnego zapalenia pluc i astmy oskrzelowej u doroslych i dzieci. Patogenny mechanizm patogenow opiera si§ na zdolnosci mikroorganizmu do nawi^zania bliskiego kontaktu z komorkami nablonka oddechowego i wytwarzania toksycznych substancji dla komorek o dzialaniu metabolicznym. Jedn^ z tych substancji jest zespol zaburzen oddechowych nabytych przez spolecznosc Zespol stresu oddechowego zwi^zany z toksyny (CARDS) Mycoplasma pneumoniae oddzialuje z wysokim stopniem powinowactwa z bialkiem powierzchniowo czynnym A (SP-A) i ma bezposredni efekt cytopatyczny [6, 7].

Komorki nablonka oddechowego nalez^ do pierwszego poziomu ochrony, gdy s^ wprowadzane do organizmu przez Mycoplasma pneumoniae. Wytworzone przez nie cytokiny inicjuj^, wspieraj^ i reguhj reakcje odpornosci swoistej, maj^ce na celu eliminaj patogenu, a takze uczestnicz^ w wl^czaniu czynnikow specyficznej odpornosci do obrony immunologicznej [6].

Kluczowymi cytokinami w zapocz^tkowywaniu zapalenia i reakcji bakteriobojczych s^ cytokiny TNF-a i IL-6, ktore s^ wytwarzane przez rozne typy komorek (monocyty, makrofagi, limfocyty), w tym komorki nablonkowe drog oddechowych. Miejscowe wytwarzanie tych cytokin przez komorki nablonka oddechowego odgrywa znacz^c^ rol§ w patogennosci i wynikach zakazenia mykoplazm^, wi§c badanie ich produktow z aktywjcym dzialaniem Mycoplasma pneumoniae i toksyny CARDS moze znacz^co przyczynic si§ do zrozumienia mechanizmow reakcji zapalnych zwi^zanych z zakazeniem Mycoplasma pneumoniae [1]. Poniewaz Mycoplasma pneumoniae jest mikroorganizmem zwi^zanym z astm^ [9], a wplyw toksyny CARDS jest uwazany za dzialanie klasycznego alergenu [5], interesujpce jest badanie wytwarzania chemokiny RANTES i cytokiny IL-33, ktore sp wytwarzane przez komorki nablonkowe ukladu oddechowego i sp zwipzane z rozwojem chorob alergicznych i astma [2, 4]. RANTES bierze udzial w tworzeniu reakcji zapalnych zwipzanych z astmp poprzez aktywaj eozynofili i bazofili [2]. IL-33 ma zdolnosc indukowania wytwarzania cytokin, ktore stymulujp odpowiedz immunologicznp Tx2, ktora odgrywa kluczowp rol§ w wystppieniu i utrzymaniu zapalenia alergicznego [4].

Mycoplasma pneumoniae jako przewaznie zewnptrzkomorkowy patogen oddzialuje z plucem SPA. SP-A bierze udzial w modulowaniu odpowiedzi immunologicznych w plucach: promuje wejscie patogenow do fagocytow, stymuluje wewnptrzkomorkowp liz§, ogranicza aktywaj komorek dendrytycznych i limfocytow T, wplyw SP-A na wytwarzanie cytokin prozapalnych moze byc zarowno hamujpcy, jak i stymulujpcy. Badania in vitro wykazaly, ze SP-A jest zdolny do wipzania Mycoplasma pneumoniae i wywierania dzialania bakteriostatycznego [3, 8]. Jednak niewiele wiadomo na temat modulujpcego wplywu SP-A na wytwarzanie cytokin prozapalnych przez komorki nablonka p^cherzykowego in vitro, gdy Mycoplasma pneumoniae jest zakazona i dziala toksyna CARDS.

Cel badania: ocena wplywu Mycoplasma pneumoniae i toksyny CARDS na ekspresj^ cytokin prozapalnych przez komorki nablonka oddechowego in vitro, w celu okreslenia roli SP-A w manifestacji patogennych wlasciwosci Mycoplasma pneumoniae.

Materialy i metody. In vitro modelem stala si§ komorkowa linia raki pluc czlowieka A549 (Zrodlo: amerykanska kolekcja typowych kultur ATCC (CCL - 185)). Komorki hodowaly w flakonach z powierzchnip dla wzrostu 75 см2 w minimalnym поддерживающей srodowisku (MEM - Eagle, Sigma) z dodaniem 10% FBS i 1% rozczynu antybiotykow penicylina- streptomycyna (Sigma, 10000 Ед penicyliny i 10 mg streptomycyny na 1 ml 0,9% NaCl) przy 37°C w nawilzonej atmosferze z 5% CO2. Kiedy komorki osipgaly 80-90% konfluentnie, ich oddzielaly z powierzchni wzrostu przez obrobk§ 0,25% trypsyna i subkultura. Mycoplasma pneumoniae ATCC 15531 hodowaly w srodowisku dla mykoplazm (Thermo Scientific. Oxoid) w cipgu 2-3 tygodniow przy 37°C w nawilzonej atmosferze z 5% CO2. Kiedy srodowisko zmienialo kolor z czerwonnego na zolty, wzrost Mycoplasma pneumoniae byl uwazany za potwierdzone.

W eksperymentach zastosowano pasaze 9-10 komorek A549. Gdy komorki osipgn^ly 80-90% konfluencji w monowarstwach, wysiano je do 24- studzienkowych plytek w st^zeniu 5 x 105 komorek na studzienk^ i inkubowano przez 24 godziny w 37 ° C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2. Aby zainfekowac komorki A549, zastosowano zawiesiny Mycoplasma pneumoniae, ktore spelniajp standardy McFarland 0,5 U; 0,25 U i 0,1 U Czas trwania zakazenia komorek wynosil 4 godziny.

Wplyw rekombinowanej toksyny CARDS (rCARDS, MyBioSource, USA) oceniano przy st^zeniach 0,05; 0,5; 5 i 20 pg na 1 ml pozywki w studzience plytki komorkowej. Przezywalnosc komorek pod wplywem roznych dawek toksyny rCARDS oceniano w tescie z blзkitem trypanu.

Komorki A549 przeniesione na 24-studzienkowp plytkз inkubowano z 7 pg SP-A przez 30 minut w 37 ° C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2. Komorki nastзpnie zakazono Mycoplasma pneumoniae lub dodano toksynз rCARDS. 24, 48 i 72 godziny po infekcji A549 komorek Mycoplasma pneumoniae lub inkubacji z toksynp rCARDS, supernatanty hodowli komorkowej zebrano w celu oceny syntezy cytokin prozapalnych. Bufor do lizy RLT (Qiagen) dodano do kazdej studzienki 24- studzienkowych plytek do lizy komorek, pozniejszej ekstrakcji RNA i analizy genetycznej molekularnej ekspresji genow cytokin.

Calkowity RNA ekstrahowano z komorek A549 przy uzyciu zestawu RNeasy MiniKit (Qiagen, Germantown, MD, USA). Ilosc i jakosc wyizolowanego RNA oszacowano przez pomiar gзstosci optycznej roztworow RNA przy dlugosciach fali 260 nm i 280 nm przy uzyciu spektrofotometru NanoDrop ™ Spectrophotometer (ThermoFisher Scientific), obliczono stosunek absorbancji 260/280 nm. Rowne ilosci RNA (330 ng) poddano odwrotnej transkrypcji za pomocp zestawu syntezy cDNA RevertAid H Minus First Strand (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). 1 pl porcje otrzymanych jednoniciowych roztworow cDNA (16,5 ng) uzyto do PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR) przy uzyciu zestawu TaqMan Universal PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific) na systemie StepOnePlus Real-Time PCR (ThermoFisher Scientific ), calkowita objзtosc reakcji PCR wynosila 10 pl. Program amplifikacji: 50 ° C 2 minuty, 95 ° C 10 minut, 45 cykli w 95 ° C przez 15 sekund i 60 ° C przez 15 sekund.

Wzglзdnp ekspresjз genow cytokin TNF-a, RANTES, IL-6 i IL-33 oceniano przez porownanie CT (AACT) przy uzyciu GAPDH jako genu odniesienia. PCR-RV przeprowadzono stosujpc specyficzne startery i probki dla kazdego genu: TNF-a.

Hs01113624_g1 (Life Technologies), RANTES Hs00982282_m1 (Life Technologies), IL6 Hs00985639_m1 (Life Technologies), IL-33 Hs04931857_m1 (Life Technologies), IAP. Technologie).

Stзzenia TNF-a, RANTES, IL-6 i IL-33 (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) w supernatantach hodowli komorkowych oznaczono metodp ELISA zgodnie z instrukcjami dla zestawow producenta. Czulosc testow wynosila odpowiednio 5,5 pg / ml, 6,6 pg / ml, 0,7 pg / ml i 1,51 pg / ml.

Wszystkie warianty wplywu eksperymentalnego na komorki A549 powtarzano trzy razy, aby ocenic powtarzalnosc wynikow badania. Analizз statystycznp przeprowadzono za pomocp pakietu aplikacji Statistica 9. Mediana (Me) i zakres miзdzykwartylowy (Q25 / 75) zostaly wykorzystane do scharakteryzowania danych. Kryteria Manna-Whitneya wykorzystano do okreslenia znaczenia roznic miзdzy grupami. Korelaj analizowano za pomocp metody Spearmana. Wartosci p <0,05 okreslaly istotnosc statystycznp roznic we wskaznikach.

Wyniki i dyskusja. Zakazenie komorek A549 Mycoplasma pneumoniae potwierdzono przez wykrycie DNA mikroorganizmu przez PCR w komorkach A549 24, 48 i 72 godziny po wymianie pozywki i nie wykryto DNA Mycoplasma pneumoniae w komorkach kontrolnych. Przezycie komorek A549 24, 48 i 72 godziny po dzialaniu toksyny CARDS w roznych st^zeniach (0,05; 0,5; 5 i 20 pg) wynosilo 80% i wi^cej.

Badajqc morfologi^ komorek A549 w eksperymentach z Mycoplasma pneumoniae i toksyny CARDS, nie zaobserwowano takich objawow dzialania cytopatycznego, takich jak zaokrqglanie komorek, wzrost wielkosci jqder, wakuolizacja cytoplazmy i brak luk w monowarstwach. Komorki A549 zachowaly charakterystycznq morfologi^ nablonka szesciennego (postac otoczakow) z g^stymi kontaktami mi^dzykomorkowymi. Zaproponowany model interakcji Mycoplasma pneumoniae i toksyny CARDS z komorkami A549 wykorzystano do dalszego zbadania dzialania aktywujqcego mikroorganizmu i jego toksyny na komorki nablonka p^cherzykowego.

Zakazeniu komorek A549 Mycoplasma pneumoniae i dzialaniu toksyny CARDS w st^zeniach 0,05 i 0,5 pg / ml nie towarzyszyla ekspresja TNF-a i IL-6. Z kolei stymulacja komorek A549 toksynq CARDS w st^zeniach 5 i 20 pg / ml doprowadzila do wzrostu ekspresji TNF-a w porownaniu z komorkami kontrolnymi we wszystkich przedzialach czasowych, maksymalnie 24 godziny po aktywacji komorek toksyny CARDS.

Podczas stymulacji komorek toksynp w dawkach 5 i 20 pg / ml SP-A nie wywieral dzialania ochronnego, co skutkowalo zmniejszeniem produkcji TNF-a i IL-6. W przeciwienstwie do tego, ekspresja tych cytokin w preinkubacji komorek z SP-A, a nast^pnie dodaniem toksyny byla znacznie wyzsza niz w przypadku braku bialka. SP-A, ktory jest w stanie oddzialywac z toksynp CARDS, nasila jego dzialanie aktywujpce na komorki nablonka oddechowego, czemu towarzyszy wzrost produkcji TNF-a i IL-6.

Chemokina RANTES stala si§ najbardziej czulym markerem zakazenia Mycoplasma pneumoniae i dzialaniem toksyny CARDS na komorki A549. Ekspresja genu RANTES i produkcja bialka wzrastaly wraz z dzialaniem patogenu i jego toksyny. Poziomy RANTES korelowaly dodatnio ze st^zeniem Mycoplasma pneumoniae w przedziale czasowym 24 godzin po zakazeniu i dawkami toksyny (r = 0,738-0,963; p <0,05). Wst^pnemu dodaniu SP-A do pozywki do hodowli komorkowej towarzyszyl znaczny spadek ekspresji RANTES 24 godziny po zakazeniu Mycoplasma pneumoniae, wplyw toksyny CARDS zwi^kszony przez ekspresja RAnTeS.

Glowne zmiany w ekspresji genow i wytwarzaniu IL-33 obserwowano 48 godzin po zakazeniu Mycoplasma pneumoniae i dzialaniu toksyny CARDS. Uwalnianie IL-33 do supernatantow komorkowych wynosilo: 10,5 (9,75 / 13,75), 24,4 (22,2 / 30,0) i 60,0 (56,8 / 61,35) pg / ml gdy Mycoplasma pneumoniae jest zainfekowany w st^zeniach 0,1; McFarlanda 0,25 i 0,5, 18,5 (15,5 / 21,0), 34,6 (31,25 / 40,1), 68,0 (60,0 / 76,5) i 105,4 (90,45 / 129,7) pg / ml pod dzialaniem toksyny CARDS w st^zeniach 0,05; 0,5; Odpowiednio 5 i 20 pg / ml. St^zenia IL-33 dodatnio korelowaly ze st^zeniami Mycoplasma pneumoniae i CARDS-toksyny (r = 0,949-0,963; p <0,05).

Po inkubacji komorek A549 z SP-A i pozniejszym dzialaniu stymulujpcym Mycoplasma pneumoniae i toksyny CARDS, wydajnosc IL-33 w pozywce hodowlanej byla znacznie zmniejszona w porownaniu z eksperymentami bez wstзpnej inkubacji komorek z SP-A: 4,2 (3,95 / 5, 0), 8,6 (6,25 / 8,65) i 17,6 (15,9 / 19,85) pg / ml po zakazeniu zapaleniem pluc wywolanym przez Mycoplasma przy stзzeniach 0,1; MacFarland, 9,7 (8,15 / 10,25), 17,7 (16,2 / 21,95), 23,8 (16,15 / 30,9) i 56 , 0 (55,5 / 62,2) pg / ml pod dzialaniem toksyny CARDS w stзzeniach 0,05; 0,5; Odpowiednio 5 i 20 pg / ml.

Wnioski. Obecnosci w pozywce hodowlanej toksyny CARDS w stзzeniach 5 i 20 pg / ml towarzyszyl wzrost ekspresji TNF-a, IL-6, chemokiny RANTES, IL- 33 (p <0,05). Dzialaniu Mycoplasma pneumoniae pod nieobecnosc toksyny CARDS towarzyszyla zwiзkszona ekspresja RANTES, IL-33 (p <0,05). Wplywowi toksyny CARDS na preinkubacjз komorek A549 z SPA towarzyszyl wzrost ekspresji cytokin TNF-a, IL-6 i zmniejszenie wytwarzania IL-33 (p <0,05). Wplyw SPA na ograniczanie wytwarzania IL-33 moze byc znaczpcy w zmniejszaniu ryzyka reakcji alergicznej po zakazeniu Mycoplasma pneumoniae.

Referencje

1. Bai, D. The effect of down-regulation of CCL5 on lipopolysaccharide-induced WI-38 fibroblast injury: a potential role for infantile pneumoniae / D. Bai, A. Han, S. Cong // Iran J Basic Med Sci. - 2018. - Vol. 21, № 5. - P. 449-454.

2. Differential chemokine expression patterns in tonsillar disease / M. Mandapathil [et al.] // Acta Otorhinolaryngol Ital. - 2018. - Vol. 38, № 4. - P.316322.

3. Mast cell TNF receptors regulate responses to Mycoplasma pneumoniae in surfactant protein A (SPA) mice / B.J. Hsia [et al.] // American Academy of Allergy, Asthma & Immunology. - 2012. - Vol. 130, Issue 1. - P. 205-214.

4. Molofsky, A.B. Interleukin-33 in tissue homeostasis, injury and inflammation / A.B. Molofsky, A. Savage, R.M. Lockley // Immunity. - 2015. - Vol. 42, № 6. - P. 1005-1019.

5. Mycoplasma pneumoniae CARDS toxin induces pulmonary eosinophilic and lymphocytic inflammation / J.L. Medina [et al.] // Am J Respir Cell Mol Biol. - 2012. - Vol. 46, № 6. - P. 815-822.

6. Parrott, G.L. A compendium for Mycoplasma pneumoniae [Electronic resource] / G.L. Parrott, T. Kinjo, J. Fujita // Front Microbiol. - 2016. - Vol. 7. - Article 513. - Date of access: 11.12.2018.

7. Structure of CARDS toxin, a unique ADP- ribosylating and vacuolating cytotoxin from Mycoplasma pneumoniae / A. Becker [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2015. - Vol. 112, № 16. - P. 5165-5170.

8. Surfactant protein-A inhibits Mycoplasma- induced dendritic cell maturation through regulation of HMGB-1 cytokine activity / J.G. Ledford [et al.] // J Immunol. - 2010. - Vol. 185, № 7. - P. 3884-3894.

9. Yin, S.S. Association of Mycoplasma pneumonia infection with increased risk of asthma in children / S.S. Yin, F.L. Ma, X. Gao // Exp Ther Med. - 2017. - Vol. 13, № 5. - P. 1813-1819.

Размещено на Allbest.ru