Особливості сполучно-тканинного синтезу NF-KB-залежних протеїнів у стадію ремоделювання опікової рани шкіри щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

ОСОБЛИВОСТІ СПОЛУЧНО-ТКАНИННОГО СИНТЕЗУ ОТ-КВ-ЗАЛЕЖНИХ ПРОТЕЇНІВ У СТАДІЮ РЕМОДЕЛЮВАННЯ ОПІКОВОЇ РАНИ ШКІРИ ЩУРІВ

Натрус Л.В. доктор медичних наук, професор, Національний медичний університет імені О. О.Богомольця

Мироненко О.І. Національний медичний університет імені О. О.Богомольця

Панова Т.І. доктор медичних наук, професор, Національний медичний університет імені О. О.Богомольця

Лабудзинський Д.О. Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України Л.В.Натрус1, О.І.Мироненко1, Т.І.Панова1, Д.О.Лабудзинський2

¹ Національний медичний університет імені О.О.Богомольця, Київ 2Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ

Анотація. Проведені дослідження динаміки (3,7,14,21 доба) гоєння опікової рани (площа термічного ушкодження шкіри складала 18-20 % поверхні тіла), шкіри білих статевозрілих щурів-самців лінії Вістар масою 180-210 г. Було вивчено в тканині регенерату вміст фосфорильованої за Ser 311 субодиниці p65 ядерного фактору каппа B (NF-kB) субодиниці ІкВ-а, фактору росту судинних ендотеліальних клітин (VEGF) рецептору VEGF (Flt-1) мієлопероксидази -МРО, індуцибельної NO-синтази - iNOS та нітрозильованих протеїнів які досліджувалися методом Вестерн-блот аналізу, та виконувався підрахунок формених елементів периферичної крові (ПК).

Загоєння рани є складним, багатокомпонентним процесом, механізми регулювання якого постійно досліджуються для визначення напрямків найбільш ефективного терапевтичного впливу. Пошкодження тканини є ініціювальним фактором, що призводить до активації системи гемостазу за рахунок вивільнення тканинних факторів зсідання крові, продуктів розпаду клітин, а також до розвитку гострого запалення за рахунок ключової події - контакту імунних клітин-резидентів (дендритні клітини, тканинні макрофаги) з PAMPs та/або DAMPs [1]. Таким чином, перша стадія загоювання рани включає формування первинного провізорного (тимчасового) матриксу на основі кров'яного згустку та розвиток запальної реакції із закономірною послідовністю появи клітин-емігрантів у ділянці пошкодження [2, 3]. Наступна стадія проліферації розпочинається після елімінації флогогенного чинника та видалення тканинного детриту фагоцитами із розщепленням первинного матриксу - з фібрину та фібронектину - за рахунок секреції активатору плазміногену та матриксних металопротеїназ переважно моноцитами/макрофагами [4, 5].

«Нашаровування» між собою стадій загоювання рани, участь великої кількості клітин, складність біохімічного різноманіття цитокінів, медіаторів, ферментів потребує інтегрального підходу та пошуку універсальних механізмів регуляції цього процесу. На клітинному рівні саме ядерний транскрипційний фактор каппа-B (NF-kB) відіграє важливу роль у цільній ланці подій: синтезу прозапальних цитокінів, адгезивних молекул, хемотаксинів, вільних радикалів та інших медіаторів; клітинному поділі та проліферації; активації експресії генів циклінів та циклін- залежних кіназ; активації гіпоксієіндуцибельного фактору-1 (HIF-і) та, як наслідок, судинного ендотеліального фактору росту (VEGF); у регулюванні апоптозу, клітинних програм виживання та старіння [6, 7].

При класичному (канонічному) шляху індукції NF-kB, наприклад, під дією LPS або TNFa, через низку проміжних факторів відбувається активація ІкВ-кінази (ІКК), що фосфорилює інгібіторну субодиницю ІкВ-a, яка зазнає убіквітинування та деградації шляхом протеасомного протеолізу, а NF- kB вивільнюється, фосфорилюється (р65 субодиниця за залишком Ser311) та транслокується в ядро, де активує експресію низки генів, у тому числі - ІкВ-a та протеїну А20, який інгібує активність ІКК. Таким чином існують механізми негативного зворотного зв'язку для запобігання надмірної активації NF-kB [8, 9].

Одним із визначальних факторів «успішності» загоєння є неоваскуляризація. Основними джерелами VEGF є тканинні макрофаги, моноцити, нейтрофіли та епітеліальні клітини [10, 14].

Лейкоцити можуть стимулювати неоангіогенез шляхом доставки проангіогенних попередників факторів росту (VEGF-A), а також шляхом синтезу металопротеїназ, які деградують компоненти екстрацелюлярного матриксу, сприяючи вивільненню та активації факторів росту [11, 12]. Активація нейтрофілів супроводжується посиленням їхньої фагоцитарної функції, продукуванням вільних радикалів за рахунок активації мієлопероксидази (MPO) та індуцибельної NO-синтази (iNOS), лізосомальних ферментів, цитокінів та інших медіаторів, що відіграють велике значення у процесі загоювання рани. При цьому, збільшення рівня 3-нітротирозину в поліпептидах тканини є індикатором посиленого утворення NO та/або вільних радикалів та активації лейкоцитів відповідно [13].

Метою дослідження було вивчення особливостей синтезу NF-kB-залежних протеїнів в регенераті сполучної тканини шкіри у стадію ремоделювання тканини, при загоєнні опікової рани у щурів.

Матеріали та методи

Дослідження динаміки процесу загоювання опікової рани шкіри проводили на 3, 7, 14, 21 добу після моделювання опіку на шкірі білих статевозрілих щурів-самців лінії Wistar (n=24), вагою 180-210 г, без соматичної патології.

Усі маніпуляції з піддослідними тваринами проводили з дотриманням загальноприйнятих біоетичних норм гуманного поводження з лабораторними тваринами у відповідності до міжнародних та національних положень стосовно проведення експериментів із залученням тварин: «Європейська конвенція про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1986); «Загальні етичні принципи проведення експериментів на тваринах» (Україна, 2001 р.), Закон України «Про захист тварин від жорстокого поводження» № 3447-IV (Україна, 2006), засідання Комісії з біоетики НМУ (протокол №94 від 16.03.2016).

Під дією ефірного наркозу моделювали опік шляхом прикладання двох гарячих мідних пластин у вигляді еліпсу, розміром 3,7х4,5 см і площею 0,0052 м² на оголену шкіру спини з експозицією 10 секунд. Загальна площа опіку шкіри складала 1820 % поверхні тіла, що є цілком достатнім для формування опіку ІІ ступеня - дермального поверхневого опіку. У вказані термін (на 3, 7, 14, 21 добу) щурам одноразово інтраперитоніально робили ін'єкцію летальної дози тіопенталу натрію і виводили з експерименту шляхом декапітації.

Підрахунок формених елементів периферичної крові шляхом візуальної оцінки мазку крові за стандартною методикою та за допомогою гематологічного аналізатора MicroCC.

В тканині регенерату методом Вестерн-блот аналізу визначали вміст фосфорильованої за Ser 311 субодиниці p65 ядерного фактору каппа-B (NF-kB), IkB-ц, фактору росту судинних ендотеліальних клітин (VEGF) та рецептору VEGF (Flt-1), індуцибельної NO-синтази (iNOS, мієлопероксидази (MPO) та 3-нітропротеїнів. Для приготування зразків фрагменти шкіри (200-250 мг) подрібнювали у порцеляновому тиглі і розтирали за присутності рідкого азоту до гомогенного стану. Наважки тканин шкіри (100 мг) змішували з буфером екстракції протеїнів RIPA (20 мМ трис-HCl, рН 7,5; 1% тритону Х-100, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЕДТА, 1% дезоксихолату натрію, 20 мМ Tris-HCl, рН 7,6; 1% Triton-X100, 150 мМ NaCl, 50 мМ NaF, 0,2% ДСН) у співвідношенні 1:10 (вага/об'єм) та коктейлем інгібіторів протеїназ і фосфатаз (PIC), інкубували на льоду протягом 20 хв та піддавали ультразвуковій дезінтеграції за допомогою приладу Sartorius (Labsonic® М, ФРН). Отримані гомогенати центрифугували при 16 тис. g протягом 20 хв. за 4 ^оС. Після центрифугування надосадову рідину збирали та переносили до пластикових пробірок Eppendorf. Концентрацію загального протеїну вимірювали спектрофотометрично за методом Stoscheck з модифікаціями, використовуючи спектрофотометр СФ-2000 (ОКБ «Спектр», РФ). Протеїнові екстракти змішували з буфером Леммлі (150 мМ трис-HCl (pH 6.8), 1% SDS, 0,3% бромфеноловий синій, 20% гліцерил) та проварювали при 95^оС протягом 5 хв. для подальшого зберігання.

Електрофоретичне розділення протеїнів зразків шляхом електрофорезу у поліакриламідному гелі (SDS-PAGE електрофорез) проводили у вертикальній камері BioRad (США), використовуючи електродний буфер (25 мМ трис- НСІ (рН 8,3); 0,192 М гліцину, 0,1% SDS). Кількість загального протеїну, що вносили до лунок гелю, становила 50 мкг. Концентрування зразків проводили при напрузі, що не перевищувала 50 В, розділення - 160 В. Для ідентифікації молекулярних мас протеїнів використовували суміш забарвлених протеїнових маркерів (PageRuler, кат. № 26616, Fermentas, Литва).

Перенесення протеїнів з гелю до нітроцелюлозних мембран (діаметр пор 0.45 мкм, GE Healthcare, Amersham, Велика Британія) проводили у трансфер-буфері (12,5 мМ трис-HCl буфер (рН 8,3); 0,198 М гліцин та 20 % метанол) протягом 60 хв. при напрузі 30 В і постійному охолодженні. Після завершення трансферу протеїнів мембрани відмивали від залишків буферу у 50 мМ фосфатному фізіологічному буфері, що містив 0,05 % Triton X-100 (PBST) (рН 7,4). Блокування місць неспецифічної сорбції антитіл проводили у 5%-му розчині знежиреного сухого молока (Carnation, США) у PBST протягом 120 хв. при кімнатній темературі. Після блокування мембрани інкубували зі специфічними антитілами проти VEGF (Merck, ФРН, кат. № 05-1117, 1:2000 у PBST), фосфорильованої за Ser 311 субодиниці p65 NF-kB (Santa Cruz, США, 1:200 у PBST), ІкВ-а (Santa Cruz, США, 1:500 у PBST) та Flt-1 (Santa Cruz, США, 1:500 у PBST), протягом 16 год. при 4 ^оС. Далі мембрани промивали на горизонтальному шейкері у 6 змінах PBST по 5 хв. кожна, після чого інкубували 90 хв. при кімнатній температурі з відповідними вторинними антитілами, кон'югованими з пероксидазою хрону (anti-mouse IgG 1:5000, Abcam, США, кат. № ab197767 або antirabbit IgG (H+L)-HRP conjugate 1:2500, Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Неспецифічно сорбовані вторинні антитіла відмивали у 6 змінах того ж буферу. Детекцію комплексів антиген-антитіло проводили за допомогою методу підсиленої хемілюмінесценції (ECL), використовуючи 0,25 М розчин люмінолу у ДМСО, 0,09 М розчин кумарової кислоти у ДМСО, 0,1 М трис (рН 8,5) та 0,0035 % Н2О2. Візуалізацію специфічного забарвлення здійснювали на рентгенівських плівках Konica Minolta (Medical & Graphic, Inc, Японія). Отримані плівки сканували для проведення кількісного денситометричного аналізу з використанням програми TL-120 (TotalLab Ltd., США). Відносний вміст фосфоОТ-KB p65, IkB-o, VEGF, Flt-1, iNOS, MPO та 3-нітропротеїнів виражали в умовних одиницях оптичної густини (arbitrary units).

Статистичну обробку даних проводили за допомогою статистичного пакету IBM SPSS Statistics 23. Розраховували коефіцієнт Пірсона (R), з р-значенням, що відповідає 95%-ому довірчому інтервалу для коефіцієнта кореляції. Для перевірки розподілу на нормальність використано критерій Шапіро-Уілка. Для порівняння показників на всіх термінах спостереження було використано критерій множинного порівняння - критерій Шеффе.

Результати дослідження

Обрані періоди для дослідження показників відповідали сучасним уявленням процесу загоювання ран, коли на 3 добу припадає завершення стадії запалення та розпочинається проліферація, на 7 добу - на тлі проліферації розпочинається стадія ремоделювання, на 14 добу - стадія проліферації добігає кінця, а процес відновлення архітектоніки тканини набуває активності, на 21 добу - завершується активне ремоделювання тканини з формуванням щільного сполучнотканинного рубця [1, 2].

В наших попередніх роботах була наведена динаміка рівню фосфорильованої за Ser311 субодиниці p65 ядерного транскрипційного фактору каппа-B (рNF-кB), його інгібувальної субодиниці iKB-a, вмісту судинного ендотеліального фактору росту VEGF, його рецептору VEGFR-1 (Flt-1) в сполучнотканинному регенераті опікової рани у динаміці на 3, 7, 14, 21 добу [15]. Ми визначали суттєве та достовірне підвищення рNF-кB, VEGF та Flt-1 в період з 14 до 21 добу. При вивченні динаміки кількості клітин периферичної крові ми також виявидли достовірне підвищення вмісту нейтрофілів та моноцитів саме в цей період [16].

Вивчення динаміки рівня індуцибельної NO- синтази (iNOS) (Рис.1,А) у тканинному регенераті у процесі загоювання опікової рани показав максимальний рівень iNOS на 7 добу, із поступовим зменшенням вмісту протеїну, який на 21 добу був в 2,8 разів нижчим за показник 7 доби (р<0,05). Досліджено коливання вмісту 3-нітрозильованих протеїнів (3-nitrotyrosine peptides) (Рис.1, Б) у сполучнотканинному регенераті тканини виявило максимальний рівень нітрозильованих пептидів на 3 добу, із поступовим зниженням на 7 та 14 (р<0,05), і підвищенням майже до початкового максимального значення на 21 добу (р<0,05).

Дослідження динаміки рівня мієлопероксидази (МРО) (Рис.1,В) виявило зменшення на 14 добу (р<0,05); на 21 добу відзначалося зростання концентрації МРО в тканині майже у 6 разів відносно 14 доби (р<0,05).

Ми провели кореляційний аналіз за коефіцієнтом кореляції Пірсона динаміки визначених показників тканинного регенерату для виявлення можливих взаємозв'язків та дослідження ймовірних механізмів їхньої регуляції (рис.2).

При вивченні динаміки вмісту вказаних протеїнів протягом усього періоду загоєння рани було визначено що показники регуляторної системи р№-кВ/ІкВ-a та вміст NF-kB -залежних протеїнів в сполучнотканинному регенераті рани має характерні особливості саме у стадію ремодуляції тканини з 14 до 21 доби спостереження. В цей термін вміст фосфорильованої форми ядерного фактору р№-кВ несподівано достовірно (р<0,05) підвищувався в 1,4 рази, вміст його гальмівної одиниці ІкВ-а відповідно достовірно (р<0,05) знижувався також в 1,4 рази. Рівень в сполучнотканинному регенераті VEGF в цей термін спостереження достовірно (р<0,05) підвищувався в 1,6 рази, а рівень його рецептора Flt-1 підвищувався(р<0,05) в 10 разів. Продукція МРО в сполучнотканинному регенераті в стадії ремоделювання тканини також підвищувалася в 5,8 разів, що корелювало із відносною кількістю нейтрофілов ПК R=0,611, (p<0,01) та відносною кількістю моноцитів ПК R=0,667, (p<0,01). Також в цей термін спостереження підвищувався в 1,6 рази (р<0,05) рівень нітрозильованих протеїнів, але продукція 1NOS зменшувалася в 2 рази (р<0,05). За даними візуального спостереження загоєння рани проходило успішно у всіх тварин в жодного із щурів не спостерігалось погіршення загального стану та вигляду рани, що дає підставу стверджувати про відсутність приєднання бактеріальної флори та інфекційного загоєння.

В попередніх роботах ми висловлювали думку відносно можливості існування різнорівневого регуляційного ланцюга, який виникає в нормальних фізіологічних умовах і забезпечує ангіогенез: ядерний фактор pNF-кВ через продукцію факторів росту мієлоїдних попередників в кістковому мозку регулює проліферацію нейтрофільних гранулоцитів та їх вихід із кісткового мозку до ПК. Нейтрофіли, шляхом хемотаксису, потрапляють до пошкодженої ділянки опікової рани експресують ендотеліальні ростові фактори та регулюють експресію рецепторів до вказаних лігандів в сполучнотканинному регенераті, що є базою регульованого ангіогенезу.

Одже, зниження експресії р№-кВ з 3 по 7 добу спостереження є закономірним, адже саме на цей період при неускладненому перебігу загоювання опікової рани припадає завершення власне запальної стадії (альтеративних та ексудативних явищ) в осередку ушкодження та прогресує стадія проліферації з формуванням грануляційної тканини. Як відомо, однією з ключових подій, що «переключає» прозапальні реакції на протизапальні під час проліферації, є поляризація макрофагів, тобто перехід МІ-фенотипу в М2-фенотип [1, 14]. Однак, подальше дослідження динаміки вмісту р№-кВ у тканинному регенераті виявило його парадоксальне, на перший погляд, зростання з 7 на 14, а особливо - з 14 на 21 добу спостереження. При цьому, ознак приєднання інфекційного процесу та інших ускладнень перебігу загоювання рани не спостерігалося (Рис.3), що дає можливість припустити наявність у регуляторного протеїну NF-кВ іншої ролі ніж відома «традиційна» прозапальна функція, але вона активується у стадію ремоделювання тканини з 14 по 21 добу.

Виявлено, що динаміка збільшення вмісту нейтрофілів у тканині під час ремоделювання має виражений позитивний кореляційний зв'язок з продукцією VEGF. Однак, активний неоангіогенез є характерним для стадії проліферації під час формування грануляційної тканини. До того ж, при типовому перебігу загоювального процесу під час стадії ремоделювання спостерігається зниження числа капілярів при заміщенні тканини сполучнотканинним рубцем. Таким чином, на нашу думку, метою збільшення VEGF є «повторне» залучення нейтрофілів до осередку загоювання, оскільки нейтрофіли, як було показано раніше, мають рецептори VEGFR 1 [17]. Ще однією можливою функцією VEGF на цьому етапі є посилення та модуляція лімфоангіогенезу, адже утворення лімфатичних судин, що сліпо починаються в тканині, потребує завершення формування архітектоніки позаклітинного матриксу, а це припадає саме на стадію ремоделювання опікової рани.

Отже, ми вважаємо, що «повторне» залучення до осередку загоювання нейтрофілів з активацією фагоцитозу та їхньої мієлопероксидазної функції, а також переважання в тканині М2-макрофагів у стадії ремоделювання забезпечує функцію елімінації продуктів розпаду колагену вторинного провізорного матриксу (грануляційної тканини) з наступним їх кліренсом шляхом модуляції та завершення лімфоангіогенезу. Очищення рани призводить до повного зникнення PAMPs та DAMPs (якими можуть виступати самі продукти розпаду колагену) [18]. За їх відсутності нові нейтрофіли, що находять під впливом VEGF, не активуються (тому і не виявлено явища гострого запалення) та гинуть апоптозом. Апоптичні тільця поглинаються макрофагами, що приводить до інгібування запальної та імунної відповіді та завершення ремоделювання тканини з формуванням щільного рубця.

Між pNF-кВ та iNOS у тканинному регенераті було продемонстровано значний зворотньопропорційний лінійний кореляційний зв'язок. Вважаємо, що зменшення вмісту iNOS у регенераті тканини з 14 по 21 добу спостереження свідчить про зменшення кількості «класично активованих» МІ-макрофагів та переважання субпопуляції «альтернативно активованих» М2- макрофагів. А це співпадає з виявленим зростанням активності NF-кВ у цей період. Таким чином, можна зробити висновок, що індукція NF-кВ сприяє протизапальній функції у М2-макрофагів.

Цікаво, що зі зменшенням експресії iNOS у тканинному регенераті у стадію ремоделювання вміст продуктів нітрозилювання (3-нітропротеїдів) парадоксально збільшувався, що говорить про активність вільнорадикальних реакцій, але джерелом яких вірогідно виступає мієлопероксидаза нейтрофілів. І, дійсно, між МРО та 3-нітропротеїдами виявлено значний кореляційний зв'язок (R=0,875, p<0,05). Тому зростання експресії МРО нейтрофілів у тканинному регенераті у стадію ремоделювання ми розцінюємо не тільки як свідчення активації фагоцитозу для елімінації компонентів позаклітинного матриксу та відновлення архітектоніки дерми, але й цілеспрямований механізм активації та/або модуляції протеолізних протеїнів шляхом їхнього нітрозилювання - у першу чергу, низки металопротеїназ.

Ми виявили, що динаміка Flt-1 у тканинному регенераті опікової рани позитивно корелювала із вмістом VEGF та МРО, що вкотре підкреслює провідну роль нейтрофілів в ангіогенезі під час усіх етапів загоювання опікової рани.

Таким чином, ми припускаємо, що при типовому перебігу процесу загоювання опікової рани з 14 по 21 добу, за відсутності ознак інфікування, створюються оптимальні умови для завершення ремоделювання рани та відновлення архітектоніки дерми шляхом ефективного фагоцитозу та лімфоангіогенезу, при якому прибираються та дренуються продукти деградації провізорного матриксу та надлишки фіброзної тканини. Збільшення вмісту NF-kB у сполучнотканинному регенераті, за нашими даними, збільшується, можна говорити про ефект перемикання («switch») прозапальних властивостей цього транскрипційного фактору на протизапальні, репаративні (Рис.4).

Рис. 1. Вміст рКБ-кБ-залежних протеїнів у регенераті сполучної тканини шкіри щурів в динаміці загоювання опікової рани (3,7,14,21 доба). (1) Гістограма вмісту протеїніА в ум.од. (Л) iNOS, (Б) 3-nitrotyrosine, (В) MPO. (2) Імуноблотограма. * різниця порівняно зі значенням в попередній термін (Р<0,001).

Табл. 2. Таблиця значень коефіцієнта Пірсона, розрахованого при аналізі кореляційних зв'язків між показниками

Рис.3. Зовнішній вигляд опікової рани щурів в динаміці загоєння (3,7,14,21 доба).

Рис.4. Імовірна схема реалізації протизапальних та репаративних ефектів NF-kB внаслідок перемикання («switch») його функцій у стадію ремоделювання з 14 по 21 добу загоювання опікової рани.

Література