Частота полиморфизмов генов CYP2C19 И ABCB1, ассоциированных с изменением антиагрегантного действия клопидогрела, у русских и бурят

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова

Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования

Частота полиморфизмов генов CYP2C19 И ABCB1, ассоциированных с изменением антиагрегантного действия клопидогрела, у русских и бурят

Е.Ю. Китаева, В.В. Шпрах

К.Б. Мирзаев, К.А. Рыжикова

Г.Н. Шуев, Ж.А. Созаева, В.В. Когай

Ю.А. Пименова, Д.А. Сычев

Москва, Иркутск, Российская Федерация

Аннотация

Цель исследования. Изучить частоту полиморфизмов генов CYP2C19 и ABCB1, ассоциированных с изменением антиагрегантного действия клопидогрела, у русских и бурят Прибайкалья.

Материал и методы. Определяли полиморфизмы CYP2C19*2 (681G>A, rs4244285), CYP2C19*3 (363G>A, rs4986893), CYP2C19*17 (-806C>T, rs12248560) и ABCB1 (3435C>T, rs1045642) у 250 здоровых добровольцев из числа представителей двух этнических групп, проживающих на территории Прибайкалья (136 русских, 114 бурят). Носительство полиморфных маркеров генов определялось методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Полученные результаты исследования сравнили с данными литературы, поиск которых осуществлялся в базах PubMed, Medline, e-Library, CyberLeninka, Google Scholar.

Результаты. Достоверных различий в частоте CYP2C19*2 (681G>A) между русскими и бурятами не обнаружено. Разница частоты остальных полиморфизмов гена CYP2C19 у русских vs бурят была статистически значима: CYP2C19*3 (363G>A) встречался только у бурят - 9,2% (р<0,0001), частота CYP2C19*17(-806C>T) у русских составила 26,8% vs бурят - 6,1% (р<0,0001). Для гена ABCB1 достоверных различий в частоте полиморфизма ABCB1 (C3435T) в изучаемых этнических группах не обнаружено. Частота носительства среди бурят как минимум одной аллели CYP2C19*3 (*1/*3+*3/*3) составила 17,55% (p<0,0001). Носителями как минимум одной «быстрой аллели» CYP2C19*17 (*1/*17+*17/*17) среди русских составила 45,6% vs среди бурят - 11,4% (p<0,0001).

Заключение. Получены статистически значимые различия частоты CYP2C19*3, CYP2C19*17, ассоциированные с изменением антиагрегантного действия клопидогрела, между этническими группами русских и бурят Прибайкалья, что является важным для разработки персонализированного подхода к антиагрегантной терапии в рамках первичной и вторичной профилактики сердечно-сосудистых заболеваний в этих этнических группах с целью повышения эффективности и безопасности фармакотерапии.

Ключевые слова: фармакогенетика, ген CYP2C19, ген ABCB1, полиморфизм, клопидогрел, этнические, русские, буряты.

Annotation

Frequency of CYP2C19 and ABCB1 genes polymorphisms, associated with the change, caused by clopidogrel antiagregant among the Russians and the Buryats

The aim of the research. To study the frequency of CYP2C19 and ABCB1 genes polymorphisms, associated with the change, caused by clopidogrel antiagregant among the Russians and the Buryats of the Baikal region.

Material and methods. Polymorphisms CYP2C19 * 2 (681G> A, rs4244285), CYP2C19 * 3 (363G> A, rs4986893), CYP2C19 * 17 (-806C> T, rs12248560) and ABCB1 (3435C> T, rs1045642) were determined in 250 healthy voluntary representatives of two ethnic groups, residing on the territory of the Baikal region (136 Russians, 114 Buryats). The carriage of polymorphic genes markers was determined in real time by polymerase chain reaction method. The obtained results of the research were compared with the literature data, that were searched in PubMed, Medline, e-Library, CyberLeninka, Google Scholar databases. Results. There were no significant differences in the frequency of CYP2C19* 2 (681G> A) among the Russians and the Buryats. The difference in the frequency of other CYP2C19 gene polymorphisms in the Russians vs the Buryats was statistically significant: CYP2C19 * 3 (363G> A) was found only in the Buryats - 9.2% (p<0.0001), CYP2C19 * 17 (-806C> T) frequency in the Russians was 26.8% vs the Buryat - 6.1% (p<0.0001). As for ABCB1 gene, there were no significant differences in the incidence of ABCB1 (C3435T) polymorphism in the studied ethnic groups. The frequency of carriage among the Buryats at least one allele of CYP2C19 * 3 (* 1 / * 3 + * 3 / * 3) was 17.55% (p<0.0001). Carriers of at least one “fast allele” CYP2C19 * 17 (*1 / * 17 + * 17 / * 17) among the Russians were 45.6% vs among the Buryats - 11.4% (p<0.0001).

Conclusion. Statistically significant differences in CYP2C19 * 3, CYP2C19 * 17 frequency, caused by clopidogrel antiagregant, between ethnic groups of Russian and Buryat population of the Baikal region were obtained, which is important for personalized approach development of antiagregant therapy in terms of primary and secondary prevention of cardiovascular diseases in these ethnic groups in order to increase the effectiveness and safety of pharmacotherapy.

Key words: pharmacogenetics, CYP2C19gene, ABCB1gene, polymorphism, clopidogrel, ethnic, the Russians, the Buryats.

Введение

Фармакогенетика в настоящее время является одной из самых прогрессивно развивающихся и перспективных разделов клинической фармакологии. Прикладное использование фармакогенетики в клинической практике основано на том, что развитие нежелательных лекарственных реакций (НПР) и неэффективность лекарственной терапии приблизительно на 50% зависит именно от генетических особенностей пациента [1]. Основной задачей фармакогенетики является изучение аллельных вариантов генов, определяющих особенности индивидуальных фармакокинетических и фармакодинамических характеристик организма с целью оптимизации стратегии индивидуальной лекарственной терапии [2].

На сегодняшний день большое количество исследований в области фармакогенетики посвящено изучению генов, кодирующих ферменты, метаболизирующие лекарственные препараты, применяемые для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Проблема применения клопидогрела, как одного из основных препаратов антитромботической терапии, заключается в вариабельности терапевтического ответа: процент пациентов со сниженной терапевтической эффективностью колеблется от 20 до 40% [3]. Другая не менее важная проблема - развитие геморрагических осложнений. По сообщениям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), геморрагические осложнения составили 28% случаев всех сообщений, связанных с НПР при применении клопидогрела [4, 5].

Наибольший вклад в метаболизм и изменение антиагрегантного действия клопидогрела осуществляют полиморфные варианты цитохрома СУР2С19 (CY-P2C19*2, CYP2C19*3, CYP2C19*17) и транспортный белок Р-гликопротеин, кодируемых геном АВСВ1 [6]. Клопидогрел является пролекарством, нуждающимся в биоактивации в организме человека. Для носителей CYP2C19*2, CYP2C19*3 характерно образование низких концентраций активного метаболита клопидогрела, что проявляется развитием клинической «резистентности» к терапии при стандартном режиме дозирования и высокой остаточной реактивностью тромбоцитов. У носителей аллели CYP2C19*17, наоборот, отмечается, повышение ферментативной активности CYP2C19, что может оказаться причиной высокой концентрации активного метаболита в плазме крови, низкой остаточной реактивности тромбоцитов и риском развития геморрагических осложнений [5, 7]. CYP2C19 участвует в метаболизме более 8% всех известных лекарственных средств, среди которых антидепрессанты, транквилизаторы, противоэпилептические и антипсихотические лекарственные средства, ингибиторы протонной помпы, бета-адреноблокаторы, антибактериальные, противогрибковые препараты, которые могут выступать в роли субстратов, конкурирующих за цитохром CYP2C19, ингибиторов или индукторов CYP2C19, тем самым оказывая влияние на активность изоферментов цитохрома. Таким образом, при прогнозировании эффективности и безопасности фармакотерапии, в том числе клопидогрелом, необходимо учитывать межлекарственное взаимодействие и влияние сопутствующей лекарственной терапии на ферменты биотрансформации и белки-транспортеры [7]. Р-гликопротеин является представителем семейства АВС-транспор- теров, участвующих в трансмембранном транспорте ксенобиотиков, в том числе клопидогрела. Изменение активности гена ABCB1 влияет на эффективность клопидогрела [8, 9, 10, 11]. Известно, что у носителей генотипа ТТ, получающих клопидогрел, отмечалась более высокая частота тромботических осложнений по сравнению с носителями генотипа СС [12].

Частота генотипов CYP2C19 и АВСВ1 зависит от расовой и этнической принадлежности. Поэтому фармакогенетические исследования должны включать изучение этнических особенностей распространения полиморфизмов клинически значимых генов, и нельзя без дополнительной проверки экстраполировать данные, полученные на группах с другим этническим составом [7]. Известны не только расовые, этнические, но и географические различия в частоте встречаемости полиморфизмов [8, 13].

Формирование населения Прибайкалья длилось на протяжении многих веков. В У1-Х вв. н.э. на берегах Байкала, рек Ангары и Лены, в Тункинской долине проживали курыканы - наиболее многочисленный народ из древнего тюркского племени. По мнению известного историка А. П. Окладникова, в XI в. монгольские кочевые племена переселились на эти территории, ассимилировали курыкан и стали предками бурят, о чем свидетельствует наличие в бурятском языке большого количества тюркских слов и географических названий. На территории Прибайкалья проживали буряты, эвенки и тофалары. Буряты составляли большую часть населения. В XVII в. численность населения значительно увеличилась за счет естественного прироста и миграции из Европейской части России.

Во второй половине XIX в. население выросло в два раза. Две трети населения составляли русские и одну треть - буряты, эвенки и тофалары [14]. В Восточной Сибири миграция населения имела низкую интенсивность, однако отсутствие тесных межэтнических контактов, обусловленное территориальной разобщенностью, привело к накоплению значительных межпопуляционных различий [15]. Именно поэтому актуальным для многонациональной страны, как Российская Федерация, является изучение частоты клинически значимых полиморфизмов гена CYP2C19 и генов белков-транспортеров в разных этнических группах. Результатом выявления таких различий может стать разработка методических рекомендаций для врачей в отдельно взятом регионе РФ [5].

Целью исследования явилось определение частоты полиморфизмов гена CYP2C19 - CYP2C19*2 (68Ю>А, Ы244285), CYP2C19*3 (363G>A, 4986893), CYP2C19*17 (-806С>%, 2248560) и гена ABCB1 (3435С>Т, п1045642), ассоциированных с изменением антиагрегантного действия клопидогрела, в двух наиболее многочисленных этнических группах Прибайкалья (русских и бурят).

Материал и методы

Изучаемая популяция. В исследовании приняли участие 250 здоровых добровольцев из числа представителей двух наиболее многочисленных этнических групп, проживающих на территории Иркутской области и Республики Бурятия: 136 русских (26 мужчин (19,1%) и 110 женщин (80,9%)) и 114 бурят (34 мужчины (29,8%) и 80 женщин (70,2%)). Средний возраст исследуемых русских составил 42,1 года (12,0 лет), бурят - 42,8 года (15,4 года), что соответствует закону нормального распределения. От каждого участника было получено добровольное информированное согласие на обработку персональных данных, использование и хранение результатов, полученных в ходе фармакогенетического исследования. Исследование выполнялось в дизайне обсервационного поперечного когортного лабораторного исследования. Полученные результаты частоты полиморфизмов генов P-450 и гена белка-транспортера в этнических группах русских и бурят сравнивали с опубликованными данными литературы, предпочтение отдавалось исследованиям на здоровых добровольцах. Поиск литературных источников проводили в базах данных PubMed, Medline, e-Library, CyberLeninka, Google Scholar. В исследование включали группы с нормальным распределением генотипов в равновесии Харди-Вайнберга.

Критерии включения: здоровые добровольцы обоего пола в возрасте 18-74 лет, относящиеся к этническим группам русских и бурят. Этническая принадлежность определялась путем самоидентификации добровольцев и их родителей, анализа родословной до второго поколения. Данный метод продемонстрировал соответствие между самоидентификацией субъекта и определением микросателитных маркёров этнической принадлежности на 99,86% [16].

Критерии исключения: в исследование не включали потомков межнациональных браков.

Генотипирование. Материалом для исследования послужили 4 мл крови из вен локтевого сгиба. Взятие венозной крови осуществлялось «закрытым» вакуумным способом в вакуумные пробирки («Вейхай Хони- юй Медикал Девайсез Ко., Лтд», Китай) с мелкодисперсным напылением на стенках пробирок антикоагулянта КЗ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат). Забор крови осуществляли в декабре 2016 года на базе ГБУЗ Иркутская ордена «Знак Почета» областная клиническая больница (г. Иркутск) и ГАУЗ Республиканская клиническая больница им. Н. А. Семашко (Республика Бурятия, г. Улан-Удэ). Пробирки с замороженной цельной кровью были доставлены в Научно-исследовательский центр ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России (г. Москва).

Выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из лейкоцитов осуществлялось с помощью набора реагентов “ДНК-Экстран-1”, предназначенного для выделения геномной ДНК из цельной крови (ЗАО «Синтол», Москва, Россия). Носительство полиморфных маркеров генов CYP2C19*2 (681G>A), CYP2C19*3 (363G>A), CYP2C19*17 (-806C>T) и ABCB1 (3435C>T) определялось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (Real-Time PCR) с помощью наборов реагентов “SNP-Скрин” (ЗАО «Синтол», Москва, Россия) на амплификаторе Real-Time CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). Программа включала предварительную денатурацию при 95°С в течение 3 минут, затем 40 циклов: денатурация при 95°C в течение 15 секунд, отжиг при 63°C в течение 40 минут.

Клиническая интерпретация полиморфизмов

CYP2C19. Носители генотипа *1/*1 расцениваются как «extensive metabolizer» (ЕМ), этот генотип обеспечивает полную ферментативную активность CYP2C19 и, соответственно, нормальный уровень биотрансформации лекарственных препаратов. Носители двух дефектных аллелей CYP2C19*2 или CYP2C19*3 (*2/*2, *2/*3, *3/*3) расцениваются как «poor metabolizers» (РМ), носители одной аллели CYP2C19*2 или CYP2C19*3 или при совместном носительстве одной аллели CYP2C19*17 и одной аллели CYP2C19*2 или CYP2C19*3 (*1/*2, *1/*3, *2/*17, *3/*17) расцениваются как «intermediate metabolizers» (IM). Носители аллелей CYP2C19*17 в гетерозиготном или гомозиготном состояниях (*1/*17, *17/*17) обозначаются как «ultrarapid metabolizer» (UM) [17].

ABCB1 (C3435T). Наличие генотипа CC расценивается как «Normal activity» (NA) белкового транспортера. Наличие T-аллели ассоциировано с изменением фармакокинетических параметров лекарственных препаратов [9], тромботическими осложнениями у носителей генотипа ТТ, получающих клопидогрел [12].

Статистическая обработка. Средние значения количественных переменных представлены как «средние значения и СО», где СО - стандартное отклонение. Для подтверждения возможности использования данных статистических параметров для описания количественных данных определялось соответствие закону нормального распределения, при этом статистически значимыми считали значение р<0,05. Подчинение закону нормального распределения определяли с использованием критериев Шапиро-Уилки или Колмогорова-Смирнова в зависимости от количества здоровых добровольцев в исследуемых этнических группах.

Для подтверждения независимого распределения аллелей в изучаемых полиморфизмах оценивалось соответствие закону Харди-Вайнберга с использованием авторского калькулятора [Michael H. Court (2005-2008)], полученные результаты популяционного исследования соответствовали закону Харди-Вайнберга при значении р>0,05.

Для оценки различий частот полиморфных аллелей между русской и бурятской этническими группами использовали точный тест Фишера и отношение шансов (*1/*1 vs *1/*2+*2/*2, *1/*1 vs *1/*3+*3/*3, *1/*1 vs *1/*17+*17/*17, СС vs СТ+ТТ).

Исследование одобрено локальным этическим комитетом ГБУЗ Иркутская ордена «Знак Почета» областная клиническая больница (протокол №73 от 29 ноября 2016 г.).

Результаты и обсуждение

Определены полиморфизмы CYP2C19*2 (681G>A, rs4244285),CYP2C19*3(363G>A,rs4986893), CYP2C19*17 (-806С>Т, ^12248560) и АВСВ1 (3435С>Т, Т81045642), ассоциированные с изменением антиагрегантного действия клопидогрела, у 250 здоровых добровольцев из числа представителей двух этнических групп, проживающих на территории Иркутской области и Республики Бурятия (136 русских и 114 бурят).

Сравнение частоты изучаемых аллелей и генотипов по CYP2C19*2 (С681А), CYP2C19*3 (в636А), CY- Р2С19*17 (С806Т), АВСВ1 (С3435Т) у русских и бурят представлены в таблице.

В обеих наблюдаемых этнических группах распределение по генотипам соответствовало закону Харди-Вайнберга по CYP2C19*2 (русские: = 0,025, р = 0,87; буряты: х2 = 1,90, р = 0,17), CYP2C19*17 (русские: 2 = 0,28, р = 0,60; буряты: х2 = 0,86, р = 0,35), АВСВ1 (русские: х2 = 3,58, р = 0,06; буряты: х2 = 2,51, р = 0,11). В результате генотипирования русских для гена CYP2C19*3 обнаружена нольпроцентная частота полиморфизма CYP2C19*3 (С636А), рассчитать х2 по Харди-Вайнбергу было невозможно. Распределение аллелей и генотипов по полиморфному маркеру CYP2C19*3 (363С>Л) среди русских и бурят не соответствовало закону Харди-Вайнберга. полиморфизм ген клопидогрел русский бурят

Статистически значимых различий в частоте СУР2С19*2 между русскими и бурятами не обнаружено. Частота СУР2С19*2 (0681А) составила у русских - 15,4%, у бурят - 16,2% (р = 0,807). Остальные изучаемые в исследовании полиморфизмы гена СУР2С19 имели статистические различия у русских и бурят, а именно: СУР2С19*3 (0636А) встречался только у бурят - 9,2% (р<0,0001), CYP2C19*17 (С806Т) определялся чаще у русских, чем у бурят - 26,8% и 6,1% соответственно (р<0,0001). Для гена АВСВ1 статистически значимых различий в частоте АВСВ1 (С3435Т) в изучаемых этнических группах не обнаружено. Т-аллель составила у русских 48,9%, у бурят - 44,7% (р = 0,369).

Почти треть здоровых добровольцев как среди русских, так и среди бурят являлись носителями как минимум одной «медленной» аллели CYP2C19*2 (*1/*2+*2/*2), ассоциированной с низкой эффективностью клопидогрела, высокой остаточной реактивностью тромбоцитов - 28,7% и 31,6% соответственно (р = 0,678). «Медленный» аллельный вариант СУР2С19*3 встречался только в бурятской этнической группе, при этом частота носительства как минимум одной аллели СУР2С19*3 (*1/*3+*3/*3) составила 17,6% (р<0,0001). Отмечалась статистически значимая разница в частоте носительства «быстрого» аллельного варианта СУР2С19*17, ассоциированного с риском геморрагических осложнений, низкой остаточной реактивностью тромбоцитов: носителями как минимум одной «быстрой аллели» CYP2C19*17 (*1/*17+*17/*17) среди русских и бурят составила 45,6% и 11,4% соответственно (р<0,0001).

Таблица / Table

Сравнение частоты аллелей и генотипов по CYP2C19*2 (G681A), CYP2C19*3 (G636A), CYP2C19*17 (C806T), ABCB1 (C3435T) у русских и бурят / Comparison of alleles and genotypes frequency in accordance with CYP2C19 * 2 (G681A), CYP2C19 * 3 (G636A), CYP2C19 * 17 (C806T), ABCB1 (C3435T) in the Russians and the Buryats