Использование нового морфологического метода исследования индекса блеббинга лимфоцитов периферической крови лабораторных животных на фоне острой кровопотери различной степени тяжести

Размещено на http://www.allbest.ru/

Использование нового морфологического метода исследования индекса блеббинга лимфоцитов периферической крови лабораторных животных на фоне острой кровопотери различной степени тяжести

Аннотация

В статье рассматривается феномен иммунного блеббинга клеточной стенки лимфоцитов (ИБЛ) у лабораторных животных является достоверным морфологическим маркером окислительного стресса. Показано, что мониторинг индекса блеббинга лимфоцитов может позволить контролировать эффективность проводимых лечебных мероприятий.

Ключевые слова: блеббинг клеточной стенки лимфоцитов, острая кровопотеря.

Abstract

Key words: blebbing of the cell wall of lymphocytes, acute blood loss.

Введение

В настоящее время пациентам с кровотечением различной этиологии оказывается помощь согласно протоколу МЗРБ от 01.06.2017 №2 46, который включает в себя различные лабораторные и инструментальные методы исследования, но не дает полного представления о состоянии антиоксидантной системы (АОС), что позволило бы предотвратить развитие окислительного стресса (ОС) и как крайнего варианта синдрома полиорганной недостаточности (СПОН) [1,2].

ОС характеризуется дисбалансом между антиоксидантами и оксидантами в сторону преобладания последних, что приводит к полиэтиологическому повреждению клетки, однако эти изменения значительно отличаются от апоптоза. При апоптозе плазматическая мембрана, как правило, сохраняет свою целостность, и апоптозные тельца могут быть поглощены макрофагами или соседними клетками. Сыворотка крови здоровых лиц характеризуется антиоксидантной активностью (АОА) - среда для физиологического протекания ключевых биологических механизмом поддержания гомеостаза. Изменение АОА на прооксидантную активность (ПОА) сыворотки крови происходит за счет свободнорадикального дисбаланса с высокими концентрациями активных форм кислорода (АФК). АФК (переход АОА на ПОА) ^ ненасыщенные жирные кислоты ^ перекисное окисление липидов (ПОЛ) ^ образование модифицированных белков (кроме того, они окисляют липопротеины низкой плотности сыворотки и другие субстраты) ^ ОС и как частный случай ^ иммунный блеббинг лимфоцитов (ИБЛ) [3,4].

Известно, что ОС может привести к блеббингу клеточной стенки лимфоцитов.

Блеббинг - процесс частичной, либо полной дислокации бифосфолипидного слоя клеточной стенки от цитоскелета лимфоцита вследствие взаимодействия с большим количеством АФК [4]. Следует отметить, что интерпретация ИБЛ может помочь оценке АОС и, как следствие, вероятность развития ОС [5].

Цель исследования. Оценить использование нового морфологического метода исследования индекса блеббинга лимфоцитов периферической крови лабораторных животных на фоне острой кровопотери различной степени тяжести.

Материал и методы. Исследование выполнено в научно-исследовательской лаборатории ГНУ «Институт радиобиологии Национальной академии наук Беларуси», УО «Гомельский государственный медицинский университет» в соответствии с «Положением о порядке использования лабораторных животных в научно-исследовательских работах и педагогическом процессе Гомельского государственного медицинского института и методах по реализации требований биомедицинской этики» (№54- А от 23.05.2002 г.). Все манипуляции с животными производились под воздействием воздушно-изофлюранового наркоза [6].

Было выполнено исследование: группа №1 - без острой кровопотери (интактные) животные (n=13) и группа №2 - с острой кровопотерей различной степени тяжести: легкой (n=16), средней (n=17) и тяжелой (n=16). Спустя 24 и 48 часов после перенесенной острой кровопотери определялись показатели красной крови: эритроцитов (Er) и гемоглобина (Hb); высчитан ИБЛ.

Моделирование острой кровопотери у животных производилось по методике, предложенной С.Л. Зыблевым [7]. Тяжесть кровопотери составила для легкой степени - 4,0±0,5 мл, (35-40% объема циркулирующей крови (ОЦК)), средней - 5,0±0,5 мл, (40-45% ОЦК), тяжелой - 6,0±0,5 мл, (45-50% ОЦК).

Определение концентрации глюкозы сыворотки крови проводили на биохимическом анализаторе «Clima MC 15» энзиматическим-колорометрическим и глюкозооксидантным методом соответственно. Показатели красной крови оценивали при помощи гематологического анализатора «SYSMEX XP-300».

Выделение лимфоцитов проводилось в центрифужную пластиковую пробирку (№1), содержащую антикоагулянт (Vacutte, 5 мл.) вносили 5 мл. венозной периферической крови. Далее в эту пробирку при помощи пипетки- дозатора добавляли Phosphate buffered saline (PBS, рН 7,4) в соотношении 1:1. В пробирку (№2) вносили фиколл-верографин и аккуратно, по стенке пробирки, добавляли содержимое пробирки №1 в соотношении 1:2. Центрифугировали в течение 25 минут со скоростью 3000 оборотов/минута при 400 G. После надосадочное «облако» лимфоцитов при помощи дозаторной пипетки вносили в пробирку (№3) и доводили до объема 10 мл., аккуратно добавляя PBS. Центрифугировали при тех же выставленных параметрах. После центрифугирования удаляли супернатант и полученную взвесь лимфоцитов наносили на чашку Петри в количестве 30-40 мкл. Исследование осуществляли на микроскопе Axio Observer с использованием фазовоконтрастного метода. (ГНУ «Институт радиобиологии Национальной академии наук Беларуси»).

Статистическая обработка данных производилась с использованием пакета статистических программ «Statistica 12.0». Оценку нормальности распределения числовых данных проводили с использованием критерия Shapiro-Wilk test. Распределение числовых значений отличалось от закона нормального распределения. В этой связи цифровые данные были представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (Q1; Q3). Сравнительный анализ между группами проводился с использованием критерия Mann-Whitney U-test. Расчет мощности исследования производился с использованием двустороннего t-критерия.

Результаты исследования

1. Интактные клетки (клеточная мембрана визуально не изменена);

2. Клетки в состоянии начального блеббинга (малые везикулы на мембране до 1/3 радиуса клетки);

3. Клетки в состоянии терминального блеббинга (крупные везикулы на мембране более 1/3 радиуса клетки, либо множество мелких везикул).

Рисунок 1. Лимфоциты периферической крови. Увеличение х600, фазово-контрастная микроскопия. А - интактные лимфоциты

клеточный дислокация лабораторный феномен

4. Апоптоз (некротизированные лимфоциты)

Рисунок 2. Лимфоциты периферической крови. Увеличение х600, фазово-контрастная микроскопия Б - лимфоцит в состоянии начального блеббинга;

Рисунок 3. Лимфоциты периферической крови. Увеличение х600, фазово-контрастная микроскопия В - лимфоцит в состоянии терминального блеббинга; Г - апоптоз.

После чего осуществлялся расчет ИБЛ.

В результате исследования получены данные показателей красной крови животных и ИБЛ, которые представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Показатели сыворотки крови лабораторных животных

Анализируя полученные данные видно, что ИБЛ составил 4,2 [3,2;11,4]% у интактных животных. Отмечено, что у животных с моделированием кровотечения ИБЛ имеет тенденцию к увеличению:23,5 [11,7;35,7]% (24 ч.) и 27,8 [15,8;48,0]% (48 ч.) - легкая степень тяжести; 43,8 [40,7;67,9]% (24 ч.) и 46,9 [28,7;75,8]% (48 ч.) - средняя степень тяжести; 56,8 [29,9;73,6]% и 58,8 [24,9;77,9]% - тяжелая степень тяжести соответственно. При этом все показатели были статистически значимы во всех группах (р<0,001), что свидетельствует о постепенном возрастании АФК (переходом АОС^-ПОА) по мере прогрессирования тяжести кровотечения и способствует развитию ОС и как крайнего случая ^ СПОН.

Острая кровопотеря характеризовалась статистически значимым снижением концентрации эритроцитов и уровня гемоглобина по отношению группы животных №2 с 24 часовым интервалом времени к группе животных №1, для которой уровень эритроцитов и гемоглобина составил соответственно 6,72 [6,9; 9,0]х1012/л и 140,0 [134,0; 165,0] г/л. Так для 24-часового промежутка времени показатели уровня эритроцитов и гемоглобина составили для легкой степени тяжести кровопотери - 6,42 [4,1;7,6]*х1012/л и 122,0 [110,0;126,0]* г/л, для средней - 5,34 [3,7;6,0]*х1012/л и 101,0 [96,0;117,0]* г/л, для тяжелой - 3,97 [2,5;4,6]* х1012/л и 81,0 [60,0;85,0]* г/л. Далее, спустя 48 часов после острой кровопотери, наблюдалось прогрессирование анемического синдрома: уровень эритроцитов и гемоглобина для легкой степени тяжести кровопотери составил 5,22 [4,0;7,4]** х1012/л и 110,0 [102,0;127,0]** г/л, для средней - 4,14 [3,1;4,7]** х1012/л и 90,0 [84,0;110,0]** г/л, для тяжёлой - 3,64 [1,8;4,7]** х1012/л и 65,0 [43,0;74,0]** г/л соответственно. Следует отметить, что в сравнении с контролем определялось статистически значимое снижение содержания уровней эритроцитов и гемоглобина, которое определялось как спустя 24 часа (р<0,05), так и спустя 48 часов после острой кровопотери (р<0,05). Спустя 48 часов при всех степенях кровопотери данные показатели были значимы ниже в сравнении с 24 часовым интервалом времени (р<0,05).

Заключение

Острая кровопотеря влечет за собой наличие прооксидантной активности сыворотки крови, выраженность которой определяется степенью тяжести кровотечения Ц ОЦК). Все это приводит к блеббингу клеточной стенки лимфоцитов, который в свою очередь является интегральным параметром, отражающим действие повреждающих факторов - активных форм кислорода на клеточную стенку и является достоверным морфологическим маркером окислительного стресса. Мониторинг индекса блеббинга лимфоцитов может позволить контролировать эффективность проводимых лечебных мероприятий.

Список литературы

1. Применение антиоксидантов при остром гастродуоденальном язвенном кровотечении / С.Л. Зыблев [и др.] // Новости хирургии. - 2014. - №22. - С. 155-163.

2. Дифференцированный подход к коррекции нарушений антиоксидантного статуса лабораторных животных с острой кровопотерей на фоне цирроза печени / Д.А. Евсеенко [и др.] // Хирургия. Восточная Европа. - 2019. - №4. - С. 565-577.

3. Системный мембранодестабилизирующий дистресс-синдром в хирургии: понятие, патогенез, диагностика / А.П. Власов [и др.] // Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. - 2019. - №5. - С. 25-30.

4. Активные формы кислорода в физиологии и патологии клетки / Е.В. Пожилова [и др.] // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. - 2015. - №2. - С. 13-22.

5. Блеббинг плазмолеммы лимфоцитов периферической крови как маркер окислительного стресса / Д.А. Евсеенко [и др.] // Медико-биологические проблемы жизнедеятельности. - 2019. - №22. - С. 30-35.

6. Ray, P.D. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling / P.D. Ray [at al.] // Cell Signal. - 2012. - № 24. - P. 981-990.

7. Зыблев СЛ, Дундаров ЗА, Мартемьянова ЛА. Экспериментальная модель геморрагического шока. Проблемы здоровья и экологии. - 2013. - № 1 (35). - С. 109-113.

8. Новые аспекты развития системной воспалительной реакции после аортокоронарного шунтирования / В.В. Мороз // Общая реаниматология. - 2008. - №4. - С.5-11.

Размещено на Allbest.ru