Изменение рецепции и транспорта лактата церебральным эндотелием под воздействием индуктора вирусного и бактериального воспаления in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изменение рецепции и транспорта лактата церебральным эндотелием под воздействием индуктора вирусного и бактериального воспаления in vitro

Бойцова Е.Б.*,

Моргун А.В.,

Осипова Е.Д.,

Мартынова Г.П.,

Салмина А.Б.

ФГБОУ ВО "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Научно-исследовательский институт молекулярной медицины и патобиохимии, г. Красноярск, Россия

Резюме

Введение

Церебральные эндотелиоциты играют важную роль в патогенезе инфекционных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС). Эндотелиальная дисфункция считается одним из ранних событий в нарушении целостности гематоэнцефалического барьера при различных патологических состояниях [1], в частности при воспалении бактериального и вирусного генеза. Моделирование нейровсопаления in vitro позволяет изучить механизмы патогенеза эндотелиальной дисфункции и определить роль церебральных эндотелиоцитов в патогенезе повреждения гематоэнцефалического барьера.

Липополисахариды (ЛПС) - это известные эндотоксины клеточной стенки грамотрицательных бактерий, вызывающие классические признаки системного воспаления и нейровоспаления в головном мозге [2]. PolyI:C представляет собой синтетическую двухцепочечную РНК, которая используется в качестве имитатора вирусной РНК для моделирования вирусного воспаления [3].

Воздействие индукторов бактериального и вирусного воспаления характеризуется выработкой провоспалительных медиаторов иммунной системой, таких как интерлейкины, фактор некроза опухоли и др [4].

Ро 1у 1:С является "естественным" стимулятором TLR3, что было использовано нами с целью дифференцировки бактериального и вирусного воспаления [5].

Воспаление при бактериальном менингите сопровождается значительным увеличением концентрации лактата в спинномозговой жидкости и может использоваться в качестве надежного критерия для дифференциальной диагностики бактериального и асептического менингитов и / или вирусного менингита [6].

Монокарбоксилатные транспортеры (МСТ) осуществляют перенос лактата через гематоэнцефалический барьер и способствуют эффективному метаболическому сопряжению клеток нейроваскулярной единицы [7]. Однако имеется убедительная информация о том, что ингибирование активности MCT-1 приводит к подавлению ангиогенеза [8]. Рецепторы лактата - GPR81 экспрессируются на цитоплазматической мембране и действуют как метаболические сенсоры. Как мы продемонстрировали ранее, повышение уровня внеклеточного лактата или активация GPR81 стимулируют митохондриальный биогенез и поддерживают ангио- генные свойства в клеточной модели ГЭБ in vitro [9,10]. Однако роль GPR81 или MCT-1 в патогенезе нарушения эндотелиальной дисфункции при бактериальном и вирусном нейровоспалении изучена недостаточно. В нашем исследовании мы проанализировали влияние ЛПС и PolyI:C in vitro на экспрессию GPR81 и MCT-1 в церебральных эндотелиоцитах.

Материалы и методы. Выделение эндотелиоцитов. Эндотелиоциты получали из головного мозга крыс по модифицированному протоколу Liu et al., 2013 [11]. После анестезии на льду 10-дневных крыс в стерильных условиях производили забор головного мозга с удалением мозговых оболочек и крупных церебральных сосудов (методом роллинга на асептической фильтровальной бумаге). Диссоциация двух полушарий проводилась в холодном растворе Хенкса. Нарезка серого вещества - на кусочки объемом 1 мм 3. Центрифугирование осуществляли в 15 мл конических пробирках при 150 g 3 минуты при температуре 4°С. К осадку добавляли 25% FBS в 2-кратном объеме от его объема и перемешивали 25 раз 5 мл пипеткой. Центрифугировали гомогенат при 600 g 10 минут при температуре 4°С. Удаляли супернатант и собирали пеллет микрососудов в новую 15 мл коническую пробирку. К пеллету добавляли двукратный объем 0,1% коллагеназы II и инкубировали в течение 35 минут при +37°С с периодическим перемешиванием. После инкубации центрифугировали осадок при 150 g 5 минут при температуре 4°С. К полученному осадку добавляли культуральную среду и засевали в культуральные флаконы, покрытые желатином (105кл/мл). Культивирование осуществляли при +37°С, 5% CO2 в инкубаторе (Binder, Германия). Смена среды проводилась каждые 48 часов. При достижении конфлюентности, равной 90-95%, среду удаляли и культуру клеток во флаконе промывали раствором Хенкса, после чего обрабатывали трипсином для открепления. Высевали клетки на покрытые желатином чашки или флаконы для проведения основного эксперимента. С помощью фазово-контрастной микроскопии каждый день оценивали морфологию.

Моделирование бактериального воспаления in vitro. Использовали липополисахарид (ЛПС) от Escherichia coli (E. Coli, 0111:В 4 L4391-1MG) в концентрациях 50 и 100 нг/мл. Клетки инкубировались с ЛПС в течение 24 часов [12].

Моделирование вирусного воздействия in vitro. Для моделирования вирусного воспаления эндотелиоциты культивировали в 24-лу- ночных планшетах в присутствии PolyI:C, 20 мкг/мл, в течение 24 часов, в бессывороточной среде (Pan, 2012)[13].

Контрольной группой являлись клетки, которые культивировали в стандартных условиях, без добавления ЛПС и PolyI:C, в бессыво- роточной среде.

Таким образом было сформировано 4 группы: контроль, ЛПС 50, ЛПС 100, Ро 1у 1:С.

Регистрация величины трансэндотелиального электрического сопротивления

Для измерения трансэндотелиального электрического сопротивления (ТЭС) эндотелиоциты культивировали в культуральных вставках для 24-луночных планшет (Transwell 3493, Costar, США) в количестве 5*104 клеток на каждую вставку.

Непосредственное измерение ТЭС производили вольтомметром EVOM2 с использованием электрода STX2 (World Precision Instruments, США).

Иммуногистоцитохимические исследования

Оценку экспрессии антигенов эндотелиальными клетками ГЭБ in vitro проводили по стандартной методике последовательного комбинированного окрашивания препарата. Первичные антитела в рабочем разведении (1:100) добавляли к ко-культуре клеток и инкубировали в течение 12 часов при температуре +4°С во влажной камере. Целевыми молекулами являлись: GPR81, MCT-1, Il-1Я, TLR3, ZO1. После отмывки, в темноте вносили вторичные антитела в рабочем разведении (1:200) и осуществляли часовую инкубацию при +37°С во влажной камере.

Первичные антитела: антитела к антитела к ZO1 (Santa-Cruz, США), антитела к МСТ 1 (Abeam, США), TLR3 (Abeam, США), GPR81 (San- ta-Cruz, США), П-1р (Abeam, США).

В качестве вторичных антител использовали моноклональные антитела Alexa Fluor 488 (Abeam, США), Alexa Fluor 555 (Abeam, США), Alexa Fluor 647 (Abeam, США).

Измерение концентрации лактата в среде. Концентрацию лактата в культуральной среде определяли флуориметрическим методом при помощи набора Laetate Assay Kit (Sigma, MAK064). На спектрофлуориметре "Solar CM2203" при длине Ex = 535, Ем=587 (ЗАО "Солар", Беларусь).

Регистрация пролиферативной активности. Исследование проводили с помощью аппарата регистрации пролиферативной активности в режиме реального времени xCelligenee System (Roehe, США). Регистрация проводилась каждые 15 минут в течение трех суток.

Флуоресцентная микроскопия проводилась с использованием микроскопа ZOE Fluoreseent Cell Imager (Bio-Rad Laboratoris, США).

Математико-статистическая обработка результатов

Математико-статистическая обработка полученных результатов осуществлена с применением программного обеспечения Prism 8 (GraphPad Software, США), Mierosoft Exeel 9.0 (Mierosoft, США).

Использовались методы описательной статистики. Данные представлены в виде M ± m, где M - среднее арифметическое, m - ошибка среднего. Использовались методы непараметрической статистики. Для оценки межгрупповых различий значений, имеющих непрерывное распределение, применяли критерий Краскела - Уоллиса с последующим парным сравнением групп с использованием критерия Манна - Уитни. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

Результаты. Мы провели регистрацию и оценили величину ТЭС в исследуемых группах. Выявлено, что в результате воздействия патологических агентов (PolylЖ и ЛПС) происходит статистически значимое уменьшение величины ТЭС в опытных группах PolylЖ, ЛПС 50 и ЛПС 100 по сравнению с контролем (140±2,5 Ом*см 2). Так, через 24 часа в группе PolylЖ величина ТЭС снизилась до 99±3,1 Ом*см 2, в группе ЛПС 50 до 104±2 Ом*см 2 и в группе ЛПС 100 - 107±2,5 Ом*см 2 (р<0,01). При этом статистически значимой разницы между опытными группами не выявлено (рисунок 1).

Рисунок 1. Показатели трансэндотелиального сопротивления церебральных эндотелио- цитов при инкубации сЛПС 100 в течение 24 часов.

Figure 1. Measurements of transendothelial resistance of cerebral endothelial cells during the incubation with Poly I:C, LPS50, and LPS100 within 24 hours.

*статистически значимые различия p < 0,05 (критерий Краскела - Уоллиса) по сравнению опытных групп к контрольной.

*statistically significant differences p < 0,05 (Kruskal - Wallis test).

Принимая во внимание, что образование провоспалительных цитокинов характерно как для бактериального, так и для вирусного воспаления, маркером воспаления был выбран ГЬ-1р. Нами выявлено значительное увеличение числа эндотелиоцитов, экспрессирующих ГЬ-1р, в опытных группах по сравнению с группой контроля (р<0,05). При этом разницы между опытными группами не наблюдалось (рисунок 2А).

Рисунок 2. Уровень экспрессии IL-1Я (2A), TLR3(2B), Z0-1(2C), MCT1 (2d), GPR81 (2E) в церебральных эндотелио- цитах in vitro.

Figure 2. IL-1Я (2A), TLR3(2B), Z0-1(2C), MCT1 (2D), and GPR81 (2E) expression level in cerebral endothelial cells in vitro.

*статистически значимые *p < 0,05 (Kruskal-Wallis test). различия p < 0,05 (критерий Краскела - Уоллиса) по сравнению опытных групп к контрольной.

Для дифференциальной диагностики вирусного и бактериального воспаления был выбран маркер вирусного воспаления TLR3. В результате обнаружено статистически значимое увеличение числа эндотелиоцитов, экспрессирующих TLR3 в группе Ро 1у 1:С (76,6±1,5%) по сравнению с группой контроля (16,4±1,1%) и группами ЛПС 50 (20,1±1,4), ЛПС 100 (22,3±2) (р<0,05) (рисунок 2В).

Проведена оценка изменения эндотелиальных белков плотных контактов, обеспечивающих целостность эндотелиального слоя и регулирующих проницаемость. Установлено, что произошло статистически значимое уменьшение числа ZО 1-иммунопозитивных клеток в группах, подвергшихся воздействию ЛПС и Ро 1у 1:С, по сравнению с группой контроля (р<0,005). При этом отличия между группами ЛПС 50, ЛПС 100 и Ро 1у 1:С не обнаружены (рисунок 2С).

Для подтверждения изменения количества пролиферирующих клеток в ответ на возникновение нейровоспаления, проводили регистрацию пролиферативной активности эндотелиоцитов в режиме реального времени. В ходе эксперимента выявлено, что через 48 часов отмечается статистически значимая разница пролиферативной активности клеток, которые подверглись воздействиям индукторов воспаления (ЛПС). При этом разницы между ЛПС 50 и ЛПС 100 не установлено.

В ходе исследования нами выявлено, что влияние индукторов воспаления вызывает уменьшение количества эндотелиальных клеток, экспрессирующих монокарбоксилатный транспортер-1 (рисунок 2D) и рецептор лактата (GPR81) (рисунок 2E). Произошло снижение числа МСТ-1-иммунопозитивных эндотелиоцитов более чем в 2 раза по сравнению с группой контроля (р<0,05). При этом между группами PolyI:Q ЛПС 50 и ЛПС 100 статистически значимых отличий не выявлено. Одновременно с этим произошло четырехкратное снижение GPR81-иммунопозитивных эндоте- лиоцитов по сравнению с контрольной группой с 44,9±3,6% до 10,4±4,6% (ЛПС 50) и 10,5±3% (ЛПС 100) (р<0,05), также не обнаружено статистически значимой разницы между опытными группами.

Поскольку мы обнаружили изменение МСТ- 1 и GPR81 позитивных клеток при воздействии ЛПС, было принято решение определить концентрацию лактата в культуральной среде (рисунок 3). При этом мы установили, что при моделировании нейровоспаления in vitro в культуральной среде увеличивается концентрация лактата в группах ЛПС 50 (34,7±1,8 нг/ мкл) и ЛПС 100 (35,5±2 нг/мкл) по сравнению с 26,5±1,5 нг/мкл в группе контроля и 27,4±2 нг/ мкл PolyI - (р<0,05).

Обсуждение

Ранее нами были выявлены подобные изменения рецепции и транспорта лактата в модели бактериального воспаления гематоэнцефалического барьера in vitro [14].

Недавно обнаружено, что стимуляция рецепторов GPR81 в эндотелиальных клетках микрососудов мозга приводит к стимуляции биогенеза митохондрий, что является предпосылкой для пролиферации клеток и высококонтролируемой проницаемости слоя эндотелиальных клеток. Таким образом, снижение экспрессии переносчиков лактата и GPR81 в церебральных эндотелиоцитах, подвергнутых воздействию медиаторов бактериального и вирусного воспаления, может препятствовать воздействию лактата на митохондриальную динамику, что приводит к подавлению эндотелиального метаболизма. При моделировании нейровоспаления in vitro происходит уменьшение количества эндотелиальных клеток, которые экспрессируют монокарбоксилатный транспортер-1, а также рецептор лактата, что сопровождается увеличением концентрации лактата в среде. Помимо этого, обнаруженное нами увеличение содержания лактата в межклеточной среде можно объяснить несколькими возможными механизмами. Например, при повышении концентрации лактата во внеклеточной среде за счет продукции эндотелиоцитами, когда при нейровоспалении уменьшается количество транспортеров лактата, отвечающих за доставку молочной кислоты внутрь клеток. То же самое можно представить в отношении рецептора GPR81, лигандом которого и является лактат, когда утилизация лактата меньше, чем его продукция. Учитывая, что эндотелиальные клетки могут использовать внеклеточный MCT-1-переносимый лактат в качестве "топлива" для дыхания митохондрий, мы можем предположить, что снижение экспрессии MCT-1 в эндотелиоцитах при воздействии ЛПС в модели in vitro отрицательно повлияло на их митохондриальный биогенез. Последнее может привести к ухудшению плотных контактов и барьерной функции церебральных эндотелиоцитов. Таким образом, повышенная продукция лактата из-за наличия бактериального и вирусного воспаления связана с уменьшением транспорта и приема молочной кислоты эндотелиальными клетками, нарушением механизма лактатного клиренса и потерей структурной целостности эндотелиального монослоя.

Влияние ЛПС и Ро 1у 1:С вызывает уменьшение числа эндотелиоцитов, экспрессирующих белки плотных контактов ^0-1), подавляет пролиферативную активность клеток. При инкубации клеток с индукторами бактериального и вирусного воспаления происходит снижение величины трансэндотелиального сопротивления. В целом эти изменения вполне четко могут объяснить увеличение проницаемости эндотелиального монослоя при нейровоспалении.

Выводы