Кальций-фосфатные бионы: на пути к формированию патогенетической концепции

Dr. Anton G. Kutikhin, MD, PhD, Head of the Laboratory for Vascular Biology, Division of Experimental and Clinical Cardiology, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases (6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002, Russian Federation).

Природа и биологический смысл кальций-фосфатных бионов

Из клинических исследований достаточно давно известно, что повышенный уровень ионов кальция и фосфора в крови ассоциирован с атеросклерозом и его клиническими проявлениями (ишемической болезнью сердца, острым нарушением мозгового кровообращения по ишемическому типу и заболеваниями периферических артерий) [1, 2, 3]. Кроме того, сниженный уровень ингибиторов эктопической кальцификации фетуина-А и альбумина в крови также ассоциирован с повышенным риском развития ишемической болезни сердца [4, 5]. В то же время свободные ионы кальция и фосфора могут приводить к прямой кальцификации средней оболочки сосудов (медии), однако не вызывают собственно атеросклероза [6, 7] - хронического воспалительного процесса, харастеризующегося формированием гетерогенных бляшек из клеток, внеклеточного матрикса и липидов во внутренней оболочке артерий [8, 9]. При критическом сужении артериального просвета или разрыве бляшки с последующим тромбозом происходит критическое падение уровня необходимого кровотока, что приводит к острому несоответствию объема поступающего в ткани кислорода необходимому для поддержания их жизнеспособности объему [8, 9]. Клинически это проявляется инфарктом миокарда (при нарушении сердечного кровотока), острым нарушением мозгового кровообращения по ишемическому типу (при нарушении церебрального кровотока) и заболеваниями периферических артерий [8, 9].

Ингибирование кальцификации медии в крови осуществляется за счет функционирования ряда белков, при этом три различных механизма связывания кальция представлены альбумином, остеонектином и фетуином-А [10]. Альбумин связывает ионизированный кальций посредством множественных отрицательно заряженных аминокислот на своей поверхности, а остеонектин - при помощи EF-руки, специфического белкового домена [10]. Связывание кальция фетуином-А обусловлено отрицательными зарядами в-слоя домена D1, которые занимают места фосфатных групп в кристаллах гидроксиапатита [10]. Таким образом, альбумин и остеонектин связывают свободный кальций с низкой и высокой аффинностью соответственно, а фетуин-А отвечает за высокоаффинное связывание фосфата кальция [10]. Кроме альбумина, остеонектина и фетуина-А в систему эндогенных ингибиторов внескелет- ной кальцификации также входят матриксный Gla-белок и Gla-богатый белок, относящиеся к семейству витамин К-зависимых белков и содержащих 5 и 15 групп Y-карбоксилированного глутамата ^1а) соответственно [11-13]. Образуемые в результате витамин К-зависимой посттрансляционной модификации ^-карбокси- лирования) Gla-группы позволяют этим белкам связывать как ионизированный кальций, так и кальций в составе различных химических соединений [14-17]. Другой ингибитор эктопической кальцификации - трансмембранный белок К1о1±ю является корецептором для фактора роста фибробластов-23, снижая реадсорбцию фосфатов в проксимальных канальцах почек и синтез кальцитриола (1,25-дигидроксиви- тамина D) [18]. В свою очередь остеопротегерин является нейтрализующим рецептором для RANK-лиганда [19] и за счет этого препятствует остеокластной дифференцировке и дезинтеграции костного материала остеокластами, предотвращая развитие остеопенического синдрома [20, 21]. Несмотря на то, что механизм антикальцифицирующего действия остеопонтина неясен, его роль в поддержании минерального гомеостаза также считается доказанной [22, 23].

Помимо указанных белков к эндогенным ингибиторам эктопической минерализации относят неорганический пирофосфат, образующийся при гидролизе АТФ эктонуклеотидпирофос- фатазами/фосфодиэстеразами, состоящий из связанных гидролизуемым эфиром двух фосфатных групп и препятствующий нуклеации аморфного фосфата кальция, его кристаллизации до гидроксиапатита, а также ингибирующий рост кристаллов гидроксиапатита путем связывания с его поверхностью [13].

В свою очередь, связывание фосфата кальция основным ингибитором внескелетной минерализации фетуином-А также осуществляется по двум различным механизмам [26]. Первым из них является стабилизация мономерами фетуина-А субнаноразмерных кластеров фосфата кальция [26]. Несмотря на теоретическую возможность их физико-химической характеризации методами высокоразрешающей электронной микроскопии и элементного анализа, на данный момент изучение роли таких кластеров в нормальной и патологической физиологии представляется технически затруднительным вследствие их чрезвычайно малой размерности, не позволяющей проводить биологические эксперименты на должном уровне. Вторым механизмом связывания фетуином-А фосфата кальция является формирование каль- ций-фосфатных бионов (КФБ) - кристаллических частиц гидроксиапатита и карбонат-гидроксиапатита 80-500 нм в диаметре, имеющих губчатую структуру и включающих в себя еще ряд белков сыворотки крови [10, 24-30]. Таким образом, при избытке ионов кальция и фосфора или нарушении их выведения КФБ способны накапливаться в крови человека [29, 30]. В целом семейство бионов представляет собой минерало-органические частицы, формирующиеся в биологических жидкостях при их перенасыщении определенными катионами и анионами [29, 30].

В экспериментах нашей группы [30] было показано, что при добавлении в культуральную среду КФБ не происходит кальцификации используемого для изготовления биопротезов бычьего и свиного перикарда независимо от способа его химической обработки, в то время как обогащенная солями кальция и фосфора среда приводит к формированию массивных минеральных отложений. Кроме того, внутривенное введение КФБ не вызывало гипертрофии интимы брюшной аорты крыс [30], что также косвенно демонстрирует их неспособность индуцировать формирование очагов эктопической (в частности, сосудистой) кальцификации. Данные результаты подтвердили гипотезу о том, что формируемые эндогенно при перенасыщении крови ионами кальция и фосфора КФБ являются механизмом защиты от прямой эктопической кальцификации тканей, в том числе препятствуя патологической минерализации элементов системы кровообращения [29, 30].

Клиническое значение КФБ

Вместе с тем было выявлено, что КФБ выделяются из приблизительно 75% атеросклеротических бляшек крупных артерий человека, оказывают прямое цитотоксическое действие на эндотелиальные клетки in vitro, стимулируют выделение ими провоспалительных цитокинов интерлейкина-6 и интерлейкина-8, а при предварительном повреждении интимы брюшной аорты крыс баллоном вызывают ее гипертрофию, являющуюся характерным признаком атеросклероза [30]. Таким образом, защищая организм от «большего зла» - быстрой и массивной кальцификации сосудов [31, 32], КФБ тем не менее потенциально могут являться одним из триггеров атеросклероза.

Поскольку атеросклероз продолжает оставаться ведущей причиной смерти как в развитых, так и в развивающихся странах [33], а повреждение внутренней выстилки артерий (эндотелия) является обязательным условием для его развития [34, 35], изучение триггеров дисфункции и повреждения эндотелия имеет достаточно большую актуальность. Вместе с тем при повреждении стенки сосуда со стороны просвета различными агентами первичный клеточный ответ поступает в том числе со стороны адвентиции [36]. В результате воздействия различных провоспалительных молекул [37], поступающих из системного кровотока посредством парацеллюлярного транспорта к vasa vasorum и лимфатическим сосудам адвентиции [37, 38], осуществляется активация адвентициальных фибробластов с формированием синтетически активных миофибробластов, пролиферация миофибробластов и их миграция из адвентиции в сторону просвета сосуда [39, 40], а также увеличивается количество макрофагов, лимфоцитов [41, 42] и vasa vasorum (система сосудов, ответственная за кровоснабжение стенки основного сосуда) [43], что в конечном счете ведет к образованию неоинтимы. Также стоит отметить, что большое скопление лимфоцитов в адвентиции при воспалении вызывает образование лимфоидных фолликулов [36]. Увеличение количества vasa vasorum влечет за собой повышенную секрецию эндотелиальными клетками провоспалительных цитокинов и молекул клеточной адгезии, способствующих прикреплению моноцитов к эндотелию и их миграции в интиму с последующей дифференцировкой в макрофаги и образованием пенистых клеток [36]. Все вышеуказанное позволяет предположить, что воздействие КФБ также может вызывать определенный патологический ответ не только со стороны просвета сосуда, но и в адвентиции.

Ранее сферические наночастицы гидроксиапатита были идентифицированы в коронарных артериях и аорте пациентов с атеросклерозом [44], а также в аорте и подвздошных артериях больных с уремией, являющейся фактором риска развития атеросклероза [45, 46]. Клиническая значимость феномена образования КФБ в крови также обусловлена повышенной склонностью сыворотки крови пациентов с терминальной хронической почечной недостаточностью и больных артериальной гипертензией к формированию КФБ в сравнении с сывороткой условно здоровых доноров крови [47]. Кроме того, повышенная склонность сыворотки крови к формированию КФБ ассоциирована с неблагоприятным прогнозом у пациентов с хронической болезнью почек 3 и 4 стадий [48], а также у больных терминальной хронической почечной недостаточностью [49], включая перенесших трансплантацию почки [50-52]. При этом пациенты с увеличенной склонностью сыворотки крови к формированию КФБ характеризуются повышенным риском смерти как от всех, так и отдельно от сердечно-сосудистых причин [50-52], а также повышенным риском развития инфаркта миокарда и заболеваний периферических артерий [49]. Последние исследования также демонстрируют, что повышенная склонность сыворотки к формированию КФБ ассоциирована с более выраженным коронарным кальцинозом и более высоким риском прогрессирования этого патологического процесса у пациентов с хронической почечной недостаточностью на различных стадиях, исключая начальную и терминальную [53]. Это косвенно подтверждается данными о том, что высокое содержание КФБ в системном кровотоке может служить суррогатным маркером коронарного атеросклероза, коррелируя как с объемом бляшки в целом, так и с объемом ее липидного компонента, а также превалируя у пациентов с острым коронарным синдромом в сравнении с субъектами со стабильной стенокардией [54].

Кроме того, в последних исследованиях удалось успешно детектировать КФБ в сыворотке крови пациентов с терминальной хронической почечной недостаточностью [55] и преддиа- лизной ее стадией [56, 57] при помощи проточной цитометрии с использованием специфичных к фосфату кальция и клеточным мембранам флюоресцентных маркеров [55, 56] и динамического рассеяния света [57]. Проточная цитометрия при помощи аналогичного окрашивания также позволила детектировать КФБ в перитонеальном диализате пациентов с терминальной хронической почечной недостаточностью [58]. Электронная и атомно-силовая микроскопия являются альтернативным методом детекции КФБ в осадке после центрифугирования сыворотки пациентов с терминальной хронической почечной недостаточностью [57, 5961], однако данные методы в силу трудоемкости и относительной малодоступности едва ли могут быть применены в клинической практике.

Идентификация КФБ как биомаркера и тем более - как пускового фактора дисфункции и повреждения эндотелия требует предложения способов их элиминации из системного кровотока после выполнения ими своей защитной функции - нейтрализации избыточных ионов кальция и фосфора. В этом отношении интересны результаты рандомизированного клинического испытания TACT (Trial to Assess Chelation Therapy), которое включило 1708 пациентов (50 лет и старше) с инфарктом миокарда в анамнезе, получавших (839 больных) или не получавших (869 больных) в течение 30 недель 40 внутривенных инфузий объемом 500 мл, включавших 3 г динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (1,5 г/л) как хелатирующего агента в сочетании с витаминной и электролитной смесью. У получавших указанную терапию пациентов в 1,22 раза реже регистрировалась первичная комбинированная конечная точка (в которую входили летальный исход независимо от причины, повторный инфаркт миокарда, острое нарушение мозгового кровообращения, коронарная реваскуляризация или госпитализация по поводу стенокардии) [62]. Данный эффект был особенно выражен на когорте пациентов с сахарным диабетом, первичная комбинированная конечная точка у которых отмечалась в 1,69 раза реже [63], и на субкогорте пациентов с сахарным диабетом и заболеваниями периферических артерий, являющихся клиническим проявлением мультифокального атеросклероза, у которых снижение частоты первичной комбинированной конечной точки достигло 1,92 раза [65]. Эти результаты приобретают особый интерес в свете того, что пик формирования КФБ в крови приходится на первые 2 часа после приема пищи; таким образом, существует ассоциативная связь между постпрандиальной гликемией и образованием КФБ [64]. Положительным эффектом протестированного в исследовании TACT режима терапии также является его безопасность [66]. В то же время низкая биодоступность динатриевой соли этилендиаминте- трауксусной кислоты при пероральном употреблении (около 5%) [67] существенно ограничивает ее клиническое применение, а внутривенный путь введения лекарственных средств в регулярной терапевтической практике в настоящее время считается сопряженным с достаточно высоким риском осложнений.

Таким образом, как с позиции частной патологической физиологии и фундаментальной кардиологии, так и с клинической точки зрения представляется важным подробное изучение механизмов патогенного, а в особенности - эндо- телиотоксического действия КФБ, поскольку именно эндотелиальные клетки непосредственно контактируют с находящимися в системном кровотоке минерало-органическими частицами.

Физико-химические свойства КФБ и их связь с их патогенными эффектами

Проведенные ранее эксперименты позволили предположить, что при умеренном перенасыщении крови ионами кальция и фосфора могут образовываться КФБ сферической формы, а при тяжелом перенасыщении - КФБ игольчатой формы [68, 69]. При этом известно, что форма наночастиц гидроксиапатита является одним из основных факторов, определяющих их токсичность; в частности, наночастицы игольчатой формы значительно токсичнее сферических [70-72], причем данная зависимость также характерна и для других типов наночастиц, не являясь специфичной для гидроксиапатита или форм фосфата кальция в целом [73]. Токсичность кристаллов гидроксиапатита определяется в том числе другими физико-химическими параметрами, такими как размерность [69, 70, 74], степень кристалличности [75], площадь поверхности [76], соотношение продольного и поперечного диаметров [76], а также наличие или отсутствие белковой оболочки [59]. Интересно, что значение для цитотоксичности КФБ имеют даже на первый взгляд незначительные различия их формы; так, игольчатые КФБ токсичнее палочковидных [76].

В целом принято считать, что токсичность наночастиц является мультифакториальным феноменом и определяется их размерностью, формой, степенью кристалличности, зарядом и площадью поверхности, а также минеральным и органическим составом [77-79]. Надлежащая характеризация физических и химических свойств бионов требует сочетания современных методов визуализации и химического материаловедения, включая электронную и атомно-силовую микроскопию, динамическое и электрофоретическое рассеяние света, методы элементного анализа и определения функциональных групп, рентгеновскую дифракто- метрию, аналитический электрофорез и хро- мато-масс-спектрометрию [77-79]. Важными особенностями физико-химического анализа бионов являются необходимость использования электронной и атомно-силовой микроскопии высокого разрешения, а также оценки органического профиля, так как бионы характеризуются адсорбцией макромолекул из окружающей биологической жидкости [80-82]. Кроме того, при перенасыщении окружающей среды определенными ионами может происходить смена входящих в состав бионов функциональных групп; так, искусственно синтезированные кальций-карбонатные и кальций-сульфатные бионы могут переходить в КФБ при перенасыщении среды фосфат-анионом посредством реакций ионного обмена, а также путем растворения и повторной преципитации, однако релевантность этих экспериментов происходящим in vivo биохимическим процессам остается неясной [83].

В то же время результаты приведенных выше работ существенно различаются в зависимости от сочетания указанных факторов. К примеру, окруженные белковой оболочкой сферические наночастицы гидроксиапатита (КФБ) менее 300 нм в диаметре не вызывали выброса активных форм кислорода или выделения про- воспалительного цитокина интерлейкина-ip в экспериментах на линии макрофагов человека THP-1 [69] в сравнении с микроразмерными (более 1 мкм) частицами, в то время как сферические наночастицы гидроксиапатита без белковой оболочки диаметром около 100 нм, напротив, стимулировали выделение интерлей- кина-ip первичными полученными из костного мозга дендритными клетками мыши в сравнении с аналогичными частицами диаметром 20 и 100 мкм [70]. Частицы гидроксиапатита с меньшей степенью кристалличности были более токсичными для первичных клапанных интерстициальных и эндотелиальных клеток свиньи, чем более кристаллизированные частицы [75], однако для первичных аортальных гладкомышечных клеток человека состоящие из аморфного фосфата кальция частицы были нетоксичны, в отличие от кристаллов гидроксиапатита [84]. Кроме того, эксперименты на иммортали- зованных макрофагах крысы продемонстрировали, что именно кристаллические, но не аморфные КФБ способны вызывать опосредованное сигнальным путем Толл-подобных рецепторов выделение интерлейкина-ip и фактора некроза опухоли [85]. Различия в форме и кристалличности КФБ также влияют на их интернализацию и распределение в организме, что с целью сохранения логичности описания их токсических эффектов и их механизмов будет описано в последующих разделах.

Патогенные эффекты КФБ in vivo

Возможность формирования КФБ на животной модели была впервые показана при курсовом введении ингибитора костной минерализации этидроната [86]. Подкожная инъекция эти- дроната крысам в дозировке 8 мг/100 г массы тела приводило к повышению уровня общего кальция в 1,8 раза (до 4,3 ммоль/л), фосфора в 1,6 раза (до 5,6 ммоль/л), а матриксного Gla-белка - в 25 раз (до 12 мкг/мл), что в ре-зультате приводило к образованию в системном кровотоке минерало-органических наночастиц, на 80% состоявших из фетуина-А, на 18% - из минеральной составляющей и на 2% - из ма- триксного Gla-белка [86]. Максимальная концентрация КФБ в сыворотке наблюдалась через 6 часов после введения этидроната, при этом выведение КФБ осуществлялось в течение 24 часов [86]. Напротив, введение ингибиторов костной резорбции кальцитонина, алендрона- та, ибандроната и остеопротегерина предотвращало подобные эффекты этидроната, доказывая причинно-следственную связь между опосредованной функционированием остеокластов костной резорбцией, повышением уровня кальция и фосфора в крови и формированием КФБ [87, 88]. При помощи повышения дозировки этидроната до 32 мг/100 г массы тела удалось провести осаждение КФБ при помощи стандартного центрифугирования (16,000 x g), в то время как дозировка в 8 мг/100 г массы тела позволяла седиментировать КФБ лишь при ультрацентрифугировании (164,000 x g) [89]. Осаждение КФБ также возможно с использованием модели аденин-индуцированной почечной недостаточности крыс [90] и крыс, получающих питание с очень низким содержанием белка (2,5% вместо стандартных 19%) [91], что соответствует подобным клиническим сценариям. Последующий искусственный синтез in vitro подтвердил роль фетуина-А в формировании КФБ, воспроизведя полученные при введении этидроната крысам результаты [92].

Флюоресцентное мечение входящего в состав КФБ фетуина-А в процессе искусственного синтеза позволило установить, что период полувыведения КФБ из системного кровотока после их формирования составляет всего лишь 45 минут, при этом КФБ частично депонируются в клетках Купфера (резидентных макрофагах печени) уже через 2 минуты после введения, и период их полувыведения в них составляет 3 минуты [93] с практически полной элиминацией через 25 минут [85]; в то же время эксперименты с различными видами КФБ указывают на длительное задерживание флюоресцентного сигнала в клетках Купфера, не ослабевающее даже через 30 минут после введения, что может зависеть от степени кристалличности и вида фосфата кальция, входящего в состав КФБ [85]. Через 25 минут после инъекции высококристаллические КФБ также наблюдались и в эндотелиальных клетках синусоидных капилляров печени [85]. В целом скорость элиминации КФБ в печени и участие эндотелиальных клеток синусоидных капилляров печени в этом процессе определялось их физико-химическими свойствами, что подчеркивает важность их изучения и детального описания протокола искусственного синтеза КФБ.

Отражаемый флюоресцентным сигналом максимум накопления КФБ в печени наблюдался через 30 минут после их внутривенного введения и составлял 31% от введенного количества частиц [93]. Кроме того, КФБ также частично депонировались в макрофагах краевой зоны селезенки, хотя в и полутора- или двукратно меньшем объеме по сравнению с печенью [93]. При этом нокаут гена скавенджер-ре- цептора А1/11 существенно снижал эффективность выведения КФБ из системного кровотока макрофагами печени и селезенки [93]. В свою очередь, нокаут кодирующих фетуин-А и апо- липопротеин Е генов у мышей способствовал развитию каротидных атеросклеротических бляшек, сопровождавшихся колокализацией CD68-положительных макрофагов и флюоресцентно меченных КФБ [93].

Внутривенное введение КФБ нормолипиде- мическим крысам после баллонной ангиопластики провоцировало развитие концентрической или эксцентрической гипертрофии интимы, выражающейся в увеличении толщины отношения интимы к медии, уже через 5 недель после введения, однако эти результаты были получены на относительно небольшой выборке животных (п = 7 на группу) и поэтому нуждаются в подтверждении [30]. Аналогичные результаты были получены в предыдущих экспериментах на новозеландских белых кроликах, подвергшихся баллонной ангиопластике сонной артерии, однако в них объем выборки был еще меньшим (п = 2-3) [94] или эквивалентным (п = 7) [95]. Альтернативной моделью могли бы стать мыши с нокаутированными генами, кодирующими аполипопротеин Е или рецептор к липопротеинам низкой плотности, которые вследствие этого обладают врожденной склонностью к развитию атеросклероза, однако в этом случае представляется невозможным отдифференцировать атеросклеротические очаги, сформированные в результате воздействия КФБ. В то же время, возможно, имело бы смысл оценить общий объем атеросклеротического поражения при помощи тотального окрашивания аорты специфичными к липидам красителями (к примеру, Oil Red). В целом исследований по токсичности КФБ in vivo было проведено немного, и особенности формирования неоинтимы при их внутривенном введении, а также способность КФБ вызывать гипертрофию интимы per se (без предварительного повреждения артерии) остаются неясными, требуя дальнейшего изучения. Также неясно, влияют ли КФБ на развитие воспаления в адвенти- ции и периваскулярной жировой ткани, которое вносит существенный вклад в развитие атеросклероза наряду с происходящими в неоинтиме процессами [36]. Наконец, остается неизвестным, различается ли выраженность патогенных эффектов КФБ в сосудистых сегментах с ламинарным и турбулентным кровотоком.

Патогенные эффекты КФБ in vitro

Цитотоксическое действие КФБ было убедительно показано в ряде работ на различных клеточных линиях, включая эндотелиальные клетки [30], сосудистые гладкомышечные клетки [96] и макрофаги [59, 69]. Воздействие КФБ вызывало повышение уровня расщепленных форм ключевых ферментов внутреннего пути апоптоза каспазы-9 и каспазы-3, а также расщепленной формы субстрата каспазы-3 по- ли(АДФ-рибоза)полимеразы-1 в эндотелиальных клетках [30], в то время как предварительная обработка макрофагов ингибитором каспаз z-VAD-fmk препятствовала индуцируемой КФБ клеточной гибели [59]. В соответствии с современной классификацией путей клеточной смерти [97] можно предположить, что клеточная гибель при воздействии КФБ действительно идет по внутреннему пути апоптоза, однако проведенные эксперименты не позволяют исключить и других вариантов, в частности, лизосомаль- но-опосредованной клеточной смерти. В то же время КФБ демонстрировали меньшую токсичность для макрофагов в сравнении с кристаллами чистого гидроксиапатита, что свидетельствует в пользу протективной роли входящих в их состав белков (альбумина, фетуина-А и других), в том числе покрывающих их [59].

В качестве морфологического субстрата цитотоксичности КФБ была предположена их интернализация, что было подтверждено при помощи просвечивающей электронной микроскопии после добавления КФБ к культурам им- мортализованных венозных эндотелиальных клеток человека [30], первичных аортальных гладкомышечных клеток свиньи [96] и иммор- тализованных макрофагов мыши [59]. Предварительная обработка клеток ингибитором полимеризации актина цитохалазином D или ингибитором клатрин-опосредованного эндоци- тоза хлорпромазином снижало эффективность интернализации КФБ первичными макрофагами мыши, дифференцированными из соответствующих прогениторов костного мозга, в то время как воздействие ингибитора кавеол-опо- средованного эндоцитоза генистеина и ингибитора макропиноцитоза 5-^^-диметил)амило- рида не оказывало подобного эффекта [93]. Более подробная расшифровка механизма интернализации КФБ показала, что ингибирование опосредующей передачу сигнала при FcY-ре- цептор-опосредованном эндоцитозе фосфои- нозитол-3-киназы Ly294002 гидрохлоридом, блокировка активности маннозосвязывающего рецептора маннаном и связывание рецептора конечных продуктов гликирования гликирован- ным сывороточным альбумином также не влияла на интернализацию КФБ вышеуказанной линией первичных макрофагов [93].

В то же время ингибирование скавенджер-ре- цепторов полиинозиновой кислотой частично препятствовало интернализации КФБ, предполагая их активную роль в этом процессе с учетом участия клатрина и полимеризации актина [93]. Блокирование широкого спектра скавен- джер-рецепторов (рецепторов комплемента 3 типа, CD16/CD32, Толл-подобного рецептора 2, Толл-подобного рецептора 4, CD36 и сиало- адгезина) посредством специфических антител не выявило изменений в динамике интернализации КФБ макрофагами, как и нокаут генов, кодирующих CD36, FcY-рецептор, аннексины А5 и А6, а также галектины 1 и 3 [93]. Ключевая роль в интернализации КФБ принадлежала ска- венджер-рецептору А1/11, нокаут гена которого либо конкурентное связывание со специфическим лигандом ацетилированным липопротеином низкой плотности снижал эффективность этого процесса макрофагами в полтора-два раза [93]. Данные результаты были в дальнейшем подтверждены другой научной группой, в экспериментах которой как полиинозиновая кислота, так и блокада скавенджер-рецептора А1/ II специфическим антителом существенно снижали эффективность интернализации КФБ, частично спасали макрофаги от вызываемой КФБ клеточной гибели и снижали выделение ими фактора некроза опухоли [59]. В то же время воздействие КФБ само по себе провоцировало дозо-и времязависимое увеличение экспрессии этого рецептора на плазматической мембране макрофагов независимо от их апоптоза, запуская таким образом механизм положительной обратной связи, обусловливающей регуляцию их ускоренной интернализации в аутокринной манере и объясняющей таким образом их высокую цитотоксичность [59]. Специфичность такого эффекта КФБ на молекулярном уровне было подтверждено его неизменностью при добавлении к клеточным культурам ингибитора каспаз z-VAD-fmk [59].

Дальнейшие эксперименты на клеточных культурах продемонстрировали, что объем интернализации КФБ может зависеть от их физико-химических свойств, в частности, формы (сферическая или веретеновидная) и степени их кристалличности [85]. Кроме того, дифференцированные из прогениторов костного мозга первичные макрофаги мыши и первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека характеризовались различной способностью к интернализации вышеуказанных типов КФБ - макрофаги были склонны к интернализации веретеновидных высококристаллических КФБ, в то время как эндотелиальные клетки, напротив, интернализировали сферические низкокристаллические КФБ [85]. Аналогичные результаты были получены на первичных макрофагах человека, дифференцированных из моноцитов, и первичных аортальных эндотелиальных клетках человека [85]. Нокаут гена скавен- джер-рецептора А1/11 или их блокада соответствующим антителом снижали эффективность интернализации веретеновидных высококристаллических КФБ, однако не влияли на интернализацию сферических низкокристаллических КФБ [85]. Это, в свою очередь, позволило предположить, что КФБ с разными физико-химическими свойствами связываются различными рецепторами, экспрессия которых существенно зависит от типа клеток [85]. В то же время предварительная обработка клеточных культур цитохалазином D, хлорпромазином или полиинозиновой кислотой снижала эффективность интернализации КФБ независимо от их физико-химических свойств [85]. Таким образом, за связывание разных типов КФБ могут быть ответственны различные рецепторы, однако после этого механизм эндоцитоза и внутриклеточного метаболизма КФБ является универсальным и поэтому в значительной степени менее зависимым от типа клеток.

Центральную роль в развитии дисфункции эндотелия и нарушении сосудистого гомеостаза играет изменение паракринного профиля эндотелиальных клеток, сопровождающееся выделением провоспалительных цитокинов и сдвигом профиля секретируемых в микроокружение внеклеточных везикул [9, 34, 35, 98, 99]. В настоящее время считается доказанным усиление выделения ряда цитокинов различными типами клеток под воздействием КФБ, включая эндотелиальные [30], сосудистые гладкомышечные [84, 100, 101] и макрофаги [59, 69, 85]. При этом спектры цитокинов, повышенно выделяемых указанными видами клеток, частично перекрываются: эндотелиальные клетки независимо от линии характеризуются увеличенной секрецией интерлейкина-6 и интерлейкина-8 [30], сосудистые гладкомышечные клетки - интерлейкина-1в, интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли [84, 100, 101], а макрофаги - ин- терлейкина-1в и фактора некроза опухоли [59, 69, 85]. Нокаут гена, кодирующего Толл-подобный рецептор 4, приводил к почти полному отсутствию выделение приведенных цитокинов макрофагами как в контрольной культуре, так и при воздействии КФБ, что свидетельствует о его ключевой роли в этом процессе [85]. Интересно, что выделение цитокинов макрофагами также зависело от физико-химических свойств КФБ: сферические низкокристаллические КФБ вызывали повышенную секрецию фактора некроза опухоли, а веретеновидные высококристаллические - интерлейкина-1в [85]. Выделение провоспалительных цитокинов различными типами клеток сосудистой стенки приводит к их паракринному влиянию друг на друга, что в конечном счете в сочетании с возможным изменением профиля секреции внеклеточных везикул создает провоспалительное микроокружение, способствующее формированию неоинтимы [9, 34, 35, 98, 99].

Одним из ведущих механизмов формирования неоинтимы является пролиферация сосудистых гладкомышечных клеток, в патологических условиях меняющих фенотип с сократительного на синтетический и вследствие этого активно синтезирующих белки экстра- целлюлярного матрикса [102, 103], что в том числе вызывается воздействием КФБ [30]. При этом нарушения местного и системного фосфорнокальциевого гомеостаза способны приводить к биоминерализации неоинтимы, обусловленной остеогенной дифференцировкой сосудистых гладкомышечных клеток [102-105]. В свою очередь, остеогенная дифференцировка сосудистых гладкомышечных клеток может вызываться непосредственно повышением ионов кальция и фосфора в микроокружении [102], индуцироваться содержащими кальций и фосфаты внеклеточными везикулами, дополнительно генерирующими ионы фосфора за счет эктонуклеотидаз (к примеру, щелочной фосфатазы или 5'-нуклеотидазы) и несущими на своей мембране высокоаффинные к ионам кальция аннексины А2, А5 и А6 [106, 108] или вызываться воздействием КФБ [60, 84, 96, 109, 110]. Данное направление клеточной трансдиффе- ренцировки сопровождается постепенным снижением экспрессии гладкомышечных маркеров (альфа-гладкомышечный актин, тяжелые цепи миозина гладких мышц, смузелин, кальпонин) и усилением остеогенных маркеров (остеопон- тин, остеокальцин, щелочная фосфатаза, коллаген II и X типа) и управляется транскрипционными факторами RUNX2, Osteгix, MSX2 и SOX9 [102]. Кроме того, при остеогенной диф- ференцировке сосудистых гладкомышечных клеток отмечается повышенная секреция про- воспалительных цитокинов [102, 103], что также наблюдалось при воздействии на них КФБ [84, 100, 101].

В частности, добавление КФБ к первичным аортальным гладкомышечным клеткам человека приводила к дозозависимому формированию связанных с клетками кальцификатов в течение суток, причем данный процесс был сопряжен с клеточной жизнедеятельностью, сопровождался интернализацией КФБ и не был характерен для фиксированных параформальдегидом клеток [60, 84, 109]. Кальцификация первичных аортальных гладкомышечных клеток человека ускорялась в присутствии рекомбинантного фактора некроза опухоли, который также выделялся ими в результате экспозиции КФБ, и ингибировалась нокдауном гена, кодирующего этот белок, и гена соответствующего рецептора [84], а также добавлением к клеткам донора обладающего вазо- и цитопротек- тивным действием сульфида водорода гидросульфида натрия [109]. Элиминация КФБ из сыворотки крови пациентов с терминальной хронической почечной недостаточностью предотвращала ее прокальцифицирующее влияние на первичные аортальные гладкомышечные клетки человека, также снижая выделение ими интерлейкина-1в и циклооксигеназы-2 [60]. Напротив, добавление выделенных из сыворотки крови данных пациентов КФБ к сыворотке крови от контрольных пациентов стимулировало остеогенную дифференци- ровку аортальных гладкомышечных клеток и выброс ими провоспалительных цитокинов в микроокружение [60]. В свою очередь, эти эффекты нейтрализовывались при добавлении к сыворотке Y-карбоксилированного Gla-богатого белка [60]. В то же время эти данные являются противоречивыми, и в некоторых исследованиях КФБ не вызывали выраженной клеточно-опосредованной кальцификации как иммортализованных аортальных гладкомышечных клеток мыши, так и клеток остеосаркомы человека [110]. Более того, добавление КФБ к клеткам остеосаркомы даже замедляло их минерализацию за счет аккумулирования растворенного кальция и фосфора [110]. Динамика клеточно-опосредованной вызываемой КФБ кальцификации может также варьировать от суток [60, 109] до 28 дней [96].

Несмотря на доказанную токсичность КФБ для эндотелиальных и сосудистых гладкомышечных клеток, их роль в нарушении сосудистого гомеостаза остается в значительной степени нерасшифрованной. В частности, остается неизвестным их влияние на некоторые клеточные популяции адвентиции (лимфоциты, фибробласты, первичные адвентициальные макрофаги), а также на периваскулярные адипо- циты. Отсутствие транскриптомного или про- теомного профилирования первичных сосудистых клеточных линий при воздействии на них КФБ ограничивает понимание специфичности и других характеристик молекулярного ответа на эти частицы. Неясно, вызывает ли воздействие КФБ повышение экспрессии способствующих прикреплению лейкоцитов молекул клеточной адгезии на плазматической мембране эндотелиальных клеток, нарушение эндотелиальной механотрансдукции или развитие феноменов трансдифференцировки, к примеру, эндотелиально-мезенхимального перехода или перехода гладкомышечных клеток в миофи- бробласты, макрофаги или остеобласты. Также остается совершенно неисследованным изменение профиля секретируемых в микроокружение внеклеточных везикул сосудистыми клетками под воздействием КФБ.

Актуальные и нерешенные вопросы

К настоящему времени накоплено достаточное количество данных о функционировании системы минерального гомеостаза, обеспечивающей предотвращение эктопической кальцификации в организме человека. Доказано, что равновесие в этой системе поддерживается за счет целого ряда белков-ингибиторов, регулирующих костную резорбцию, связывающих свободные ионы кальция или нейтрализующих сформированные соединения фосфата кальция. Решающая роль в этом процессе принадлежит обладающему наибольшей авидностью и аффинностью к фосфату кальция фетуину-А, а также связывающему ионы кальция с низкой аффинностью, но присутствующему в чрезвычайно большом количестве в крови альбумину.

В случае неспособности системы минерального гомеостаза справиться с перенасыщением кальция и фосфора в крови при помощи связывания соответствующих ионов или нейтрализации фосфата кальция посредством образования субнаноразмерных кластеров в действие вступает еще один ключевой механизм поддержания фосфорнокальциевого гомеостаза - формирование КФБ. Данный механизм по своим возможностям депонирования кальция и фосфора не уступает субнаноразмерной кластеризации; в то же время, в отличие от этого механизма, КФБ не являются безвредными, обладая существенной токсичностью для эндотелия.

Морфологическим субстратом этого феномена является интернализация КФБ эндотелиальными клетками, что вызывает как их гибель по внутреннему пути апоптоза либо имеющим с ним общие эффекторные белки путям клеточной смерти, так и усиливает выделение провос- палительных цитокинов, что паракринно способствует созданию патологически измененного микроокружения и развитию дисфункции эндотелия. В конечном счете это может привести к нарушению целостности эндотелия, которое является доказанным пусковым фактором этиопатогенеза атеросклероза. Последствием вызванного воздействием КФБ повреждения эндотелия может быть формирование неоинтимы, являющееся неотъемлемым звеном патогенеза атеросклероза и морфологическим субстратом развития стеноза. В ряде исследований было показано, что КФБ также способны стимулировать выделение гладкомышечными клетками провоспалительных цитокинов в микроокружение и запускать сдвиг их фенотипа с контрактильного на остеогенный, однако остается неясным, насколько полученные на клеточных культурах данные релевантны происходящему in vivo сценарию.

Клиническая актуальность КФБ как звена патогенеза связанных с дисфункцией эндотелия заболеваний обусловлена возможностью их измерения в сыворотке крови при помощи проточной цитометрии или склонности сыворотки крови к их формированию при помощи микропланшетной турбидиметрии. Последние клинико-эпидемиологические работы предоставили достаточно убедительные данные о том, что повышенная склонность сыворотки крови к формированию КФБ связана с увеличенным риском острых сердечно-сосудистых событий, сердечно-сосудистой смерти и, следовательно, неблагоприятным прогнозом как у пациентов с хронической почечной недостаточностью на разных стадиях, так и у других когорт, к примеру, у больных артериальной гипертензией. Кроме того, пациенты с острым коронарным синдромом и без выраженной хронической почечной недостаточности характеризуются более высоким содержанием КФБ в сыворотке крови, чем аналогичные больные со стабильной стенокардией, что может отражать связь КФБ с прогнозом ишемической болезни сердца и без почечной коморбидности. Относительный успех клинического испытания по эффективности динатриевой соли этилендиамин- тетрауксусной кислоты в профилактике острых сердечно-сосудистых событий после инфаркта миокарда, в особенности у больных сахарным диабетом и пациентов с заболеваниями периферических артерий, позволяет также осуществлять фармакологическое воздействие на КФБ как звено патогенеза, хотя низкая биодоступность данного химического соединения при пероральном применении существенно ограничивает возможности его клинического использования.

Несмотря на убедительные доказательства токсического действия КФБ на эндотелий, остается неизвестным, чем обусловлено это явление - специфическим химическим составом КФБ или их корпускулярной природой, общей для всех типов эндогенных наночастиц и многих вводимых в кровь наноразмерных средств таргетной доставки лекарственных препаратов [111, 112]. Для получения ответа на данный вопрос представляется необходимым решить задачу искусственного синтеза «идеальной группы сравнения» - наночастиц, которые бы не могли быть синтезированы эндогенно в условиях человеческого организма, но которые бы не отличались от КФБ ничем, кроме собственно составляющих их минералов. Было предположено, что в качестве подобной группы сравнения могут выступить магний-фосфатные бионы (МФБ), поскольку: 1) по литературным данным МФБ наиболее близки к КФБ по размерности и форме [29];

2) МФБ не способны образовываться в организме человека вследствие кратно превышающей летальную дозы ионов магния (Mg2+), необходимой для их синтеза. Таким образом, использование МФБ в качестве контрольной группы позволяет надежно дифференцировать механизм эндотелиотоксического действия КФБ и сопоставить его с происходящим in vivo сценарием. В то же время эта гипотеза нуждается в экспериментальной проверке.

Литература / References

Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circ Res. 2016;118(4):620-636. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.115.306301.