Морфологическая характеристика эндотелиальной дисфункции при радиоиндуцированной патологии легких в эксперименте и ее модификация препаратом легочного сурфактанта

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека», г. Москва

ФГБОУ ВО Тюменский ГМУ Минздрава России, г. Тюмень

ФГБУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий им. академика А.М. Гранова» Минздрава России, г. Санкт-Петербург

ГБУЗ «Городская клиническая больница № 40 Департамента здравоохранения города Москвы», г. Москва

Морфологическая характеристика эндотелиальной дисфункции при радиоиндуцированной патологии легких в эксперименте и ее модификация препаратом легочного сурфактанта

Кириллов Ю.А.

Чернов И.А.

Малышева Е.М.

Тимофеев С.Е.

Жарков Н.В.

Сейлиев А.А.

Розенберг О.А.

Аннотация

эндотелиальный дисфункция легочный сурфактант

Цель. Изучить морфогенез эндотелиальной дисфункции в развитии радиоиндуцированной патологии легких в эксперименте и возможность ее модификации препаратом легочного сурфактанта. Материалы и методы. Исследование проведено на 82 нелинейных белых крысах-самцах породы Wistar возраста 3,5-4,0 месяца, массой тела 180,0-200,0 граммов, подразделявшихся на 3 группы: радиоиндуцированная патология лёгких (n = 42); крысы, получавшие интрахеально препарат Сурфактант БЛ (n = 30) и контрольная группа (n = 10). Изучено суммарное содержание фосфолипидов легочного сурфактанта, а также их фракционный состав, претерпевающие изменения в результате лучевого воздействия. При изучении материала использованы гистологические (окраска гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону, альциановым синим, по Маллори), иммуногистохимические (с антителами к CD31, CD34, CD117, VEGFR1, VEGFR2, e-NOS) и электронномикроскопические методы исследования.

Результаты. Воздействие интратрахеально введенного препарата Сурфактант-БЛ на легочную ткань проявилось спустя 7-14 суток после лучевого воздействия в виде ослабления распространенности повреждения, увеличения объема функционирующей ткани легкого по сравнению с показателями нелеченных животных. В капиллярах аэрогематического барьера наблюдали отсутствие спазма, снижение частоты и выраженности повреждения эндотелиальных клеток (дистрофия, внутриклеточный отек, нарушение ультраструктуры), тромбоцитарно-эритроцитарных ассоциаций и тромбов. Уровень экспрессии маркеров эндотелиальной функции к 14 суткам после введения облученным животным Сурфактанта-БЛ был в 1,5-2 раза выше показателей контрольной группы.

Заключение. Исследование показало, что Сурфактант-БЛ, будучи нативным природным многокомпонентным препаратом, выполняет in situ множественные функции, в том числе обеспечивает врожденный и приобретенный локальный иммунитет легочной ткани, влияет на многие триггерные точки лучевой патологии легких. Раннее введение Сурфактанта-БЛ играет роль в доставке антиоксидантов, функцию которых выполняют ненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов, способные «перехватывать» свободные радикалы, и соответственно, нивелировать оксидативный стресс и инициируемую им эндотелиальную дисфункцию. Именно поэтому целесообразно вводить сурфактант не до, а после лучевого воздействия на фоне реализовавшегося оксидативного повреждения.

Ключевые слова: радиоиндуцируемая патология легких, оксидативный стресс, эндотелиальная дисфункция, сурфактант.

Kirillov Yu.A., Chernov I.A., Malysheva E.M., Timofeev S.E., Zharkov N.V., Seiliev A.A., Rozenberg O.A.

Morphological characteristics of endothelial dysfunction in radioinduced lung pathology in the experiment and its modification by pulmonary surfactant preparation

Abstract

Aim. To study the morphogenesis of endothelial dysfunction in the development of radio-induced lung pathology in the experiment and the possibility of its modification with pulmonary surfactant preparation.

Materials and methods. The study was conducted on 82 non-linear white male rats of the Wistar breed, aged 3.5-4.0 months, weighing 180.0-200.0 grams, subdivided into 3 groups: radio-induced lung pathology (n - 42); rats that received the intrafactual preparation surfactant BL (n - 30) and the control group (n -10). We studied the total phospholipid content of pulmonary surfactant, as well as their fractional composition, undergoing changes as a result of radiation exposure. In the study of the material, histological (staining with hematoxylin and eosin, picrofuchsin according to Van Gieson, alcian blue, according to Mallory), immunohistochemical (with antibodies to CD 31, CD 34, CD 117, VEGFR1, VEGFR2, e-NOS) and electron microscopic studies were used.

Results. The effect of the intratracheally administered surfactant-BL preparation on the lung tissue was manifested 7-14 days after radiation exposure in the form of a weakening of the prevalence of damage, an increase in the volume of functioning lung tissue compared with untreated animals. The absence of spasm, a decrease in the frequency and severity of damage to endothelial cells (dystrophy, intracellular edema, violation of ultrastructure), platelet-erythrocyte associations, and blood clots were observed in the capillaries of the airborne barrier. The level of expression of endothelial function markers by 14 days after the administration of Surfactant-BL to irradiated animals was 1.5-2 times higher than in the control group.

Conclusion. The study showed that surfactant BL, being a native natural multicomponent drug, performs in situ multiple functions, including providing innate and acquired local immunity of the lung tissue, and affects many trigger points of radiation pathology of the lungs. The early administration of Surfactant-BL plays a role in the delivery of antioxidants, the function of which is performed by unsaturated fatty acids of phospholipids, which can «intercept» free radicals and, accordingly, neutralize oxidative stress and endothelial dysfunction initiated by it. That is why it is advisable to introduce surfactant not before, but after radiation exposure against the background of realized oxidative damage.

Key words: radioinduced lung pathology, oxidative stress, endothelial dysfunction, surfactant.

Актуальность

Стандарты оказания медицинской помощи больным, страдающим злокачественными новообразованиями грудной и внутригрудной локализаций, предусматривают, в частности, применение лучевого воздействия на область грудной клетки в комплексе с другими методами лечения. Данные клинических наблюдений свидетельствуют, что примерно в трети случаев после завершения лучевой терапии, в качестве побочного эффекта последней, в различные сроки появляются признаки лёгочной патологии. Был установлен примат повреждения кровеносных сосудов, прежде всего капилляров микроциркуляторного русла, при лучевом воздействии на легочную ткань [2]. В связи с отсутствием эффективных средств профилактики и лечения радиоиндуцированной патологии легких проведены исследования по изучению пато- и морфогенеза лучевых повреждений и разработке технологий и средств их коррекции [3, 7] включая экспериментальные работы [4]. Использование в эксперименте фосфатидилхолиновых липосом и препарата природного легочного сурфактанта сопровождалось уменьшением распространенности и выраженности лучевого альвеолита, ослаблением тяжести радиоиндуцированных альтераций альвеолоцитов II типа и активизацией процессов репарации на внутриклеточном и популяционном уровнях [4]. В работах последних лет существо радиоиндуцированной патологии легочной ткани объясняется развитием оксидативного (окислительного) стресса [8, 15, 17]. Вместе с тем, профилактика и лечение лучевых пневмонитов и фиброза осуществляются без учета инициированной оксидативным стрессом эндотелиальной дисфункции [9, 11, 13].

Целью настоящей работы явилось установление наличия и особенностей эндотелиальной дисфункции, возникающей при экспериментальной радиоиндуцированной патологии легких, и выяснение возможностей ее модификации интратрахеальным введением препарата легочного сурфактанта.

Цель

Установить наличие и особенности эндотелиальной дисфункции, возникающей при экспериментальной радиоиндуцированной патологии легких, и выяснить возможности ее модификации интратрахеальным введением препарата легочного сурфактанта.

Материалы и методы

Опыты проведены на нелинейных белых крысах-самцах породы Wistar возраста 3,5-4,0 месяца, массой тела 180,0-200,0 г. Всего в опытах использовано 82 крысы, подразделявшихся на 3 группы: радиоиндуцированная патология лёгких (42 животных); крысы, получавшие интрахеально препарат Сурфактант БЛ (30 животных) и контрольная группа (10 животных). Во время однократного локального облучения в дозе 12 Гр (РУМ - 17, напряжение 200 кВ, сила тока 15 мА, фильтры 0,5 мм Си+ 1,0 мм А1, кожно-фокусное расстояние 25 см, мощность дозы 32 мГр/с) животное находилось под наркозом (нембутал внутрибрюшинно в объеме 40 мг/кг веса), и тело животного было защищено свинцовым экраном толщиной 6 мм с прямоугольным окном размерами х 2,5 см. Препарат Сурфактант-БЛ (ООО «Биосурф», Россия) вводили ингаляционно через 15 минут после завершения лучевого воздействия и один раз в сутки в течение последующих двух дней по 10 мг/кг (суммарная доза составила 30 мг/кг). Перед использованием препарат Сурфактант-БЛ эмульгировали 0,9% раствором хлорида натрия в необходимом объеме. Животным контрольной группы в те же сроки и в аналогичном объеме вводили ингаляционно физиологический раствор. Животных выводили из эксперимента путем внутрибрюшинного введения нембутала в дозировке 80 мг/кг массы на 1, 3, 7, 14, 50 и 90 сутки после радиационного воздействия.

Количественное определение фосфолипидов (ФЛ) легочного сурфактанта (ЛС) и их фракционного состава определяли после его выделения из лаважной жидкости легкого крысы. Для этого через трахею трижды вводили в легкое по 4 мл 0,9% NaCl. Суммарный объем лаважной жидкости около 10-12 мл центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут на лабораторной центрифуге с охлаждением (+40 °С) для освобождения материала от клеток и дебриса. Супернатант, содержащий ЛС, замораживали при -20 °С и выдерживали при этой температуре в течение двух часов. Затем суспензию центрифугировали при 15000 G на лабораторной центрифуге при температуре +40°С и осадок экстрагировали смесью хлороформа и метилового спирта в соотношении 2:1, упаривали смесь на ротационном испарителе (ВисЫ, Швейцария) и определяли в ней количество ФЛ по содержанию липидного фосфора после сжигания пробы при 1800 °С в хлорной кислоте [16]. Эвтаназию остальных животных осуществляли в те же сроки эксперимента и тем же способом. У животных, находившихся в состоянии глубокого наркоза, вскрывали грудную клетку, и через прокол трахеи медленно вводили 10% раствор формалина до момента расправления ткани обоих легких. Последующую фиксацию органа также проводили в 10% нейтральном формалине продолжительностью 24 часа. После окончания фиксации образцы легочной ткани, полученные из субплевральных и интрапульмонарных отделов средней доли правого легкого, проводили по стандартной методике и заключали в парафин, с последующим приготовлением 5 мкм срезов, окрашиваемых гематоксилином и эозином, альциановым синим, пикрофуксином по ван Гизону и по Маллори.

Для электронномикроскопического исследования образцы ткани из периферических и центропульмонарных отделов средней доли правого легкого объемом примерно 1 мм3 фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида на коллидиновом буфере (pH = 7,4) при комнатной температуре в течение 1,5 часов, промывали несколькими порциями того же буфера в течение 30 минут. Кусочки ткани дофиксировали в 1% растворе тетроксида осмия на коллидиновом буфере в течение 1,0-1,5 часов при температуре +4+60 °С. Материал обезвоживали в спиртах восходящей концентрации (от 50% до 96%) и нескольких порциях эфира, заливали в аралдит. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим, а ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Визуализацию структуры тканей в ультратонких срезах проводили с использованием электронного микроскопа JEM-100B и сканирующего электронного микроскопа Zeiss EVO LS10 (Zeiss, Германия) с установленным детектором для просвечивающей микроскопии (STEM). Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) срезов для идентификации эндотелиальных клеток (ЭК), циркулирующих эндотелиальных клеток (ЦЭК) и предшественников эндотелиальных клеток (ПЭК) с целью характеристики эндотелиальной функции проводили с применением антител к CD31, CD34, CD117, VEGFR1, VEGFR2 и эндотелиальной синтазе оксида азота (e-NOS). ИГХ исследование выполняли на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм. Депарафинирование, демаскировку антигеном и ИГХ реакции проводили в соответствии со стандартными протоколами с использованием автостейнера Leica Bond Max (Германия). В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к CD31 (клон JC70, Cell Marque, разведение 1:100), CD34 (клон QBEnd/10, Cell Marque, разведение 1:100), кроличьи моноклональные антитела к CD117 (клон YR145, CellMarque, разведение 1:100) и кроличьи поликлональные антитела к VEGFR1 (GeneTex, разведение 1:100), VEGFR2 (GeneTex, разведение 1:100), e-NOS (Cloud-Clone Corp., разведение 1:100). После проведения ИГХ реакции ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера.

Оценку ИГХ реакции проводили с использованием полуколичественных и количественных методов. Для CD31, CD34 оценивали интенсивность реакции по шкале от 0 до 3 баллов (0 - реакция отсутствует, 1 - слабая реакция, 2 - умеренная реакция, 3 - выраженная реакция). Для VEGFR1 и VEGFR2 помимо оценки интенсивности реакции также подсчитывали количество позитивно окрашенных клеток в одном поле зрения (при увеличении х200). Подсчет количества позитивно окрашенных клеток выполняли в 50 полях зрения (х200) и рассчитывали среднее арифметическое. Для CD117 по такой же методике определяли среднее значение позитивно окрашенных клеток отдельно в морфологически неизмененной ткани легкого и участках фиброза, а для e-NOS дополнительно в эпителии, клетках стромы и полях фиброза.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы IBM SPSS Statistics 25 (IBM, США) путем расчета средних значений, стандартного отклонения, стандартной ошибки средних T-критерия Стьюдента и критерия х2.

Результаты

Изменения легочной ткани спустя 1 сутки после облучения были отмечены лишь на ультраструктурном уровне и только в капиллярах аэрогематического барьера в виде умеренно расширенного просвета и полнокровия. Экспрессия маркеров эндотелиальной функции и суммарное содержание фосфолипидов сурфактанта не отличались от таковых в контрольной группе.

Через трое суток на тотальных срезах на фоне сохранения воздушности наблюдали усиление полнокровия легочной ткани, как в центропульмональных, так и в периферических участках, причем в последних в большей степени. Межальвеолярные перегородки выглядели умеренно утолщенными, в капиллярах отмечали выраженное набухание эндотелия, сопровождавшееся резким просветлением цитозоля, практически полным отсутствием органелл, просвет капилляров выглядел суженным и был заполнен эритроцитами (рис. 1). В осмиофильных пластинчатых тельцах (ОПТ) альвеолоцитов II типа наблюдали адгезию мембран, нарушение их нормального горизонтального или концентрического расположения. В этот период эксперимента суммарное содержание фосфолипидов, до этого неуклонно уменьшавшееся, достигло своего минимума (рис. 2). Значения экспрессии маркеров ЭК, ЦЭК и ПЭК, характеризующих эндотелиальную функцию, представлены в таблицах 1 и 2.

Через неделю (7 сутки) выраженные расстройства кровообращения (серозно-геморрагический люминарный отек, полнокровие капилляров и диапедез эритроцитов) идентифицировали уже на светооптическом уровне (рис. 3).

Рис. 1. Радиоиндуцированное повреждение легких, 3 сутки. Утолщение и клеточная инфильтрация межальвеолярных перегородок (МАП). Выраженное набухание эндотелия (ЭН), резкое уменьшение количества органелл. В капиллярах (КАП) - многочисленные эритроциты. В просвете альвеолы (ПА) - фрагменты альвеолоцита второго типа. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ), х9400

Рис. 2. Динамика содержания фосфолипидов сурфактанта в легком крыс при лучевом альвеолите

Таблица 1. Оценка иммуногистохимической реакции с антителами к CD 31, CD34 и e-NOS

Примечание: R - радиоиндуцированное воздействие, S - ингаляция препарата легочного сурфактанта после завершения облучения; оценка иммуногистохимической реакции с антителами к CD31, CD34 и e-NOS: - - реакция отсутствует; + - слабая реакция; ++ - умеренная реакция; +++ - выраженная реакция.

Таблица 2. Оценка иммуногистохимической реакции с антителами к CD117, VEGFR1 и VEGFR2 (количество позитивно окрашенных клеток в 1 поле зрения, *200)

Примечание: п - число полей зрения, R - радиоиндуцированное воздействие, S - ингаляция препарата легочного сурфактанта после завершения облучения, * - р<0,05, Т - р<0,01, § - р< 0,001 по сравнению с контрольной группой.

Рис. 3. Радиоиндуцированное повреждение легких, 7 сутки. Диффузное утолщение межальвеолярных перегородок, полнокровие капилляров, участки диапедезных кровоизлияний, серозно-геморрагический экссудат в просвете альвеол. Окраска гематоксилином и эозином. х200

Биохимическое исследование фосфолипидов легочного сурфактанта выявило прогрессирующее снижение фракций фосфатидилэтаноламинов, фосфатидилглицерина и дифосфатидилглицерола (кардиолипина) на фоне некоторого увеличения общего содержания фосфолипидов (рис. 4).

Рис. 4. Динамика изменения некоторых фракций фосфолипидов сурфактанта легкого крыс при лучевом альвеолите: ФС - фосфатидилсерин, ФИ - фосфатидилинозитид, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, ФГл - фосфатидилглицерин, КЛ - кардиолипин

Интервал между 7 и 14 сутками стал в известной степени критическим для проводимого эксперимента. Он характеризовался прогрессированием вышеописанных признаков и «продвижением» лучевых альтераций вглубь легкого, т.е. в дистальном по отношению к плевре направлении. Кроме того, этот период ознаменовался появлением ателектазов, как тотальных, так и в сочетании с дистелектазами, причем в той же последовательности идентификации альтераций, т.е. первоначально субплеврально. Содержание фосфолипидов было незначительно увеличено по сравнению с контролем, однако значения фосфатидилглицерина, кардиолипина и фосфатидилэтаноламина по-прежнему были ниже контрольных значений.

Интенсивность экспрессии маркеров эндотелиальной функции ^ 117, VEGFR-2) соответствовала невысоким значениям, а по некоторым показателям (e-NOS, CD31, CD34) вовсе отсутствовала. Особенностями изменений легочной ткани спустя 50 суток после начала эксперимента были развитие склеротических изменений в виде прогрессирования альвеолярно-капиллярного блока, приобретение последним клеточно-волокнистого и волокнистого характера и сохраняющиеся расстройства кровообращения. Просветы капилляров повсеместно выглядели расширенными, деформированными и приобретали вид причудливых сосудистых полостей «каверн». В участках реализовавшихся ателектазов изменения сосудистой внутриорганной сети проявлялись в выраженной редукции капиллярного русла (рис. 5). Общее содержание фосфолипидов превысило контрольные показатели, однако значения фосфатидилэтаноламинов, фосфатидилглицерина и кардиолипина были снижены. Экспрессия маркеров эндотелиальной функции проявлялась по-разному в участках склероза и повышенной воздушности. В участках предсуществующих ателектазов наблюдали существенное повышение зон выраженной экспрессии CD 34, e-NOS и ЦЭК, не сущих маркер VEGFR 2. В зонах повышенной воздушности, особенно в участках альвеолярно-альвеолярных контактов маркер ЭД CD117 был существенно снижен.

Рис. 5. Радиоиндуцированное поражение легких, 50 сутки. Редукция капилляра (КАП) в участке реализовавшегося ателектаза. КВ - коллагеновые волокна, ЭР - эритроциты. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), х7400

В заключительный период эксперимента (90 сутки) в легочной ткани наблюдали сочетание очаговых склеротических изменений в виде полей склероза на месте предсуществующих ателектазов и диффузных изменений в виде утолщения межальвеолярных перегородок за счет соединительнотканной трансформации. Фракционный состав фосфолипидов сурфактанта соответствовал показателям контрольной группы, за исключением фосфатидилэтаноламина, фосфатидилглицерина и кардиолипина, содержание которых было сниженным в течение всего эксперимента и не нормализовалось. В участках склероза наблюдали значительное увеличение ЦЭК, несущих маркеры рецепторов сосудистоэндотелиального фактора роста VEGFR 1, VEGFR 2, указывающих на интенсификацию неоангиогенеза. На этот же феномен указывает и повышение зон экспрессии маркера ПЭК - CD34. Эти важные для оценки эндотелиальной функции маркеры и их значения претерпевали существенные изменения на протяжении эксперимента. Так, маркер CD34, характерный для незрелых ПЭК, исчезал на 3 сутки после облучения (первая точка наблюдения) во всех полях зрения, как в просвете сосудов, включая эндотелий, так и в зонах ангиогенеза и отсутствовал вплоть до 14 суток. Появление Ш34-маркированных зон у облученных животных было выявлено только на 50-90 сутки, тогда как у животных, получавших Сурфактант-БЛ, ПЭК, несущие маркер CD34, не определяли только на 3 сутки. С 7 суток и далее в течение всего эксперимента они вновь присутствовали у леченных животных, а после 14 суток экспрессия этого маркера в данной группе была существенно выше по сравнению с контрольной группой и контингентом облученных животных, не получавших Сурфактант-БЛ. Свидетельством трансформации ПЭК в ЦЭК, была инициация индукции рецепторов эндотелиального фактора роста VEGF и появлением на поверхности ЦЭК маркеров VEGFR2. Число ЦЭК у животных, получавших после облучения Сурфактант-БЛ, судя по экспрессии рецепторов эндотелиального фактора роста VEGFR2, было повышенным на всех сроках наблюдения в 1,5 раза по сравнению с облученными животными, не получавшими сурфактант (табл. 2). Усиленная экспрессия биомаркера CD34 в зонах инфильтративно-пневмонического фокуса может служить признаком выраженных репаративных процессов с интенсивной пролиферацией эндотелиоцитов, которые участвуют в реваскуляризации [1].

Важную инициирующую роль в развитии эндотелиальной дисфункции, как уже было упомянуто ранее, играют оксидативный стресс, синтез мощных вазоконстрикторов, а также цитокинов и фактора некроза опухоли, которые подавляют продукцию оксида азота (NO) [12].

Окидативный стресс определяется как нарушение баланса между избыточным образованием свободных радикалов и недостаточностью механизмов антиоксидантной защиты [10]. Общеизвестно, что в патогенезе лучевого поражения, в том числе лучевого альвеолита, действие образующихся в процессе радиолиза воды свободно радикальных агрессивных молекул направлено в том числе и на инактивацию оксида азота, поэтому снижение содержания последнего считается одним из маркеров эндотелиальной дисфункции (ЭД). Поскольку оксид азота является нестабильным соединением, трудно поддающимся мониторинговому исследованию, обычно о его концентрации судят по активности эндотелиальной NO-синтазы (e-NOS).

В настоящем исследовании выявлено, что в контрольной группе уровень e-NOS характеризуется слабой реакцией с антителами. При облучении эндотелиальные клетки с этим маркером исчезают в образцах на 7 сутки у нелеченных животных и вновь появляются и идентифицируются при полуколичественном измерении в виде слабой реакции лишь на 50 сутки и сохраняются в этом проявлении до завершения эксперимента (рис. 6). На фоне введения Сурфактанта-БЛ облученным крысам экспрессия этого маркера не только не исчезает, но и интенсифицируется, начиная с 3 суток эксперимента до умеренной реакции, а с 50 до 90 суток приобретает выраженный характер (рис. 7). Аналогичная тенденции была отмечена при оценке клеток с антителами к CD117, VEGER1 и CD31 (PECAM 1), что свидетельствует о существенной активации ангиогенеза в данной группе наблюдения по сравнению с животными, не получавшими сурфактант БЛ. Данные характеристики были отмечены, в том числе, и в участках интенсивного фиброзирования. Следует отметить, что функции PECAM 1 многообразны, и этот экстрацеллюлярный фактор, кроме модуляции ангиогенеза, повышает стабильность мембран эндотелиальных клеток и регулирует их барьерные свойства [14].

Рис. 6. Радиоиндуцированое поражение легких, 50 сутки. Иммуногистохимическое исследование с антителами к эндотелиальной синтазе (e-NOS). Экспрессия e-NOS (+) в участке склероза. х200

Рис. 7. Радиоиндуцированное повреждение легких на фоне применения препарата легочного сурфактанта. Иммуногистохимическое исследование с антителами к эндотелиальной синтазе (e-NOS). Выраженная экспрессия e-NOS (+++) в интиме артерии, периваскулярной легочной ткани, участках склероза. х100

Введенный трехкратно интратрахеально препарат Сурфактант-БЛ уже через сутки после облучения был идентифицирован в просвете терминальных бронхиол и альвеол (рис. 8), однако его воздействие на легочную ткань стало ощутимо лишь спустя 7-14 суток после лучевого воздействия и проявлялось ослаблением распространенности повреждения, что приводило к достоверному (р < 0,001) увеличению объема функционирующей ткани легкого по сравнению с показателями нелеченных животных [5]. Еще более значительным было влияние препарата Сурфактанта-БЛ на капилляры аэрогематического барьера, что проявлялось отсутствием спазма последних, снижением частоты и выраженности повреждения эндотелиальных клеток (дистрофия, внутриклеточный отек, нарушение ультраструктуры) и относительной редкостью тромбоцитарно-эритроцитарных ассоциаций и тромбов (рис. 9). Уровень экспрессии маркеров эндотелиальной функции к 14 суткам после введения облученным животным сурфактанта-БЛ, минимальный или вовсе неидентифицируемый у нелеченных животных, как правило, был выше показателей контрольной группы.

Рис. 8 . Радиоиндуцированное повреждение легких на фоне применения препарата легочного сурфактанта, 1 сутки. Сурфактант (СТ) в просвете бронхиолы. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ), х14000

Рис. 9. Радиоиндуцированное повреждение легких на фоне применения препарата легочного сурфактанта, 14 сутки. Эндотелиальная клетка (ЭН) в состоянии повышенной функциональной активности. ЭР - эритроцит. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ), х14000

Меньшая выраженность внутриклеточного отека с нарушением тонкой организации эндотелиоцитов капилляров наряду с ослаблением альтераций в альвеолярном эпителии, обеспечивали лучшую сохранность структуры аэрогематического барьера у облученных животных, получавших Сурфактант-БЛ [5].

Обсуждение и заключение

Проведенное исследование, подтверждая в целом основные звенья морфогенеза лучевой патологии легких, дает основания предполагать существенное влияние на него, как оксидативного стресса, проявляющегося повышенным содержанием свободных радикалов, продуктов перекисного окисления липидов, так и эндотелиальной дисфункции, подтвержденных при помощи прецизионных иммуногистохимических методов и электронномикроскопически. Мы полагаем, что Сурфактант-БЛ, будучи нативным природным многокомпонентным препаратом легочного сурфактанта, выполняет in situ множественные функции, в том числе обеспечивает врожденный и приобретенный локальный иммунитет легочной ткани [6]. Он способен влиять на многие триггерные точки лучевой патологии легких. Фосфолипиды легочного сурфактанта корригируют ЭД, будучи эндотелиопротекторами. Раннее введение Сурфактанта-БЛ может играть роль в доставке антиоксидантов, функцию которых выполняют ненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов, способные «перехватывать» свободные радикалы, и соответственно, нивелировать оксидативный стресс, именно поэтому целесообразно вводить сурфактант не до, а после лучевого воздействия на фоне реализовавшегося оксидативного повреждения. Неоднократное введение Сурфактанта-БЛ преследует цель его использования как в качестве заместительной терапии, так и в виде субстрата для синтеза «собственного сурфактанта» de novo - наиболее полноценного, содержащего не только полный набор фософлипидов легочного сурфактанта, но и все четыре группы сурфактант-ассоциированных белков ЛС [6].

Таким образом, этот уже полностью нативный сурфактант, оказывает выраженное иммуномодулирующее воздействие на легочную ткань и все ее компоненты, включая альвеолоциты первого и второго типа и эндотелиоциты капилляров легкого, т.е. приводит к коррекции эндотелиальной дисфункции. Содержащиеся в сурфактанте-БЛ фосфолипиды используются также для синтеза арахидоновой кислоты, высвобождающейся под действием фосфолипазы А2 и фосфолипазы С. Свободная арахидоновая кислота быстро метаболизируется по двум альтернативным путям, превращаясь в высокоактивные соединения - простагландины, тромбоксаны и лейкотриены. Простагландины и лейкотриены активно участвуют в механизмах баланса и реализации провоспалительных и противовоспалительных воздействий на клеточные и молекулярные реакции воспаления.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Литература

1. Быхалов Л.С. Особенности экспрессии иммуногистохимического маркера CD34 в микроциркуляторном русле легких при ко-инфекции ВИЧ/туберкулез // Фундаментальные исследования. 2014. № 10-7. С. 1284-1287.

2. Воробьев Е.И., Степанов Р.П. Ионизирующие излучения и кровеносные сосуды. М.: Энергоатомиздат, 1985. С. 284.

3. Воронцова Е.В. Лечение лучевых повреждений легких с применением гипербарической оксигенации: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.00.19. Обнинск, 2001. 26 с.

4. Дубровская В.Ф., Кириллов Ю.А., Волчков В.А., Клестова О. В. и др. Модификация радиоиндуцированной патологии легких интратрахеальным введением фосфатидилхолин-холестериновых липосом // Пульмонология. 1998. № 2. С. 7478.

5. Кириллов Ю. А. Морфогенез экспериментального фиброзирующего альвеолита и современные технологии его коррекции: дис. ... докт. мед. наук. М., 2005. 245 с.

6. Розенберг О.А. Препараты легочного сурфактанта и сурфактант-терапия ОРДС в условиях хирургической реанимации (обзор литературы) // Креативная хирургия и онкология. 2019. № 9 (1). С. 50-65.

7. Чикина С.Ю., Ягмуров Б.Х., Копылев И.Д., Чучалин А.Г. и др. N - ацетилцистеин: малые и большие дозы при лечении хронических обструктивных болезней легких у ликвидаторов Чернобыльской аварии // Тер. архив. 2002. Т. 74, № 3. С. 62-65.

8. Abadi S.H. M.H., Shirazi A., Alizadeh A.M., Changizi V. et al. The Effect of Melatonin on Superoxide Dismutase and Glutathione Peroxidase Activity, and Malondialdehyde Levels in the Targeted and the Non-targeted Lung and Heart Tissues after Irradiation in Xenograft Mice Colon Cancer // Curr. Mol. Pharmacol. 2018. V. 11 (4). P. 326-335.

9. Carter C.L., Jones J.W., Farese A.M., MacVittie T.J. et al. Lipidomic dysregulation within the lung parenchyma following whole-thorax lung irradiation: Markers of injury, inflammation and fibrosis detected by MALDI-MSI // Sci. Rep. 2017. Vol. 7 (1). P. 10343.

10. Guzik T.J., Harrison D.G. Vascular NADPH oxidases as drug targets for novel antioxidant strategies // Drug. Discovery Today. 2006. Vol. 11-12. P. 524-526.

11. Hawkins P.G., Sun Y., Dess R.T., Jackson W.C. et al. Circulating microRNAs as biomarkers of radiation-induced cardiac toxicity in non-small-cell lung cancer // J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 2019. Vol. 145 (6). P. 1635-1643.

12. Higashi Y., Noma K., Yoshizumi M., Kihara Y. Endothelial function and oxidative stress in cardiovascular diseases // Circulation J. 2009. Vol. 3. P. 411-415.

13. Judge J.L., Lacy S.H., Ku W.Y., Owens K.M. et al. The Lactate Dehydrogenase Inhibitor Gossypol Inhibits Radiation-Induced Pulmonary // Fibrosis. Radiat. Res. 2017. Vol. 188 (1). P. 35-43.

14. Lertkiatmongkol P., Liao D., Mei H., Hu Y. et al. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31) // Curr. Opin. Hematol. 2016 Vol. 23 (3). P. 253-259.

15. Smith T.A., Kirkpatrick D.R., Smith S., Smith T.K. et al. Radioprotective agents to prevent cellular damage due to ionizing radiation // J. Transl. Med. 2017. Vol. 15 (1). P. 232.

16. Vaskovsky V.E., Kostetsky V.Y., Vasendin I.M. A universal reagent for phospholipid analysis // J. Chromatography. 1975. Vol. 114 (1). P. 129-141.

17. Yin Z., Yang G., Deng S., Wang Q. Oxidative stress levels and dynamic changes in mitochondrial gene expression in a radiationinduced lung injury model // J.J. Radiat. Res. 2019. Vol. 60 (2). P. 204-214.

Сведения об авторах

Кириллов Юрий Александрович, д. м. н., ведущий научный сотрудник лаборатории клинической морфологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека», г. Москва; профессор кафедры патологической анатомии и судебной медицины ФГБОУ ВО Тюменский ГМУ Минздрава России, г. Тюмень.

Чернов Игорь Алексеевич, к. м. н., доцент, заведующий кафедрой патологической анатомии и судебной медицины ФГБОУ ВО Тюменский ГМУ Минздрава России, г. Тюмень. Малышева Евгения Михайловна, заведующая патологоанатомическим отделением ГБУЗ «Городская клиническая больница №40 Департамента здравоохранения города Москвы», г. Москва.

Тимофеев Сергей Евгеньевич, врач патологоанатом ГБУЗ «Городская клиническая больница №40 Департамента здравоохранения города Москвы», г. Москва.

Жарков Николай Владимирович, к. б. н., биолог ГБУЗ «Городская клиническая больница № 40 Департамента здравоохранения города Москвы», г. Москва.

Сейлиев Андрей Алиевич, к. б. н., доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии ФГБУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий имени академика А.М. Гранова» Минздрава России, г. Санкт-Петербург.

Розенберг Олег Александрович, д. м. н., профессор, руководитель лаборатории медицинской биотехнологии ФГБУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий имени академика А.М. Гранова» Минздрава России, г. Санкт-Петербург.

Размещено на Allbest.ru