Ультраструктура и гистохимия желточных клеток, обеспечивающих развитие яиц возбудителя описторхоза

Гистохимические исследования проводили с помощью реакций: толуидиновый синий (при рН 4,2), бромфеноловый синий по Бонхегу, Кумасси бриллиантовый синий G-250. Реагент Брэдфорда, состоящий из красителя Кумасси G-250, метанола и фосфорной кислоты, традиционно используется для количественного определения белков [11, 12]. Использование этого реагента в анализе Брэдфорда основывается на связывании красителя Кумасси бриллиантовый синий G-250 с белками. Установлена способность красителя реагировать с небольшой группой аминокислот: аргинин, гистидин, лизин, фенилаланин, тирозин и триптофан [13]. Выявление белков в разных клетках паразита имеет большое значение для установления механизмов развития как репродуктивной системы, так и жизненного цикла паразита в целом [14].

Выполняли реакцию по Фёльгену на ДНК и ШИК-реакцию по Мак-Манусу. Применяли ферри-феррицианидный метод для выявления SH-групп по Шевремону и Фредерику. Результаты изучали в световом микроскопе. Определение липидного компонента проводили окрашиванием Суданом чёрным В.

Электронно-микроскопические исследования проводили со свежим материалом, который выдерживали 2 часа в глютаровом альдегиде на фосфатном буфере в соотношении 1:9 10 минут и оставляли в чистом фосфатном буфере на 5 минут, после чего фиксировали в 1% растворе тетраокиси осмия. Фиксатор готовили на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4). После дегидратации в серии спиртов восходящей концентрации кусочки заключили в аралгит. Срезы готовили на ультрамикротоме КВ-ОА. После контрастирования в 2% уранил-ацетате и цитрате свинца по Рейнольдсу срезы изучали в электронном микроскопе ЭМВ-100В.

Результаты и обсуждение. Желточники Ор^ИогсИ^ feHneus представлены фолликулами гроздьевидной формы, каждый из которых окружен тонкой мембраной, относительно отделяющей их от паренхимы. Взаимодействие желточников с клетками внутренней среды паразита происходит через мембрану за счёт её избирательной проницаемости, которая обеспечивается присутствием гиалуроновой кислоты в мембране желточных фолликул. Свидетельством наличия этой кислоты в мембране является её метахроматическое окрашивание при реакции с толуидиновым синим (при рН 4,2).

Цитоархитектоника желточников Ор^ИогсИ^ fehneus характеризуется тремя группами желточных клеток (вителлоцитов): недифференцированными клетками, имеющими плотное ядро и небольшой ободок цитоплазмы, располагающимися пристеночно, которые могут находиться на разных фазах деления митозом; базовыми (основными) или созревающими клетками, которые претерпевают период роста, на этой стадии в них начинается образование желточных или скорлуповых гранул; зрелыми клетками, цитоплазма которых заполнена большим количеством желточных гранул, эти клетки транспортируются в желточный проток. Желточные клетки находятся на разных стадиях развития (вителлогенеза) и соответственно имеют разные морфофункциональные особенности.

Гистохимические реакции показали, что наиболее интенсивное окрашивание ядер при реакции по Фёльгену на ДНК определялось в желточных клетках недифференцированного типа, и в наименьшей степени окрашивались ядра зрелых клеток.

Установлено, что желточные клетки в целом окрашиваются бромфеноловым синим в голубой цвет, а гранулы - в зеленовато-голубой. Разное окрашивание свидетельствует о том, что в цитоплазме клеток содержатся суммарные белки, а в гранулах - основные протеины. При проведении ферри-феррицианидной реакции было показано, что желточные гранулы описторхов представлены основными белками, имеющими в своём составе SS- и SН-группы. Это было описано нами ранее при исследовании разных видов трематод, включая описторхов [15]. Мы считаем, что положительное окрашивание желточных гранул в реакции на SH-группы указывает на содержание в гранулах веществ, способствующих кератизации. Подобные высказывания сделаны другими авторами, которые также изучали сульфгидрильные группы белков по методу Шевремона и Фредерика, но на других объектах [16]. Наибольшее количество сульфгидрильных групп определяли в роговом слое, и SH-группы были распространены в основном диффузно или в виде мелкозернистой массы.

При окраске с Кумасси бриллиантовым синим G-250 желточные гранулы клеток желточников описторхов окрашиваются в коричневый цвет, что указывает на присутствие в них некоторых аминокислот - аргинина, гистидина, лизина, фенилаланина, тирозина и триптофана.

Желточные гранулы в клетках проявляли положительную реакцию с Суданом чёрным-В, что указывает на присутствие в них липоидно- го компонента.

При ШИК-реакции ярко-малиновое окрашивание обнаруживали в цитоплазме клеток, в стенке фолликулов и ячейках прилежащей к ним паренхимы. Гликоген в виде темно-фуксиновых гранул выявлялся преимущественно вокруг желточников, но незначительное количество мелких зёрен встречалось в цитоплазме желточных клеток. Наличие гликогена указывает на возможность автономного обеспечения энергетическим ресурсом клеток на всех стадиях вителлогенеза.

Гистохимические методы эффективны тем, что можно их экстраполировать для исследования патологии тканей после лечения антигельминтиками, но для этого следует сначала определить тканевую гистохимическую реактивность как паразита, так и хозяина до применения препарата. Эти методы являются чувствительными и могут использоваться для диагностики как степени зрелости той или иной клетки, так и определения её нормы или патологии.

Электронно-микроскопические исследования желточных клеток были изучены другими авторами у разных видов дигенетических трематод и показано, что клетки находятся на разных стадиях развития и это можно определить по содержанию в них желточных глобул, которые, как и некоторое количество липидных капель, являются основными включениями, возникающими в результате вителлоцитарной синтетической активности [17, 18]. Некоторые авторы выделяют четыре или пять стадий вителлогенеза трематод, включая в этот процесс не только стадии развития самих желточных клеток, но и особенности ультраструктуры паренхимы, окружающей вителлоциты в желточниках [19, 20].

Проведенные нами исследования ультраструктуры желточных клеток Ор^ИогсИ^ \е- Ипеш подтвердили наши же данные световой микроскопии о наличии в желточных фолликулах клеток, находящихся на разных стадиях вителлогенеза. По своей цитоархитектонике и ультраструктуре вителлоциты находятся на трёх стадиях развития. Поэтому мы будем описывать три группы этих клеток: незрелые (малодифференцированные), созревающие (основные) и зрелые вителлоциты.

Рисунок 1.

Желточные клетки Opisthorchis felineus. НЖК - незрелые желточные клетки с тёмным ядром, жГ - желточные гранулы зрелой желточной клетки, Фс - фагосо- ма. Электронограм- ма. Ув. 18000. Окраска уранил-ацетат, цитрат свинца

Figure 1.

Vitellocytes of Opisthorchis felineus. Im- VC- immature vitelline cells with dark nucleus, vG - vitelline granules within the mature vitellocyte, Phs - phagosome. Uranyl acetate staining with lead citrate counter- staining, x18000 magnification

Рисунок 2.

Желточные клетки Opisthorchis felineus разной степени зрелости. бЖК - базовые, основные или созревающие желточные клетки, ЯМЖ

- ядро желточной клетки, ЭПС - эндоплазматическая сеть, жГ -желточные глобулы разной величины в увеличенных цистернах ЭПС. Гз - гликогеновые зерна в паренхиме окружающей желточные клетки. Электроно- грамма. Ув. 18000. Окраска уранил-аце- тат, цитрат свинца

Figure 2.

Vitellocytes of Opisthorchis felineus at different stages. bVC

- basic or immature vitellocytes, nVC-nu- cleus, EPS - endoplasmic reticulum, vG

- vitelline granules in the EPS. G - glycogen in parenchymal cells surrounding the yolk. Uranyl acetate staining with lead citrate counterstaining, x18000 magnification

Каждая желточная клетка окружена мембраной, которая инвагинирует внутрь цитоплазмы, образуя эндоплазматическую сеть (ЭПС) гранулярного типа. Ядро представлено конденсированным и диффузным хроматином и отчётливо контурируемой двойной ядерной мембраной - наружной и внутренней, или собственно ядерной. Между ними образуется перинукле- арное пространство. Наружная мембрана выпячивается в цитоплазму, и между ней и цитоплазмой определяется незначительная вакуолизация (рисунок 1). Отмечено, что по мере развития вителлоцитов наружная ядерная мембрана взаимосвязана с ЭПС, и взаимоотношения между клеточной мембраной и ядерной мембраной происходят через ЭПС, функционируя как система. Желточная клетка имеет овальную форму, а ядро, как правило, круглую, и клетки обладают выраженным ядерно-цитоплазматическим соотношением, которое меняется по мере их созревания. У незрелых желточных клеток объём цитоплазмы превышает объём ядра в два раза. При дальнейшем развитии желточных клеток мы наблюдали синхронное изменение их объёмов. Но уже в зрелой клетке, заполненной большим количеством желточного материала, определялось преобладание объема цитоплазмы.

Малодифференцированные или незрелые вителлоциты, находящиеся на начальной стадии вителлогенеза, имеют темное ядро, содержат много рибосом, митохондрий и каналов эндоплазматической сети (ЭПС).

Изредка встречаются фагосомы (рисунок 2). Комплекс Гольджи на электронограммах нам обнаружить не удалось.

В созревающих вителлоцитах наблюдали мелкую вакуолизацию в ядре, разрыхление хроматина, в цитоплазме определялось расширение каналов ЭПС, вакуолизация, скопление округлых гранул небольшой величины. Секреция гранул связана с гранулярной ЭПС.

За счёт секреции специальных белково-липидных веществ происходит образование и скопление желточных гранул, что ведёт к расширению каналов ЭПС, которые напоминают в этих местах цистерны. Желточный материал в виде гранул скапливается именно в цистернах ЭПС. Вителлогранулы тёмные, электронноплотные, образуют в цистернах ЭПС отдельные группы, обособленные мембраной. Большие по объёму скопления желточных гранул в группы следует именовать как кластеры (рисунок 2,3), а каналы ЭПС в этой части - "цистерны". Цитоплазма желточных клеток за счёт большого количества желточных гранул увеличивается. Гранулярная поверхность ЭПС содержит рибосомы, которые обеспечивают синтез протеинов, образующих желточные гранулы. Белковая природа гранул подтверждена нами гистохимическими исследованиями на белки.

Между созревающими и зрелыми клетками в паренхиме желточных фолликул встречаются зерна гликогена (рисунок 3).

Рисунок 3.

Желточные клетки Opisthorchis feline- us. ЗЖК - зрелая желточная клетка с ядром. жГ - желточные глобулы разной величины, ЯМ - ядерная мембрана. Электронограмма.

Ув. 18000. Окраска уранил-ацетат, цитрат свинца

Figure 3.

Vitellocytes Opisthorchis felineus. mVC - mature vitellocytes with a nucleus (I). G - vitelline granules, EPS - endoplasmic reticulum, nM - nuclear membrane. Uranyl acetate staining with lead citrate counter- staining, x18000 magnification

Следующая стадия вителлогенеза характеризуется наличием зрелых желточных клеток (рисунок 3). В этих желточных кластерах, находящихся в цистернах ЭПС, обнаруживается много желточных гранул, и они имеют разные размеры, форму, и структуру.

По размерам гранулы можно разделить на мелкие, средние и крупные, но все они будут иметь круглую форму. Здесь же располагаются ещё гранулы-глобулы, которые имеют очень крупную, неправильную форму и напоминают конгломераты, в которых просматриваются мелкие гранулы, часто склеенные между собой. Глобулы, смешиваясь с липидными веществами, образуют белково-липидный комплекс и приобретают пластичность. Такие глобулы обычно светлые и напоминают по структуре и форме крупные разреженные конгломераты. Этот материал поступает в желточный проток, затем в оотип и начальные отделы матки. Сюда же из тельца Мелиса выбрасывается секрет, который является пластификатором желточных конгломератов, обеспечивая их преобразование, что необходимо для создания защитной скорлуповой оболочки и формирования яиц описторхов в целом.

Ультраструктурные особенности желточных клеток показывают изменения их цитоархитектоники в процессе вителлогенеза, одним из заключительных фаз которого может быть распад желточных клеток. Встречаются клетки, которые можно обозначить как "перезревшие". Они характеризуются распадом ЭПС на отдельные фрагменты, которые представлены максимально расширенными каналами, содержащими кластеры с крупными желточными конгломератами. Мембрана этих клеток не определяется, она лизирована. В этих полуразрушенных клетках нет разнообразия желточных гранул, в основном видны большие слившиеся глобулы или конгломераты.

Заключение