Коррекция биологических свойств бифидобактерий, выделенных от ВИЧ-инфицированных детей

Размещено на http://www.allbest.ru/

Коррекция биологических свойств бифидобактерий, выделенных от ВИЧ-инфицированных детей

Захарова Ю.В., Леванова Л.А., Сухих А.С.; ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Резюме

Цель. Изучение in vitro влияния веществ с антиоксидантными и мембранопротекторными свойствами, а также лизоцима на биологические свойства бифидофлоры от ВИЧ-положительных пациентов.

Материалы и методы. Исследовали гидрофобность, аутоаггрегацию, специфическую адгезию у 15 штаммов бифидобактерий от ВИЧ-инфицированных детей после воздействия этилметилгидроксипиридина сукцината и лизоцима. Гидрофобность изучали по Rosenberg et al. (1980) с модификациями L-Q Wang et al. (2010); аутоаггрегацию - по Del Re et al. (2000); специфическую адгезию - по Брилису (1986). Содержание жирных кислот в клеточных стенках определяли с помощью газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Достоверность различий определяли с помощью непараметрических критериев оценки достоверности. Различия считали значимыми при p<0,05.

Результаты. При добавлении этилметилгидроксипиридина сукцината в питательную среду к культурам, имеющим низкую антиоксидантную активность, происходит увеличение в 10 раз количественного уровня бифидобактерий по сравнению с контролем. Также этилметилгидроксипиридина сукцинат увеличивает в 2 раза гидрофобность клеточной поверхности за счет стимуляции синтеза ненасыщенных жирных кислот. Увеличивается в 4 раза способность штаммов к аутоаггрегации, но снижается специфическая адгезия. Нивелировать данный эффект позволяет совместное использование этилметилгидроксипиридина сукцината и лизоцима. Использование лизоцима позволяет повысить специфическую адгезию штаммов не более чем на 9,1%.

Заключение. Использование этилметилгидроксипиридина сукцината позволяет модулировать поверхностные свойства бифидобактерий, что влияет на показатели неспецифической адгезии и на скорость размножения популяции. Таким образом, научно обосновано включение в схемы коррекции кишечной микрофлоры у ВИЧ-инфицированных пациентов антиоксидантов, мембранопротекторов и лизоцима.

Ключевые слова: ВИЧ-инфекция, бифидобактерии, антиоксиданты, лизоцим, гидрофобность, аутоаггрегация.

Abstract

Correction of biological properties of bifidobacteria isolated from HIV-infected children

Yulia V. Zakharova, Lyudmila F. Levanova, Andrey S. Sukhikh; Kemerovo State Medical University

Aim. To investigate the influence of ethylmeth- ylhydroxypyridine succinate and lysozyme on in vitro biological properties of bifidoflora isolated from HIV-positive patients.

Materials and Methods. We investigated hydrophobicity, autoaggregation, and specific adhesion of 15 bifidobacteria strains from HIV-infected children after exposure to ethylmethylhydroxypyr- idine succinate, lysozyme, or both combined. Hy- drophobicity was studied according to the Rosenberg method (1980) modified by Wang (2010); autoaggregation was documented as by Del Re (2000); specific adhesion was measured in accordance with Brilis (1986). The content of fatty acids in cell walls was determined using gas chromatography-mass spectrometry.

Results. Addition of ethylmethylhydroxypyridine succinate to the cultures with low antioxidant activity led to the 10-fold increase in the number of Bifidobacteria, 4-fold increase in autoaggregation, and 2-fold increase in hydrophobicity by stimulating the synthesis of unsaturated fatty acids, as compared to the control culture. Combination of ethylmethylhydroxypyridine succinate with lysozyme elevated specific adhesion of Bifidobacteria up to 9.1%.

Conclusions. The use of ethylmethylhydroxypyridine succinate allows to control surface properties of Bifidobacteria affecting their growth and non-specific adhesion. This may indicate usefulness of ethylmethylhydroxypyridine succinate and lysozyme for the correction of gut microbiota in HIV-infected patients.

Keywords: HIV-infection, Bifidobacteria, antioxidants, lysozyme, hydrophobicity, autoaggregation.

Введение

Нарушения кишечного микробиоценоза при ВИЧ-инфекции регистрируют на всех стадиях заболевания [1, 2]. Изменениям архитектоники кишечной микрофлоры способствуют репликация вируса в эпителиоцитах, а также иммунные расстройства [3]. Как было показано ранее, распространенность и характер микроэколо- гических нарушений кишечника у ВИЧ-инфицированных детей не отличаются от аналогичных показателей у детей без ВИЧ-статуса [4]. Наблюдается снижение количества бифидобактерий, лактобацилл, происходит увеличение содержания условно-патогенных микросимбионтов, которые нередко являются причиной оппортунистических инфекций у ВИЧ-инфицированных пациентов.

При этом установлено, что изменяются биологические свойства бифидофлоры, которая играет ключевое значение в поддержании ми- кроэкологического равновесия в сложном микробном сообществе кишечника. У популяции бифидобактерий от ВИЧ-инфицированных детей снижается антиоксидантная активность, ги- дрофобность клеточной поверхности, страдает специфическая адгезия [5]. Изменения жирнокислотного состава клеточных стенок, которые формируются под воздействием липаз условно-патогенной микрофлоры, сказываются на скорости размножения и ростовых свойствах бифидофлоры. В связи с этим у ВИЧ-инфицированных детей наблюдается снижение количественного уровня бифидобактерий и устраняется доминирующий и регулирующий компонент их воздействия на весь кишечный микробиоценоз.

Таким образом, восстановление только количественного уровня бифидобактерий при коррекции кишечного микробиоценоза у ВИЧ-инфицированных пациентов будет недостаточным для стабилизации кишечного микробиоценоза. Необходимо корректировать и биологические свойства бактерий. Первоочередными точками приложения внешнего модулирующего воздействия на бифидобактерии при ВИЧ-инфекции являются антиоксидантная система и поверхностные свойства бактериальной клетки.

Цель исследования: изучение in vitro влияния веществ с антиоксидантными и мембранопротекторными свойствами, а также лизоцима на биологические свойства бифидофлоры от ВИЧ-положительных пациентов.

Материалы и методы

Оценивали влияние этилметилгидроксипиридина сукцината и лизоцима на биологические свойства 15 штаммов бифидобактерий (по 5 штаммов B.breve, B.bifidum, B.longum), выделенных от ВИЧ-инфицированных детей. Изоляцию бифидобактерий проводили стандартным бактериологическим методом с использованием анаэробной технологии и селективных питательных сред. Верификация на родовом уровне включала определение наличия специфического фермента бифидобактерий фруктозо-6-фосфат фосфокетолазы (Ф-6-ФФК). Для этого микроорганизмы, выращенные на MRS Broth (Hi-Media, Индия) промывали дважды 50 мМ фосфатным буфером (рН 6,5). Клетки разрушали ультразвуком на холоду и добавляли по 0,25 мл раствора фторида натрия, Na йодацетата и фруктозо-6-фосфата (НС соли: 70% чистоты).

Реакцию останавливали добавлением 1,5 мл гидроксиламина солянокислого, 1 мл смеси трихлоруксусной кислоты и 4 М HCl. Далее добавляли 1 мл цвет-индикаторного агента (раствор FeCl₃6H₂O 5% (м/о)). Пробирка без фруктозо-6-фосфата служила в качестве контроля для упрощения визуального сравнения. При образовании из фруктозо-6-фосфата ацетил-фосфата формировался гидроксамат хелат железа с красновато-фиолетовой окраской, что является показателем наличия Ф-6-ФФК. Идентификацию бифидобактерий до вида проводили по биохимическим свойствам с помощью коммерческой тест-системы АНАЭРО-test 23 (Lachema diagnostica s.r.o., Чехия).

Специфическую адгезию штаммов изучали по В.И. Брилису (1986) на модели эритроцитов I (0) группы. Вычисляли индекс адгезии микроорганизмов (ИАМ), при этом адгезию считали низкой при ИАМ=1,76-2,5 ед; средней - при ИАМ=2,51-4,0 ед; высокой - при ИАМ >4,0 ед. Гидрофобность определяли по Rosenberg et al. (1980) c модификациями L-Q Wang et al. (2010) как процент гидрофобности (Н%). Штаммы считали высокогидрофобными при Н = 60% и > среднегидрофобными - при Н = 4059%, низкогидрофобными - при Н< 39%. Изучение аутоаггрегации (А%) бифидобактерий проводили по Del Re et al. (2000). Культуры относили к низкоаггрегативным при А (%) < 10, к среднеаггрегативным - при А (%) 10-40, к высокоаггрегативным - при А (%) > 40. Определение антиоксидантных свойств бифидобактерий проводили согласно [6]. Антиоксидантную активность выражали в единицах антиоксидантной активности - Е. Жирнокислотный состав бактериальных фосфолипидов определяли с помощью газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) как было описано ранее [7].

В качестве инструментов для коррекции поверхностных и антиоксидантных свойств бифидобактерий использовали 2% раствор этилметилгидроксипиридина сукцината - торговое название «Мексидол». Фармакологическая группа: антиоксидант. Производитель: «Фармасофт» НПК ООО, Россия. Также использовали лизоцим, который является действующим веществом препарата «Лизобакт». Фармакологическая группа: антисептик комбинированного состава. Производитель: «Босналек» АО, Босния и Герцеговина.

Данные представлены в виде абсолютных величин. В связи с тем, что распределение данных было не по нормальному закону, для статистической обработки применяли непараметрические критерии оценки статистической значимости. Распределения количественных признаков для парных данных описывали с помощью медианы (Ме) и интерквартильной широты. Данные представлены в виде Ме (LQ; UQ). Сравнение проводили с помощью критерия знаков Уилкоксона. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05.

Результаты

В процессе жизнедеятельности в биологических системах разного уровня сложности могут образовываться свободные радикалы, которые обладают высокой реакционной способностью. Активные кислородные метаболиты используются представителями нормальной микрофлоры как средства конкурентной борьбы в микробиоценозах, кроме того, их синтезируют клетки иммунной системы. Независимо от происхождения свободные радикалы повреждают белки, нуклеиновые кислоты и липиды, входящие в состав клеток микроорганизмов и организма человека.

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что дисбактериоз кишечника, независимо от его природы, сопровождается увеличением содержания в кишечнике токсических форм кислорода [8], в том числе и у ВИЧ-инфицированных пациентов. Бифидобактерии по типу дыхания являются анаэробными бактериями, некоторые виды и штаммы аэротолерантны. У них функционируют ферментные антиоксидантные системы - НАДН-оксидаза, НАДН-пероксидаза, а некоторые виды бифидофлоры продуцируют каталазу. Кроме того, антиоксидантные свойства данных бактерий связывают с жирнокислотным составом клеточной стенки. Однако не всегда антиоксидантные системы бифидобактерий «выдерживают» высокую концентрацию токсических форм кислорода, поэтому снижается популяционный уровень данных микросимбионтов.

Установлено, что внесение этилметилгидроксипиридина сукцината в питательную среду не влияет на количественный уровень B.bifidum и B.longum, так как содержание бифидобактерий до и после внесения антиоксиданта не изменилось и составило 5 и 6 КОЕ/мл соответственно. При этом количественный уровень B.breve увеличивается в 10 раз по сравнению с контролем, т.е. с 5 до 6 КОЕ/мл. Дело в том, что у штаммов B.breve антиоксидантная активность составила 0,3 (0,1; 0,5) Е_аоа. У B.bifidum и В.1опдит данные показатели были в 2-3 раза выше и составили 0,7 (0,2; 1,0) Е_аоа и 1,1 (0,6; 1,4) Е_аоа соответственно. Введение в питательную среду этилметилгидроксипиридина сукцината значительно снижает воздействие токсических форм кислорода на бифидобактерии со слабыми антиоксидантными свойствами и создает оптимальные условия для размножения их популяции.

Добавление в питательную среду этилметилгидроксипиридина сукцината изменяет также поверхностные свойства бактериальных клеток, так как препарат обладает мембранопротекторным действием. Так, установлено, что под влиянием препарата у B.bifidum в 1,8 раза, а у B.breve более чем 2 раза увеличивается гидрофобность клеточной поверхности (таблица 1).

Таблица 1. Влияние этилметилгидроксипиридина сукцината на биологические свойства и содержание жирных кислот у бифидобактерий. Me (Щ; UQ)

При этом у изначально высокогидрофобных штаммов В.1опдит показатели текучести мембраны практически не изменяются.

Увеличение гидрофобности бактериальной поверхности у B.breve сопровождается ростом в 4 раза аутоаггрегации штаммов. Опять же введение препарата не изменяет аутоаггрегации у В.1опдит и B.bifidum, которые характеризовались изначально высокими показателями признака, т.е. можно говорить об избирательности действия этилметилгидроксипиридина сукцината, которая определяется начальными свойствами штаммов. В основе изменения поверхностных свойств бифидобактерий лежит увеличение массы жирных кислот в клеточной стенке за счет роста массы ненасыщенных жирных кислот (таблица 1). Если учесть, что ненасыщенные жирные кислоты проявляют антиоксидантные свойства, то применение этил- метилгидроксипиридина сукцината приведет к модуляции не только кристаллического состояния бактериальной мембраны, но и антиоксидантных возможностей бактерий.

Однако установлено, что этилметилгидроксипиридина сукцинат статистически значимо снижает специфическую адгезию испытуемых штаммов (таблица 1). Показатели ИАМ у B.breve позволили изначально охарактеризовать их как среднеадгезивные культуры, B.longum были высокоадгезивными, а B.bifidum - низкоадгезивными. После добавления в питательную среду этилметилгидроксипиридина сукцината происходит снижение способности к специфической адгезии у всех штаммов. При этом изменяется категория микроорганизмов по ИАМ, и бактерии становятся низко- или неадгезивными. Так как этилметилгидроксипири- дина сукцинат снижает способность бифидобактерий к специфической адгезии, это предопределяет поиск средств, нивелирующих этот эффект.

Согласно литературным данным, лизоцим повышает адгезивные свойства бифидобактерий и обладает антибактериальной активностью в отношении условно патогенной микрофлоры. В связи с этим были проведены опыты по оценке влияния лизоцима на адгезивные свойства бифидобактерий. Установлено, что при использовании лизоцима специфическая адгезия штаммов увеличивалась не более, чем на 8,3% - 9,1%, но разница была статистически не значима (р>0,05) (таблица 2).

При совместном использовании этилметилгидроксипири- дина сукцината и лизоцима специфическая адгезия бифидобактерий снижалась, но это изменение признака не достигало статистической значимости (р>0,05), т.е. адгезивная активность бифидофлоры сохранялась практически на исходном уровне.

Таблица 2. Влияние этилметилгидроксипиридина сукцината (ЭМГПС) и лизоцима на индекс адгезии бифидобактерий. Me (LQ; UQ)

Обсуждение

Коррекция биологических свойств кишечных микросимбионтов является одним из новых направлений в системе коррекции микроэкологических нарушений [9]. Нормализация состояния кишечного микробиоценоза у ВИЧ-инфицированных пациентов является жизненно необходимым мероприятием, так как кишечные микросимбионты нередко становятся возбудителями оппортунистических бактериальных инфекций кожи и органов дыхания [10, 11]. Достижения последних лет по исследованию механизмов функционирования кишечного микробиоценоза показывают доминирующую и регулирующую роль бифидобактерий [12, 13], которые широко используются для управления ассоциативной микрофлорой кишечника. Ранее показано, что у ВИЧ-инфицированных детей отмечается не только снижение популяционного уровня бифидофлоры, но и изменение поверхностных и антиоксидантных свойств клеток при их взаимодействии с условно-патогенными микроорганизмами [5, 7]. В связи с этим определены группы веществ для коррекции биологических свойств бифидобактерий - это антиоксиданты и мембранопротекторы. Эти свойства одновременно сочетает в себе этилметилгидроксипиридин сукцинат.

При добавлении данного антиоксиданта в питательную среду с культурами бифидобактерий, имеющими низкую активность противо-кислородной защиты происходит инактивация токсических форм кислорода, что обеспечивает оптимальные условия для роста и размножения бифидобактерий и они достигают более высокого количественного уровня, чем в среде без антиоксиданта. Кроме того, этилметилгидроксипиридина сукцинат модулирует поверхностные свойства бифидобактерий, что обусловлено наличием у него защитного действия на липиды клеточных мембран и возможности влиять на вязкость мембранных структур.

У испытуемых штаммов бифидобактерий в клеточной стенке увеличивается общее содержание и масса ненасыщенных жирных кислот. Очевидно, что препарат стимулирует анаэробный путь синтеза ненасыщенных жирных кислот у бифидобактерий, что связано с активизацией специфических мембранных ферментов при пониженном парциальном давлении кислорода [7, 14]. В итоге увеличивается в 2 раза гидрофобность клеточной поверхности бифидофлоры, которая является показателем неспецифической адгезии бактерий. Кроме того, в 4 раза увеличивается аутоаггрегация и создаются благоприятные предпосылки для восстановления бактериальной биопленки на слизистой кишечника при ВИЧ-инфекции.

При всех благоприятных эффектах этилметилгидроксипиридина сукцинат все-таки оказывает побочное действие на бифидобактерии, он снижает специфическую адгезию штаммов. Это обусловлено его неконкурентным связыванием с поверхностными белковыми структурами бактериальной клетки.

По данным литературы, лизоцим оказывает бифидогенный эффект, который реализуется за счет стимуляции адгезии у бифидобактерий [15]. Добавление в питательную среду лизоцима действительно увеличивает специфическую адгезию штаммов, но не более чем на 10%. При этом механизм активации адгезивных факторов под влиянием лизоцима до сих пор не ясен. Установлено, что добавление лизоцима к этилметилгидроксипиридину сукцинату позволяет нивелировать эффект снижения лиганд-рецепторной адгезии бифидобактерий и сохранить ее на исходном уровне.

лизоцим бифидофлора гидрофобность вич

Заключение

Модуляция поверхностных свойств бифидобактерий при ВИЧ-инфекции позволяет восстановить популяционный уровень бифидобактерий и оптимизировать межбактериальные взаимодействия посредством изменения гидрофобности. В качестве инструментов для коррекции целесообразно использовать средства, обладающие антиоксидантными и мембраностабилизирующими свойствами. Так, использование этилметилгидроксипиридина сукцината у штаммов с низкими значениями гидрофобности и аутоаггрегации способствует снижению вязкости мембраны за счет стимуляции у бактерий синтеза ненасыщенных жирных кислот.

Антиоксидантные свойства этилметилгидроксипиридина сукцината также обеспечивают снижение токсического действия активных форм кислорода на клеточные стенки бифидобактерий. Оптимизация жидкокристаллического состояния клеточной стенки у бифидобактерий и содержания активных радикалов в окружающей среде сопровождается увеличением размножения последних и повышением их количественного уровня.

Литература

1. Burgener A., McGowan I., Klatt N.R. HIV and mucosal barrier interactions: consequences for transmission and pathogenesis. Curr Opin Immunol. 2015; 36: 22-30.

2. Dubourg G., Surenaud M., Lйvy Y., Hьe S., Raoult D. Microbiome of HIV-infected people. Microb Pathog. 2017; 106: 85-93..

3. Goedert J.J. Effects of HIV, immune deficiency, and confounding on the distal gut microbiota. EBioMedcine. 2016; 5: 14-15.

4. Захарова Ю.В., Леванова Л.А. Состояние микробиоценоза кишечника у ВИЧ-инфицированных детей // Медицина в Кузбассе. 2015. Т. 14, № 4. С. 29-33

5. Захарова Ю.В. Свойства бифидобактерий при ВИЧ-инфекции // Медицина в Кузбассе. 2013. Т. 12, № 3. С. 31-35

6. Способ количественного определения антиоксидантной активности микроорганизмов: патент 2465593 РФ: МПК G 01 N 33 483, C 12 Q 1 02, C 12 R 1 / Сухих А.С., Захарова Ю.В. № 2011127872/15; заявл. 06.07.2011; опубл. 27.10.2012, Бюл. № 30

7. Захарова Ю.В., Сухих А.С. Хроматографический анализ жирных кислот клеточных стенок бифидобактерий с различной гидрофобностью // Сорбционные и хроматографические процессы. 2015. Т. 15, № 6. С. 776-783

8. Гапон М.Н., Терновская Л.Н. Выявление степени микроэкологических нарушений кишечника на основе расчета локального антиоксидантного индекса // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016. № 2. С. 80-84

9. Лахтин М.В., Лахтин В.М., Алешкин В.А., Афанасьев С.С. Фундаментальные аспекты и прикладные принципы лектиновых систем на примере микробиоценозных симбиотических штаммов и консорциумов // Acta Biomedica Scientifica. 2017. Т. 2, № 2 (114). С. 80-84

10. Пузырева Л.В., Родькина Л.А., Мордык А.В., Конченко В.Д., Далабаева Л.М. Анализ инфекций нижних дыхательных путей с исследованием микробного пейзажа материала у ВИЧ-инфицированных пациентов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018. № 1. С. 76-84.

11. Тимербулатов В.М., Сибаев В.М., Тимербулатов Ш.В., Тимербулатов М.В., Валишин Д.А. Гнойно-септические осложнения ВИЧ-инфицированных больных // Медицинский вестник Башкортостана. 2017. Т. 12, № 6 (72). С. 15-21

12. Марков А.А., Тимохина Т.Х., Перунова Н.Б., Паромова Я.И. Регулирующее влияние экзометаболитов Bifidobacterium bifidum на пролиферативную активность условно-патогенных микроорганизмов // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. 2018. № 1 (17). С. 56-62

13. Салгина А.В., Рахматуллина О.И. Влияние ассоциаций бифидобактерий и пропионибактерий на биологические свойства E. Coli // Успехи современной науки и образования. 2016. Т.7, № 12. С. 213-217.

14. Титов В.Н., Лисицын Д.М. Жирные кислоты. Физическая химия, биология и медицина. М.: Триада, 2006. 670 с.

15. Ардатская М.Д. Пробиотики, пребиотики и метабиотики в коррекции микроэкологических нарушений кишечника // Медицинский совет. 2015. № 13. С. 94-99

Размещено на Allbest.ru