Значение генетического полиморфизма коллагена в развитии рахита

Размещено на http://www.allbest.ru/

Значение генетического полиморфизма коллагена в развитии рахита

И.Г. Каргина, В.А. Щербак

Читинская государственная медицинская академия, Чита 672000, Российская Федерация

Цель исследования. Выявить роль полиморфизмов генов коллагена (COL1A1) -1997 С>А и 1546 (6252) G>T [Spl S>s] в развитии рахита. Материал и методы. Проведено обследование 108 доношенных детей г. Читы в возрасте от 3 месяцев до 2 лет, из них 82 ребенка с рахитом и 26 здоровых в качестве контроля. Выделены 2 группы: дети с I группой здоровья, без признаков рахита и дети с клиническими признаками рахита, далее разделенные на 4 подгруппы. Исследование уровня С-концевого телопептида коллагена I типа (Beta-Cross Laps) сыворотки проводилось методом ИФА реагентами CEA892Hu 96 (США). Материалом для исследования генных мутаций были взяты образцы ДНК, выделенные из периферической венозной крови. Выбраны точки мутаций гена коллагена (COL1A1) -1997 С>А и 1546 (6252) G>T [Spl S>s] методом ПЦР в режиме реального времени. Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета программ Microsoft Excel 2010, Statistica 8,0 (StatSoft). Результаты. Уровень Beta-Cross Laps повышен во всех подгруппах, за исключением больных 1 степенью острого течения рахита.

Самый высокий уровень Beta-Cross Laps зарегистрирован при среднетяжелой степени рахита (1,12 [0,56; 1,60] пг/мл), что в 1,5 раза больше, чем у здоровых. У больных чаще регистрировались генотипы СС и СА и аллель С гена COL1A1: -1997 С>А. Генотип АА при остром течении выявлен в 10,5 % случаев, при подостром течении - у 9,1 % пациентов. Отклонение от равновесия Харди-Вайнберга установлено для полиморфизма COL1A1: -1997 С>А в группах детей при остром течении и при 1 степени тяжести. Гетерозиготная мутантная аллель (GT) и гомозиготная мутантная аллель (TT) зарегистрированы в 30,7 % и 2,6 % случаев острого течения заболевания.

Заключение. В развитии рахита полиморфизмы гена коллагена имеют различное значение. Гомозиготная мутантная аллель гена COL1A1: -1997 С>А выявлена при всех вариантах течения рахита и отсутствует у здоровых детей. Носительство минорной аллели А гена COL1A1: -1997 С>А повышает риск развития острого течения рахита в 5 раз, у этой группы больных уровень С-концевого телопептида увеличен по сравнению со здоровыми в 2 раза.

Ключевые слова: рахит, полиморфизм генов, коллаген, дети раннего возраста.

Importance of genetic collagen polymorphism in rachitis development

I. G. Kargina, V. A. Shcherbak

Chita State Medical Academy, Chita 672000, Russian Federation

The aim of the research is to reveal the role of collagen gene polymorphisms (COL1A1) -1997 C> A and 1546 (6252) G> T [Spl S> s] in rachitis development. Material and methods. During the study 108 full-term children from Chita city aged from 3 months to 2 years were examined, 82 of which had rachitis and 26 were healthy ones. 2 groups were distinguished: children with I health group, without any signs of rachitis and children with clinical signs of rachitis, further there were 4 groups subdivided. The study of C-terminal telopeptide of collagen type I (Beta-Cross Laps) serum level was carried out by ELISA reagents CEA892Hu 96 (USA). DNA samples isolated from peripheral venous blood were the material for gene mutations study. Mutation points of collagen gene (COL1A1) -1997 C> A and 1546 (6252) G> T [Spl S> s] were selected by real-time PCR. Statistical data processing was carried out using software package Microsoft Excel 2010, Statistica 8.0 (StatSoft).

Results. The level of Beta-Cross Laps is increased in all subgroups, with the exception of patients with 1-st stage of acute rachitis. The highest level of Beta-Cross Laps was determined in children with moderate rachitis (1.12 [0.56; 1.60] pg / ml), which is 1.5 times more than in healthy ones. CC and CA genotypes and C allele of COL1A1 gene: -1997 C> A were more often recorded in patients. Genotype AA in acute course was determined in 10.5 % of cases, in subacute course - in 9.1 % of patients. A deviation from Hardy - Weinberg equilibrium was found for COL1A1 polymorphism: -1997 C> A in groups of children with acute course and with 1-st severity stage. Heterozygous mutant allele (GT) and homozygous mutant allele (TT) were found in 30.7 % and 2.6 % of acute cases of the disease. Conclusion. Collagen gene polymorphisms have different values in rachitis development. Homozygous mutant allele of COL1A1 gene: -1997 C> A was determined in all types of rachitis course and is absent in healthy children. Carriage of minor allele A of COL1A1 gene: -1997 C> A increases the risk of acute rachitis by 5 times; in this group of patients, the level of C-terminal telopeptide is 2 times higher than in healthy patients.

Key words: rachitis, gene polymorphism, collagen, infants.

Проблема рахита является актуальной в связи с широкой распространенностью и не до конца изученными вопросами развития заболевания, диагностики и лечения. Рахит - нарушение минерализации растущей кости, вызванное временным несоответствием между потребностями растущего организма в фосфоре и кальции, и недостаточностью систем, обеспечивающих их доставку в организм ребенка [1]. Ранее Глобальным консенсусом по профилактике и лечению алиментарного рахита было принято определение, включающее в формулировку нарушение диффе- ренцировки хондроцитов, минерализации зон роста и остеоида у детей, вызванное дефицитом витамина D или недостаточным поступлением кальция [2].

При рахите активно происходит перестройка костной ткани, одним из маркеров данного процесса является повышение уровня в крови С-концевого телопептида коллагена I типа (Beta-Cross Laps). По нашему мнению, одной из основных целей медицины настоящего времени должно быть предупреждение развития заболеваний. Особенно это касается педиатрической практики, так как, все, что заложено в детстве, несет за собой последствия в старшем возрасте. Это привело к изучению молекулярной медицины и ее внедрению в широкую практику, созданию генетического паспорта человека для выявления предрасположенности к каким-либо заболеваниям. Сама предрасположенность без воздействия определенных неблагоприятных условий не несет угроз жизни и здоровью пациента, но при их появлении возникает развитие патологии. Определение генов предрасположенности можно назвать методом превентивной медицины. В настоящее время активно изучается полиморфизм ряда генов метаболизма костной ткани и остеопороза у человека [3, 4]. На первый план выходит ранняя диагностика заболевания, что позволяет врачам начать своевременное лечение. При рахите имеются публикации, посвященные полиморфизму гена рецепторов витамина D [5, 6, 7], однако не исследована роль аллельного полиморфизма коллагена при данной патологии, что и явилось обоснованием нашей работы.

Цель исследования: выявление роли полиморфизмов генов коллагена (COL1A1) -1997 С>А и 1546 (6252) G^ [Sp1 S>s] в развитии рахита.

Материал и методы

В исследовании приняли участие 108 доношенных детей г. Читы в возрасте от 3 месяцев до 2 лет, из них 82 больных и 26 здоровых в качестве контроля. Критериями включения являлись дети с клиническими признаками рахита легкой и среднетяжелой степени тяжести, без сопутствующей хронической патологии, из полных и социально-адаптированных семей.

Диагностика рахита была проведена с помощью объективных данных и биохимических показателей крови. Оценивалось состояние костной, мышечной, центральной и вегетативной нервной системы, физическое и нервно-психическое развитие. Диагноз рахит был выставлен на основании анамнестических данных, физикального осмотра, результатов биохимических исследований. Использована классификация по О. С. Дулицкому (1947) с изменениями на основании Национальной программы «Недостаточность витамина D у детей и подростков Российской Федерации: современные подходы к коррекции», 2018 г. [1].

Во всех случаях получено добровольное информированное согласие законных представителей пациентов. Исследование прошло экспертизу локального этического комитета при ФГБОУ ВО Читинской государственной медицинской академии от 06.11.2015 г, протокол № 74. Исследование уровня С-концевого телопептида коллагена I типа (Beta-Cross Laps) сыворотки проводилось методом ИФА реагентами CEA892Hu 96 (США). Материалом для исследования генных мутаций были взяты образцы ДНК, выделенные из периферической венозной крови. Выбраны точки мутаций гена коллагена (COL1A1) -1997 С>А и 1546 (6252) G^ [Sp1 S>s]. Доставка материала в лабораторию осуществлялась в течение 2-х часов. Выделение ДНК из лейкоцитов проводилось с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь» («ООО НПО ДНК-Техноло- гия», г. Москва). Регистрация и учёт результатов ПЦР проводились в режиме реального времени.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью программ Microsoft Excel 2010, Statistica 8,0 (StatSoft). Было проведено тестирование на нормальность рядов по Колмогорову-Смирнову, на основании чего, мы сделали вывод, что ряды не подчинялись критериям нормальности, поэтому далее нами были применены методы статистики для непараметрических данных. Сравнение двух несвязанных групп проводили критерием Манна-Уитни (U-тест).

Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди - Вайнберга и для сравнений распределений частот генотипов и аллелей в исследованных группах использовался точный двусторонний критерий Фишера. Вероятность развития событий вычислено методом оценки шансов OR с доверительным интервалом (CI) 95 % . Значение уровня р<0,05 считалось статистически значимым.

Результаты и обсуждение

Установлено, что концентрация Cross Laps повышена во всех подгруппах, за исключением первой (рис. 1). Самый высокий уровень Cross Laps зарегистрирован во 2 подгруппе (1,12 [0,56; 1,60] пг/мл), что в 1,5 раза больше, чем у здоровых.

Примечание: уровень значимости различий приведен в сравнении с группой контроля.

Note: * р<0,05 the significance level of the differences is given in comparison with the control group.

Рисунок 1.Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов COL1A1: -1997 С>А среди детей с рахитом в зависимости от течения заболевания.

Примечание: *р<0,05 уровень значимости различий приведен в сравнении с группой контроля.

При анализе полиморфизмов выявлено, что группы существенно отличались по генотипам (р=0,175) и аллелям (р=0,233) гена COL1A1: -1997 С>А. При этом, среди больных рахитом с острым течением по сравнению с группой контроля (рис. 2) чаще регистрировались генотипы СС и СА (OR= 2,059, 95 %, CI: 0,595-7,121, р=0,249) и аллель С (oR= 3,0, 95 %, CI: 0,894-10,064, р=0,068). Генотип АА выявлен в 10,5 % случаев. Среди больных с подострым течением рахита чаще проявлялись генотипы СС и СА (ОЯ=3, 25, 95 %, СІ: 0,947-11,150, р=0,280). Генотип АА определен в 9,1% при подостром течении (ОЯ=2,64, 95 %, СІ: 0,785-8,931, р=0,109).

Группы также существенно отличались по генотипам (р=0,818) и аллелям (р=0,677) другого гена коллагена СОЬ1Л1:1546 (6252) С>Т [Бр1 Б>8]. При остром течении рахита чаще регистрировались генотипы СС и СТ (ОЯ=1,52, 95%, СІ:0,09-25,44, р=0,77) и аллель С (ОЯ=0,71, 95 %, СІ:0,27-1,90, р=0,57) (рис. 3). Генотип ТТ был выявлен в 2,6 % случаев рахита с острым течением (ОЯ=0,66, 95 %, СІ:0,04-11,01, р=0,77).

Среди больных с подострым течением чаще также были выявлены аллель С (ОЯ=0,80, 95 %, СІ:0,30-2,13, р=0,66) и генотипы СО и ОТ (ОЯ=1,68, 95 %, С1:0,10- 28,06, р=0,72) в 97,8 % случаев (рис. 4). Генотип ТТ был определен у 2,2 % пациентов с подострым течением рахита (ОЯ=0,60, 95 %, С1:0,04-9,94, р=0,72), мутантная аллель Т зарегистрирована в 30,2 % случаев (ОЯ=1,25, 95 %, С1:0,47-3,33, р=0,66).

кость рахит организм

Рисунок 2. Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов COL1A1:1546 (6252) G>T [Sp1 S>s] среди детей с рахитом и группы контроля в зависимости от течения.

Рисунок 3. Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов COL1A1: -1997 С>А среди детей с рахитом и группы контроля в зависимости от степени тяжести.

Figure 3. Distribution of genotypes and frequency of allelic variants of COL1A1: -1997 С> А among children with rachitis and control groups depending on severity.

Рисунок 4. Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов COL1A1:1546 (6252) G>T [Sp1 S>s] среди детей с рахитом и группы контроля в зависимости от степени тяжести.

Figure 4. Distribution of genotypes and frequency of allelic variants of COL1A1:1546 (6252) G> T [Sp1 S> s] among children with rachitis and control groups depending on severity.

Примечание: *р<0,05 уровень значимости различий приведен в сравнении с группой контроля.

Анализ результатов исследования гена СОЬ1Л1:1546 (6252) С>Т [Бр1 Б>8] в зависимости от степени тяжести рахита (рис. 5) в группах показал, что дети с рахитом и здоровые незначительно различались между собой по частоте генотипов (р=0,867; у2=1,270 ), а также и аллелей (р=0,885). У больных чаще регистрировались гомозиготные нормальные генотипы (СС) в 73,7 % при легкой степени и 66,7 % при среднетяжелой степени. Генотип ТТ при легкой степени установлен в 2,6 % случаев (ОЯ=0,49, 95 %, С1: 0,03-8,23, р=0,61), а при среднетяжелом рахите в 2,3 % случаев (ОЯ=0,44, 95 %, С1: 0,03-7,42, р=0,56).

В ходе проведенного исследования, выявлено, что дети-носители аллели А и генотипа АА гена коллагена СОЬ1Л1: -1997 С>А среди пациентов с рахитом встречались достоверно чаще, по сравнению с детьми из группы контроля. Так, в сравнении с группой контроля, встречаемость минорной аллели А в 5 раз выше при остром течении (р <0,05), а при подостром - в 4 раза (р <0,05). Встречаемость минорной аллели А при легкой степени в 5 раз (р>0,05) чаще, при средне - тяжелой степени в 3 раза (р <0,05). Гомозиготный мутантный генотип (АА) в группе контроля не выделен.

Носители аллели Т гена коллагена СОЫЛ1:1546 (6252) С>Т [Бр1 Б>8] встречались во всех выделенных группах с рахитом и в контроле. Так, частота встречаемости аллели Т при легкой степени рахита в сравнении с группой контроля в 1,5 раза выше (р <0,05), а при средней степени в 2 раза (р <0,05). Мы выявили, что частота встречаемости аллели Т в 3 раза выше как при остром, так и подостром течении, но разница между признаками статистически не значима. Генотип ТТ встречается практически в равных долях во всех группах.

Отклонение от равновесия Харди-Вайнберга выявлено для полиморфизма СОЬ1Л1: -1997 С>А в группах детей при остром течении и 1 степени тяжести преимущественно за счет разницы наблюдаемой и ожидаемой гомозиготности по мутантной аллели (табл. 1).

Таблица 1. Частота генотипов полиморфизма ^L1A1 у детей с рахитом

Table 1. Frequency of polymorphism COL1A1 genotypes in children with rachitis