Окислительная модификация белков, проницаемость эритроцитарных мембран и активность гамма-глутамилтранспептидазы при различных интоксикациях

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГБОУ ВО Пермский ГМУ им. академика Е. А. Вагнера Минздрава России

Окислительная модификация белков, проницаемость эритроцитарных мембран и активность гамма- глутамилтранспептидазы при различных интоксикациях

Терехина Н.А., Терехин Г.А., Жидко Е.В., Горячева О.Г.

г. Пермь

Аннотация

Цель. Оценить влияние различных токсикантов на окислительную модификацию белков, проницаемость эритроцитарных мембран и активность фермента у-глутамилтранспептидазы. Материалы и методы. Исследовали эритроциты и плазму периферической крови лиц, работающих длительное время в условиях воздействия вредного производственного фактора химической этиологии (11 работников, контактирующих с аммиаком, 6 - контактирующих со смесью углеводородов), 25 больных с острой алкогольной интоксикацией, больных с патологией гепатобилиарной системы (23 - с механической желтухой опухолевого генеза, 21 - с механической желтухой неопухолевого генеза, 10 - с желчнокаменной болезнью без желтухи, 26 - с обострением хронического панкреатита), 48 лиц, имеющих длительное воздействие вредных физических факторов производственной среды (шум, слабое освещение, вибрация, низкая температура) и 24 здоровых людей. Спектрофотометрически в эритроцитах крови определяли содержание карбонильных производных белков, проницаемость эритроцитарных мембран, в плазме крови определяли активность у-глутамилтранспептидазы. Результаты. В гемолизате эритроцитов крови работников, контактирующих на производстве с углеводородами, лиц, имеющих длительное воздействие вредных физических факторов производственной среды, больных с острым отравлением этанолом, а также у половины исследуемых, контактирующих с аммиаком, повышается содержание карбонильных производных белков по сравнению со здоровыми людьми, что свидетельствует об усилении окислительной модификации белков. Проницаемость эритроцитарных мембран снижается в крови больных с механической желтухой опухолевого и неопухолевого генеза, работников, контактирующих с аммиаком, лиц, контактирующих со смесью углеводородов, больных с острой алкогольной интоксикацией, а также при обострении хронического панкреатита. Увеличение активности у-глутамилтранспептидазы в плазме крови больных с механической желтухой опухолевого и неопухолевого генеза, у людей, контактирующих с углеводородами, при обострении хронического панкреатита и при острой алкогольной интоксикации свидетельствует о том, что у-глутамилтранспептидаза является мишенью для действия различных токсикантов. Заключение. При различных интоксикациях в эритроцитах крови усиливается окислительная модификация белков, что приводит к снижению проницаемости эритроцитарных мембран. Фермент у-глутамилтранспептидаза является мишенью для действия различных токсикантов.

Ключевые слова: окислительная модификация белков, проницаемость эритроцитарных мембран, гамма-глутамилтранспептидаза, интоксикации.

Annotation

Terekhina N. A., Terekhin G. A., Zhidko E. V., Goryacheva O. G.

OXIDATIVE MODIFICATION OF PROTEINS, PERMEABILITY OF ERYTHROCYTE MEMBRANES AND ACTIVITY GAMMA-GLUTAMILTRANSPEPTIDASE IN VARIOUS INTOXICATIONS

Aim. To evaluate the effect of various toxicants on the oxidative modification of proteins, the permeability of erythrocyte membranes, and the activity of the enzyme y-glutamyltranspeptidase.

Materials and methods. The red blood cells and plasma of the peripheral blood of people who have been working for a long time under the influence of a harmful factor in the production of chemical etiology (11 workers in contact with ammonia, 6 in contact with a mixture of hydrocarbons), 25 patients with acute alcohol intoxication, patients with a pathology of the hepatobiliary system with signs of endotoxemia (23 - with obstructive jaundice of tumor etiology, 21 - with obstructive jaundice of non-tumor etiology, 10 - with gallstone disease without jaundice, 26 - with exacerbation of chronic pancreatitis it), 48 people with prolonged exposure to harmful physical factors of the working environment (noise, poor lighting, vibration, low temperature) and 24 healthy people. Spectrophotometrically was determined in blood erythrocytes the content of carbonyl derivatives of proteins, in blood plasma was determined the activity of y-glutamyltranspeptidase, and also was studied the permeability of erythrocyte membranes.

Results. In the blood erythrocyte hemolysate of workers in contact with hydrocarbons in the workplace, people with prolonged exposure to harmful physical factors of the working environment, patients with acute ethanol poisoning, and also in half of those examined when exposed to ammonia, the content of carbonyl derived of proteins increase compared to healthy people, which indicates an increase in the oxidative modification of proteins. The permeability of erythrocyte membranes decreases in the blood of patients with obstructive jaundice of tumor and non-tumor etiology, workers in contact with ammonia, people in contact with a mixture of hydrocarbons, patients with acute alcohol intoxication, and also with exacerbation of chronic pancreatitis. An increase in the activity of y-glutamyltranspeptidase in the blood plasma of patients with obstructive jaundice of tumor and non-tumor etiology, in people in contact with hydrocarbons, with exacerbation of chronic pancreatitis and with acute alcohol intoxication indicates that y-glutamyltranspeptidase is a target for the action of various toxicants. Conclusions. In various intoxications in red blood cells, the oxidative modification of proteins is enhanced, which leads to a decrease in the permeability of erythrocyte membranes. The enzyme y-glutamyltranspeptidase is a target for the action of various toxicants.

Keywords: oxidative modification of proteins, erythrocyte membrane permeability, y-glutamyltranspeptidase, intoxications.

Введение

При экстремальных состояниях и патологических процессах резкая интенсификация свободнорадикального окисления приводит к нарушению структуры и функции мембран. Под влиянием токсических веществ нарушения функций мембран часто являются не только результатом, но и причиной патологических изменений в клетке и организме в целом [14]. Реализация повреждающего действия мембранодестабилизирующих факторов происходит через универсальные механизмы - повышение активности фосфолипазного и перекисного окисления липидов клеточных мембран, а также ингибирование активности антиоксидантной системы защиты [6, 19]. Окислительную модификацию белков называют ранним маркером окислительного стресса [3, 12]. Высокая степень окислительной модификации белков отмечается при различных эндогенных интоксикациях: у больных псориазом и атопическим дерматитом [8], при сахарном диабете 2 типа независимо от степени компенсации [4], при ишемическом инсульте [22]. Показатели антиоксидантной защиты, свободнорадикального окисления, энергетического обмена, микросомального окисления являются чувствительными к действию ксенобиотиков [2, 18, 19]. В печени осуществляется обезвреживание различных токсических веществ как экзогенного, так и эндогенного происхождения. В возникновении и развитии функциональных и структурных нарушений органов гепатобилиарного тракта, особенно печени, важную роль играет активация процессов свободнорадикального окисления [9, 17, 28]. Белки-антиоксиданты и трипептид глутатион являются мишенью для действия ксенобиотиков [1, 14, 15, 16].

Цель исследования. Оценить влияние различных токсикантов на окислительную модификацию белков, проницаемость эритроцитарных мембран и активность фермента у-глутамилтранспептидазы.

Материалы и методы

Объектом исследования служили эритроциты и плазма периферической крови. Все исследуемые были разделены на пять групп. В первую группу были включены лица, работающие длительное время в условиях воздействия вредного производственного фактора химической этиологии (11 работников, контактирующих с аммиаком, 6 - контактирующих со смесью углеводородов). Вторую группу составили 25 больных с острой алкогольной интоксикацией. В третью группу были включены больные с патологией гепатобилиарной системы с признаками эндотоксикоза (23 пациента с механической желтухой опухолевого генеза, 21 больной с механической желтухой неопухолевого генеза, 10 пациентов с желчнокаменной болезнью без желтухи и 26 больных с обострением хронического панкреатита). В четвертую группу (группа сравнения) были включены 48 лиц, имеющих длительное воздействие вредных физических факторов производственной среды (шум, слабое освещение, вибрация, низкая температура). Пятую группу составили 24 здоровых людей. Спектрофотометрически определяли содержание карбонильных производных белков эритроцитов (кетон-динитрофенилгидразоны нейтрального характера) при длине волны 370 нм по методу [3]. Метод основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидрозином с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразонов. В гемолизате отмытых эритроцитов периферической крови изучали проницаемость эритроцитарных мембран по методу [7]. Принцип метода - гемолиз в смесях изотонических растворов мочевины и хлористого натрия, обусловленный способностью мочевины быстро диффундировать через клеточную мембрану и, создавая гиперосмолярную концентрацию внутри эритроцита, вызывать его набухание с последующим гемолизом. Активность гамма-глутамилтранспептидазы (у-ГТП) определяли в плазме крови по методу [27].

Результаты и обсуждение. В гемолизате эритроцитов крови работников, контактирующих на производстве с углеводородами, и лиц, имеющих длительное воздействие вредных физических факторов производственной среды, а также у больных с острым отравлением этанолом достоверно повышается содержание карбонильных производных белков по сравнению со здоровыми людьми (р < 0,05) (табл. 1).

При алкоголизме окислительная модификация белков и липидов эритроцитов приводит к изменению функциональных свойств биомолекул, жидкостности липидного бислоя и снижению способности мембранного каркаса клетки к обратимым деформациям [13]. Уровень карбонильных производных белков увеличивается у половины исследуемых, контактирующих на производстве с аммиаком, а при обострении хронического панкреатита этот показатель не изменяется.

Таблица 1 Содержание карбонильных производных белков в гемолизате эритроцитов крови людей при различных

Примечание: * - при р<0,05 достоверность различий по сравнению с контролем.

Увеличение содержания карбонильных производных в гемолизате эритроцитов крови свидетельствует об усилении окислительной модификации белков. На ранних стадиях окислительного стресса в результате воздействия свободных радикалов происходит фрагментация белков, сопровождающаяся образованием альдегиддинитрофенилгидразонов, позднее развивается агрегация белков с образованием кетон- динитрофенилгидразонов.

Состояние плазматической мембраны эритроцита адекватно отражает процессы в мембранах клеток различных тканей и органов [14, 20]. Усиление окислительной модификации белков приводит к изменению свойств мембраны эритроцитов. Гемолиз эритроцитов крови здоровых лиц наблюдался при концентрации мочевины равной 0,165 ммоль/л и выше (рис. 1).

Рис. 1 . Проницаемость эритроцитарных мембран крови людей с различными интоксикациями при разных концентрациях мочевины. По оси абсцисс концентрация мочевины в ммоль/л, по оси ординат гемолиз эритроцитов в процентах

Проницаемость эритроцитарных мембран у работников, контактирующих на производстве со смесью углеводородов, оказалась сниженной на 25% по сравнению с группой здоровых лиц. Воздействие на организм работающих на производстве с использованием хлорированных углеводородов характеризуется проникновением их в организм, в результате чего изменяются структурно-функциональные свойства клеточных мембран, в том числе эритроцитарных.

При низких концентрациях мочевины (до 0,15 ммоль/л) процент гемолиза эритроцитов у работников, контактирующих на производстве с углеводородами, и у лиц, имеющих длительное воздействие вредных физических факторов производственной среды, оказался выше, чем у здоровых людей. При концентрации мочевины 0,165 ммоль/л была гемолизирована только половина эритроцитов периферической крови работников, контактирующих на производстве с аммиаком. Аммиак - токсичное соединение, легко проникает через мембраны в клетки. Даже небольшое повышение его концентрации в крови оказывает неблагоприятное действие на организм, вызывает алкалоз, что, в свою очередь, ведёт к увеличению сродства гемоглобина к кислороду и к гипоксии тканей, накоплению углекислого газа и гипоэнергетическому состоянию.

В крови больных с механической желтухой как опухолевого, так и неопухолевого генеза при концентрации мочевины 0,165 ммоль/л наблюдался гемолиз только 30% эритроцитов, что свидетельствует о снижении проницаемости эритроцитарных мембран. При желчнокаменной болезни без механической желтухи проницаемость эритроцитарных мембран достоверно не отличалась от контроля. Проницаемость эритроцитарных мембран больных при острой алкогольной интоксикации снижена в 2 раза, при обострении хронического панкреатита на 20% по сравнению со здоровыми людьми. Ранее в эксперименте на крысах с острой алкогольной интоксикацией было установлено усиление окислительной модификации белков и снижение проницаемости эритроцитарных мембран [15].

Особое место в биотрансформации ряда ксенобиотиков в печени занимает глутатионовая конъюгация.

Уровень глутатиона, его оборот и редокс-статус зависят от активности ферментов и переносчиков, спектра сигнальных молекул и метаболитов [10]. Глутатион и ферменты его метаболизма (глутатионпероксидаза, глутатионтрансфераза, глутатионредуктаза) и НАДФН+ образуют глутатионовую антиоксидантную систему [21, 24, 25]. Микросомальные глутатионтрансферазы, катализируя процесс конъюгации цитотоксичных продуктов перекисного окисления липидов с глутатионом, уменьшают образование липидных гидроперекисей, защищают мембраны, предохраняют органоиды клеток от повреждения, увеличивая резистентность организма к физическим и химическим воздействиям, защищают организм от огромного количества ксенобиотиков [9, 26]. Повреждение клеток печени при различных интоксикациях, в том числе холестазе, сопровождается изменением проницаемости мембранного барьера для ферментов. Фермент холестаза у-глутамилтранспептидаза локализован на наружной поверхности плазматических мембран клеток. При взаимодействии у-ГТП, глутатиона и аминокислоты на наружной стороне клеточной мембраны образуется у-глутамиламинокислота, которая транспортируется в клетку, где конвертируется в соответствующую аминокислоту и 5-оксипролин, который затем преобразуется в глутамат и используется при синтезе глутатиона. В плазме крови больных механической желтухой активность фермента резко увеличивается (табл. 2). При этом в плазме крови больных с механической желтухой опухолевого генеза активность этого фермента была выше в 75 раз, а при механической желтухе неопухолевого генеза (холелитиаз) активность у-ГТП оказалась выше в 20 раз по сравнению со здоровыми людьми. Активность у-ГТП увеличивается более чем 4 раза в плазме крови людей, контактирующих на производстве с углеводородами и при обострении хронического панкреатита, а при острой алкогольной интоксикации почти в 6 раз по сравнению с группой здоровых лиц.

Таблица 2 Активность гамма-глутамилтранспептидазы в плазме крови людей при различных интоксикациях (М ± т)

Примечание: * - при р<0,05 достоверность различий по сравнению с контролем.

Повышение концентрации восстановленного глутатиона и активности у-ГТП при обострении хронического панкреатита связывают с повреждением клеток ткани поджелудочной железы и нарушением проницаемости сосудов [29]. окислительный белок эритроцит кровь

Установлено увеличение активности у-ГТП в плазме крови 50% лиц, контактирующих на производстве с аммиаком, и 75% работников, имеющих длительное воздействие вредных физических факторов производственной среды. Известно, что работа в условиях измененного светового режима сопровождается нарушением синтеза антиоксиданта мелатонина, что приводит к дисбалансу показателей системы антиоксидантной защиты и процессов перекисного окисления липидов [5]. Увеличение активности этого фермента в плазме крови при воздействии токсических веществ свидетельствует о том, что у-глутамилтранспептидаза является мишенью для действия различных токсикантов.

Выводы

При различных интоксикациях в эритроцитах крови усиливается окислительная модификация белков, что приводит к снижению проницаемости эритроцитарных мембран. Фермент у-глутамилтранспептидаза является мишенью для действия различных токсикантов.

Литература

1. Высокогорский В. Е., Ефременко Е. С., БыковД. Е. и др. Нарушение обмена глутатиона при алкоголизме // Омский научный вестник. 2011. № 1. С. 9-12.

2. Глушков С. И., Куценко С. А., Ливанов Г. А. Состояние глу- татионзависимой антирадикальной системы и процессов перекисного окисления липидов в различных тканях лабораторных животных при острых отравлениях тиопенталом натрия // Токсикологический вестник. 2002. № 1. С. 11-17.

3. Дубинина Е. Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты. СПб.: Издательство Медицинская пресса, 2006. С. 272-273.

4. Занозина О. В., ЩербатюкТ. Г., Боровков Н. Н. Окислительная модификация белков в плазме крови больных сахарным диабетом типа 2 в зависимости от степени компенсации углеводного обмена и длительности заболевания // Российский медико-биологический вестник им. Академика И. П. Павлова. 2010. №1. С. 113-118.

5. Кашуро В. А., Батоцыренова Е. Г., Иванов М. Б. Реакция антиоксидантной системы на изменение светового режима // II Объединенный научный форум. Научные труды V Съезда физиологов СНГ, VI Съезда биохимиков России, Конференции ADFLIM. ACTA NATURAE - Сочи-Дагомыс 2019. Т. 2. Спецвыпуск. С. 196.

6. КичероваО.А., РейхертЛ.И. Роль окислительного стресса в патогенезе неврологических заболеваний // Медицинская наука и образование Урала. 2019. № 2. С. 192-195.

7. Колмаков В. Н., Радченко В. Г. Значение определения проницаемости эритроцитарных мембран (ПЭМ) в диагностике хронических заболеваний печени // Терапевтический архив. 1982. Т. 54, №2. С. 59-62.

8. КопытоваТ. В., Пантелеева Г. А., Дмитриева О. Н. и др. Оценка окислительной модификации белков у больных хроническими распространенными дерматозами // Клиническая лабораторная диагностика. 2014. № 2. С. 41-44.

9. Кулинский В. И., Колесниченко Л. С. Система глутатиона I. Синтез, транспорт глутатионтрансферазы, глутатионперок- сидазы // Биомед. химия. 2009. Т. 55, Вып. 3. С. 255-277.

10. НадеевА.Д., Зинченко В. П., Авдонин П. В. и др. Токсические и сигнальные свойства активных форм кислорода // Токсикологический вестник. 2014. № 2 (125). С. 22-27.

11. Орбиданс А. Г., Терехин Г. А., Владимирский Е. В., Терехи- наН. А.Экспериментальное обоснование использования энтеросорбентов при остром отравлении этанолом // Пат. физ. экспер. тер. 2009. № 4. С. 29-30.

12. Перфильев П. Р., ВиноградовД. Б., Паначев И. В., Синиц- кий А. И. Особенности окислительного стресса и содержание кортизола в крови пациентов с абстинентным состоянием, осложненным развитием алкогольного делирия // Медицинская наука и образование Урала. 2014. Т. 15, № 4. С. 115-117.

13. Прокопьева В. Д., Патышева Е. В., Бохан Н. А. Влияние микроволновой резонансной терапии на структурно-функциональные характеристики эритроцитов больных алкоголизмом // Фундаментальные исследования. 2014. № 7. С. 554-557.

14. СавлуковА. И., Самсонов В. М., Камилов Р. Ф. и др. Состояние устойчивости эритроцитов как звено адаптации организма // Медицинский вестник Башкортостана. 2011. Т. 6, № 4. С. 1317.

15. Терехина Н. А., Жидко Е. В., ОрбидансА. Г., Терехин Г. А. Влияние сорбентов на показатели антиоксидантной защиты и свободнорадикального окисления при острой алкогольной интоксикации // Сибирское медицинское обозрение. 2017. № 6. С. 69-76.

16. Терехина Н. А., Жидко Е. В., Терехин Г. А., Горячева О. Г. Окислительная модификация белков и показатели антиоксидантной защиты при острой алкогольной интоксикации // Медицинский алфавит. 2017. Т. 4. Современная лаборатория, № 28. С. 26-27.

17. Терехина Н. А., Заривчацкий М. Ф., Владимиров А. А., Хлебников В. В. Показатели антиоксидантной защиты при остром и хроническом холецистите // Клиническая лабораторная диагностика. 2008. № 4. С. 41-43.

18. Терехина Н. А., Зитта Д. В., Субботин В. М. Активность аде- нозинтрифосфатазы эритроцитов периферической крови больных колоректальным раком // Клиническая лабораторная диагностика. № 5. С. 23-24.

19. Терехина Н. А., Зорин М. Г., Терехин Г. А. Влияние сапропелевых грязей на показатели окислительного стресса и антиоксидантной защиты при остром отравлении карбофосом // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. М., 2007. № 1. С. 6-8.

20. Терехина Н. А., Караваев В. Г. Активность антиоксидантных ферментов эритроцитов при герпетическом кератите // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. № 7. С. 38-40.

21. Толпыгина О. А. Роль глутатиона в системе антиоксидантной защиты (обзор) // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2012. № 2 (84). С. 178-180.

22. Хайбуллин Т. Н., Кравцова Е. Ю., Мартынова Г. А. Влияние этилметилгидроксипиридина сукцината на окислительную модификацию белков сыворотки крови у больных ишемическим инсультом // Рациональная Фармакотерапия в Кардиологии. 2012. Т. 8, № 3. С. 420-423.

23. Чеданова Ю. С. Влияние динитрозильных комплексов железа на механические свойства эритроцитов // Академический журнал Западной сибири. 2016. Т. 12, № 1. С. 109-110.

24. Dann A.T., Kenyon A. P., Seed P. T et al. Glutathione S-transferase and liver function in intrahepatic cholestasis of pregnancy and pruritus gravidarum // Hepatology. 2004. Vol. 40, № 6. Р. 14061414.

25. Forman H. J. Glutathione - From antioxidant to post-translational modifier // Arch Biochem Biophys. 2016. Vol. 595. Р. 64-67.

26. Hogg N.The biochemistry and physiology of S-nitrosothiols // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002. Vol. 42. P. 585-600.

27. Kulhanek V., Dimov D. M. Comparison of four methods for the estimation of gammaglutamyltranspeptidase activity in biological fluids // Clin. Chem. Acta. 1967. № 12. Р. 271-277.

28. Li S., Tan H.-Y., Wang N. et al. The Role of Oxidative Stress and Antioxidants in Liver Diseases // Int. J. Mol. Sci. 2015. Vol. 16, № 11. Р. 26087-26124.

29. Milnerowicz H., Bukowski R. B., Bonowska M.J. et al. The Antioxidant Profiles, Lysosomal and Membrane Enzymes Activity in Patients with Acute Pancreatitis // Mediators of Inflammation. 2014. Vol. 2014. 9 pp.

Сведения об авторах

Терехина Наталья Александровна, д. м. н., профессор, зав. кафедрой биохимии ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е. А. Вагнера» Минздрава России, г. Пермь.

Терехин Георгий Анатольевич, д. м. н., профессор, зав. кафедрой экстремальной медицины и товароведения ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России, г. Пермь.

Жидко Екатерина Викторовна, к. м. н., старший преподаватель кафедры биохимии ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е. А. Вагнера» Минздрава России, г. Пермь.

Горячева Ольга Георгиевна, к. м. н., доцент кафедры пропедевтики внутренних болезней № 2 ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е. А. Вагнера» Минздрава России, г. Пермь.

Размещено на Allbest.ru