Основные принципы микродиализа головного мозга и современные возможности его применения в экспериментальной нейробиологии и нейрохимии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Основные принципы микродиализа головного мозга и современные возможности его применения в экспериментальной нейробиологии и нейрохимии

Харитонова Е.В.,

Лопатина О.Л.,

Марченко С.А.,

Горина Я.В, Салмина А.Б.

ФГАОУ ВО "Сибирский федеральный университет", г. Красноярск, Россия

ФГБОУ ВО "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно- Ясенецкого" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Красноярск, Россия

Резюме

Благодаря своей универсальности микродиализ представляет собой популярный метод, используемый в различных областях, особенно в фармакологии, неврологии и биомедицинских исследованиях. Потенциальная и ценная роль этого метода заключается в использовании этой техники в качестве локального устройства для взятия проб и решения задач метаболомики, тем самым обнаружения молекул-маркеров и следов фармакотерапевтических вмешательств. В настоящее время микродиализ чаще используется в качестве метода сбора или распределения определенного вещества в определенном месте. Этот метод успешно применяется в различных исследованиях, где необходим отбор несвязанных эндогенных и экзогенных веществ из внеклеточной жидкости широкого спектра тканей организма, доставка лекарств в ткани-мишени и даже в качестве инструмента для мониторинга веществ в тканевой инженерии. Микродиализ является малоинвазивным средством обеспечения практически непрерывного измерения метаболизма любого органа или ткани, в том числе и головного мозга, который позволяет обнаружить признаки клеточного дистресса до системных проявлений. Церебральный микродиализ является безопасным методом мониторинга региональной биохимии мозга. Анализ биологической жидкости центральной нервной системы может помочь в принятии клинических решений, ориентировать фармакотерапию и помочь в прогнозировании результатов лечения пациентов. Межклеточные взаимодействия, влияния гормонов, цитокинов, нейромедиаторов, продукция внеклеточной жидкости (в том числе и ликвора), а также площадь и тип поверхности мембраны направляющей канюли, скорость подачи изотонической жидкости, которая регулируется шприцевым и плунжерным насосами, влияют на финальные концентрации целевых компонентов в диализате. Вышеперечисленные параметры тесно связаны между собой и при их несоблюдении в процессе анализа впоследствии могут быть выявлены неточности. В данной публикации рассматриваются основные аспекты и параметры, которые могут оказать влияние на процесс сбора аналита и его содержание, а также области применения микродиализа в нейробиологии и нейрохимии. микродиализ фармакология неврология

Ключевые слова: микродиализ, головной мозг, нейродегенеративные заболевания, нейробиология, нейрохимия

REVIEW ARTICLE BRAIN MICRODIALYSIS IN NEUROBIOLOGY AND NEUROCHEMISTRY

Ekaterina V. Kharitonova, Olga L. Lopatina, Sergey A. Marchenko1, Yana V. Gorina, Alla B. Salmina

Voino-Yasenetskiy Krasnoyarsk State Medical University, Krasnoyarsk, Russian Federation

Siberian Federal University, Krasnoyarsk, Russian Federation

Abstract

Microdialysis is a versatile and popular minimally invasive technique which enables sampling, collecting, and continuous measurement of small-molecular-weight substances in the extracellular fluid of virtually any tissue. Widely established in pharmacology and neuroscience, it permits evaluation of the metabolism in any organ including brain and allows early detection of the cell stress. Concentrations of the target analytes in the dialysate are determined by the type of the analysed tissue, paracrine interactions, and technical features such as membrane type and surface area or flow rate of isotonic fluid. Cerebral (or brain) microdialysis can be used in personalised pharmacotherapy and prognostication in patients with neurological disorders. Here we discuss recent advances in brain microdialysis and focus on critical parameters defining its efficiency.

Keywords: brain microdialysis, neuroscience, neurodegenerative diseases, neurobiology, neurochemistry.

Введение

Микродиализ - один из современных методов получения биологической жидкости (внеклеточная жидкость) из ткани в процессе функционирования организма с последующим анализом компонентного состава жидкости. Принципиальной основой метода является проникновение аналита путём простой диффузии в перфузируемую жидкость (перфузат, изотоническая жидкость) с формированием анализируемой смеси - диализата [1].

Впервые эта техника была разработана в конце 1950-х годов и использована для изучения концентрации нейротрансмиттеров в ткани головного мозга у крыс [2,3]. Позднее этот метод был переработан и усовершенствован для исследования эндогенных и экзогенных соединений во внеклеточной жидкости различных тканей. Метод микродиализа не ограничивается исследованиями in vivo, он также используется для отбора проб в исследованиях in vitro [4].

Особую актуальность приобрел этот метод исследования в экспериментальной нейробиологии, нейрохимии, а также клинической медицине, например, нейрохирургии. Помимо того, что этот метод популярен для оценки уровня нейротрансмиттеров и метаболитов, в том числе, например, бета-амилоида при хронической нейродегенерации [5], в экспериментальной нейрохимии этот метод пригоден для оценки субклеточного метаболома, например, продукции лактата и пирувата в реакциях гликолиза, а также генерации промежуточных метаболитов цикла трикарбоновых кислот, что совокупно отражает энергетическую функцию митохондрий и является чувствительным способов оценки (гипо)метаболизма головного мозга. В клинической практике наибольшее распространение получил анализ спинномозговой жидкости, полученной методом микродиализа головного мозга, позволяющий оценивать продукцию лактата, утилизацию глюкозы [6], продукцию цитокинов [7], аккумуляцию бета-амилоида [8].

Кроме сбора аналита, этот метод применяют как средство доставки вещества в обозначенную зону [9, 10, 11] и используют для изучения распределения лекарственного средства в тканях in vivo, концентрации на целевом участке, что дает возможность сопоставления содержания лекарственного препарата и фармакологических эффектов. Микродиализ позволяет повысить эффективность фармакокинетических измерений, полагаясь на дискретные образцы биологической жидкости.

Стоит отметить, что микродиализ сочетается с высокочувствительными аналитическими методами, которые позволяют количественно определять низкие концентрации в образцах малого размера [12]. Для точной идентификации соединений из современных обычно используют высокоэффективную жидкостную хроматографию, иммуноферментный анализ [13], электрофорез на микрочипах [14, 15], измерение активности ферментов [16], различные электрохимические методы [17], а также метод масс-спектрометрии прямого введения [18].

В целом микродиализ является высокочувствительным методом [9], отличается разнообразием микродиализных канюлей и множеством других возможных модификаций процесса [13, 19], в том числе в контексте использования поведенческих реакций в качестве стимулов к выработке гормонов и других потенциальных аналитов, с целью выявления зависимости картины метаболома от экзогенных факторов при проведении экспериментов в области нейробиологии поведения [20].

В основе метода лежит принцип простой диффузии - молекулы диффундируют из интересующего объекта в непрерывно текущую изотоническую жидкость через полунепроницаемую мембрану направляющей канюли (рисунок 1) [21-23].

Рисунок 1. Принцип работы метода микродиализа. C - концентрация аналита (in - входя-щего, out - исходя-щего); D - коэффи-циент диффузии (m -через мембрану).

Figure 1. General principle of the microdialysis technique. CD in (in-let) - analyte concen-tration in the perfu-sate, CD out (outlet) - analyte concentration in the dialysate, Dm - membrane diffusion coefficient

Типичная установка для системы микродиализа включает в себя шприцевой и перистальтический насосы, регулирующие постоянную скорость подачи и забора изотонической жидкости и диализата соответственно, прозрачный бокс для нахождения животного и наблюдения за ним, направляющую канюлю (зонд) для микродиализа, фракционный коллектор с системой охлаждения и соединительные трубки (капилляры) (рисунок 2) [9].

Рисунок 2. Типичная установка для микродиализа. 1 - шприцевой насос; 2 - прозрачный бокс для эксперименталь-ного животного; 3 - перистальтический насос; 4 - коллектор с системой охлажде-ния; 5 - направляю-щая канюля (микро-диализный зонд).

Figure 2. Typical microdialy-sis setup. 1 - syringe pump; 2 - transpar-ent box for an ex-perimental animal; 3 - peristaltic pump; 4 - cooling collector; 5 - guide cannula (micro-dialysis probe

Одним из наиболее важных компонентов микродиализа является микродиализный зонд [11, 24]. Смысл применения направляющей канюли заключается в том, чтобы имитировать кровеносный сосуд (капилляр) [25]. На конце зонда находится полунепроницаемая мембрана, которая является ее основным "рабочим" элементом (рисунок 3).

Рисунок 3. Схематичное изо-бражение универ-сального зонда для микродиализа. 1 - капилляр на "вход" для перфузата; 2 - капилляр на "вы-ход" для диализата; 3 - посредник; 4 - полунепроницаемая мембрана

Figure 3. Schematic represen-tation of a microdi-alysis probe. 1 - in-let capillary for the perfusate; 2 - outlet capillary for the dial-ysate; 3 - adapter; 4 - semi-impermeable membrane.

При достижении изотонической жидкости мембранного участка зонда происходит пассивный транспорт веществ из межклеточной жидкости в полость катетера по градиенту концентрации. Таким образом фактически достигается воспроизведение механизма диффузии внеклеточной жидкости в просвет микрососуда, но, разумеется, не учитываются возможные механизмы транспорта, существующие в естественных условиях, порозность мембраны и изменения ее структурной целостности под действием (пато)физиологических факторов.

В целом надо учитывать, что имитация проницаемости микрососуда головного мозга применением микродиализной мембраной до сих пор не может быть достигнута. Это, прежде всего, связано с тем, что гематоэцефали- ческий барьер (ГЭБ) является высокоселективным полупроницаемым физиологическим барьером, обеспечивающий постоянную и оптимальную химическую среду в паренхиме головного мозга, тем самым играя важную роль в поддержании гомеостаза в ткани [26]. Особую значимость механизмы обеспечения структурно-функциональной целостности ГЭБ приобретают при хронической нейродегенерации, нейровоспалении, острой ишемии и реализации феномена эксайтотоксичности [27-29].

Однако ограниченность знаний о механизмах регуляции проницаемости ГЭБ в норме и при патологии и недоступность материалов, воспроизводящих параметры проницаемости барьера, в том числе измененные при патологии головного мозга, ограничивают возможности по применению технологии микродиализа для решения вопросов управления проницаемостью ГЭБ, причем это ограничение справедливо и при применении микродиализного подхода в реконструируемых моделях ГЭБ in vitro [30].

Направляющая канюля способна пропускать соединения определённой молекулярной массы и в соответствующих концентрациях в ее внутреннее пространство. Способность к пропусканию веществ определяется специальной величиной MWCO (molecular weight cut-off, "граница отсева задерживаемых компонентов по молекулярному весу"), которая обозначает молекулярную массу условного вещества, при которой 90% его массы задерживается мембраной [9, 10]. Чаще всего коммерчески доступные мембраны имеют MWCO порядка 20-100 кДа, однако бывают мембраны и большего значения этих величин [9].

На проницаемость и "собирательную способность" мембраны в отношении целевого компонента влияют различные особенности: ее поверхностная энергия, полярность, заряд и структурные характеристики. Последние должны повторять особенности материала импланта, клеточных стенок, поверхностей биосенсоров или фильтрационных мембран. Материалы подбираются также с учётом веществ, которые будут проходить сквозь отверстие. Belfort и др. установили, что неполярные поверхности дестабилизируют белки и таким образом вызывают конформационные изменения, приводящие к тесным взаимодействиям внутренних и наружных частей белковой молекулы [31].

Главной особенностью метода микродиализа является способность к сбору аналитов при контроле лишь скорости потока. Для предотвращения эффекта ультрафильтрации (процесса переноса аналитов через мембрану с использованием изменения давления в системе, наличие которого можно определить по "запотеванию" зонда) в отдельных случаях акцентируют внимание на давлении, которое может быть разным на внутренней и внешней границах мембраны [13].

Если представить микродиализ в виде некоторой последовательности действий, то его условно можно разделить на два этапа: операцию по установке канюли и собственно сбор диализата.

Установка канюли производится с помощью стереотаксического аппарата, который представляет собой прибор с направляющим штативом, способным быть сориентированным в соответствии с принятой системой координат. При этом в череп имплантируется направляющая канюля, которая обеспечивает доступ перфузата в заданную область. Стоит отметить, что происходит нарушение функционирования целевого отдела, сопровождающееся разрушением капилляров, сосудов, образованием ишемического очага [32] либо очага локального нейровоспаления, вследствие чего наблюдается дисбаланс концентраций различных метаболитов, искажается состав внеклеточной жидкости (в нем появляются продукты разрушенных клеток, провоспалительные цитокины, продукты окислительного повреждения белков и липидов). Вследствие вышеперечисленных причин необходимы поправки к концентрациям метаболитов из нарушенной области, что обычно достигается применением достаточного периода времени после установки канюли для редуцирования процессов воспаления и ишемии.

Однако нарушения физиологических параметров являются не единственной причиной применения поправок к исследуемому образцу диализата. С течением времени через мембрану проходит определённое количество вещества, что является причиной истощения концентрации метаболита в окружающей ткани [10]. Если время наблюдения достаточно велико, то это может привести к ложным заключениям о динамике секреции тех или иных нейротрансмиттеров или нейропептидов. Следует принимать во внимание и скорость потока, площадь мембраны, через которую происходит диффузия, эффективную проницаемость мембраны. Одним из основных параметров является безразмерная величина эффективности восстановления аналита - "относительное восстановление". Данный термин отражает эффективность забора аналита из межклеточного вещества, которая уменьшается при возрастании скорости потока и сопротивления внутри мембраны.

Во время процесса микродиализа вещества перемещаются через три среды, каждая из которых имеет различный состав: перфузат, мембрану и межклеточную среду (ткань). Факторы, которые определяют диффузию, будут изменяться в каждой среде и, соответственно, уровни концентрации целевого компонента будут отличаться тоже. Следовательно, диффузионные характеристики вещества в каждой среде должны рассматриваться отдельно.

Изменения в межклеточной концентрации аналита (Ед) могут проявляться как увеличение или уменьшение концентрации диализата в аналите. Следовательно, изменения концентрации диализата не обязательно означают, что внеклеточная концентрация изменилась. Снижение эффективности восстановления может означать снижение относительного восстановления или увеличение радиального расстояния между ненарушенной тканью и зондом, а его увеличение может означать увеличение относительного восстановления или уменьшение радиального расстояния между ненарушенной тканью и зондом. В большинстве обычных вариантов интерпретации результатов микродиализа основное предположение заключается в том, что Ед остаётся неизменным в течение сбора диализата, поэтому любое изменение концентрации диализата интерпретируется как изменение внеклеточной концентрации [33].

Существует также понятие "эффективной проницаемости". Его физический смысл состоит в способности проникновении целевого компонента через мембрану из внешней среды, без учёта вещества аналита, потерянного для диализата в силу различных причин (выход аналита обратно во внешнюю среду, его адгезия к веществу мембраны и т.д.) [34].

Эффективная проницаемость мембраны выводится из понятия "чистоты диализа" (т. е. его "продуктивности") (^0), которая равна произведению относительного восстановления и скорости потока. Для получения "чистого" диализата необходимо выполнение следующих требований: мембрана цилиндрическая полупроницаемая и состоит из гомогенного материала; скорость потока микродиализа неизменна с течением времени; отсутствуют конвекционные потоки внутри системы "зонд-окружающие ткани"; существует как приток аналита внутрь канюли, так и его отток.

Кроме того, следует знать, каким образом осуществляется калибровка системы для нахождения оптимальной скорости потока с приемлемым коэффициентом восстановления.

Если представить себе общий смысл проводимых манипуляций, то все они сводятся к измерению концентрации восстановленного ана- лита при определённой(-ых) скорости(-ях) потока.

Одним из способов является метод медленного (нулевого) потока [9]: при нём производится забор диализата при "ультранизких" скоростях потока порядка 0,1-0,3 мкл/мин. При столь низкой интенсивности тока жидкости коэффициент восстановления стремится к 100%. Метод нулевого потока сводится к нахождению точки отсутствия изменения концентрации аналита, которая находится по обнаружению её изменения между диализатом и перфузатом. При этом строится график зависимости между концентрациями аналита в межклеточной жидкости и разницей его концентраций в диализате и перфузате. Соответственно упомянутая точка отражает концентрацию вещества в исследуемой среде. Следует, однако, иметь в виду, что данный метод нежелательно использовать для исследований in vivo из-за изменения в концентрации целевого соединения в окружающем пространстве.

Динамический метод нулевого потока предполагает, в отличие от описанного выше, использование группы животных для калибровки, которые формируются в зависимости от используемой концентрации аналита. В этом случае строится график зависимости концентрации от прошедшего времени. Этот метод пригоден для оценки влияния введённых в орган соединений на уровень других веществ.

Микродиализ по праву называют доминирующим методом для изучения центральной нервной системы in vivo. Универсальность микродиализа позволяет использовать его для изучения клеточно-молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза многих неврологических заболеваний, эффектов лекарств, внешних факторов, а также реализации сложных форм поведения и когниции [35].

Мониторинг метаболизма головного мозга с помощью внутримозгового микродиализа дает возможность предсказывать вторичные повреждения и может сопутствовать принятию решений относительно вмешательств, влияющих на исход заболеваний. Тем не менее, внутримозговой микродиализ является локальной методикой измерения, которая зависит от установки зонда вблизи очага поражения. Непрерывное использование этой методики предоставляет информацию об общем метаболизме мозга.

В последние два десятилетия появились многочисленные примеры эффективного использования метода микродиализа головного мозга при изучении функционирования головного мозга в норме и при экспериментальной патологии центральной нервной системы. Например, результаты микродиализа свидетельствуют об уменьшении концентрации свободного фенитоина - противоэпилептического препарата в мозге крыс при дисфункции ГЭБ [36, 37]. Крысам линии Wistar с искусственно вызванной моделью аутизма имплантировали микродиализную канюлю в головной мозг для исследования концентраций нейротрансмит- терных аминокислот (глутамата, глутамина и Y- аминомасляной кислоты (ГАМК) и дальнейшим анализом с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [38].

Heidrun Potschka и др. изучали ингибирующее влияние верапамила на концентрацию P-гликопротина - одного из транспортеров для фенобарбитала, ламотриджина и фельбамата в головной мозг, сверхэкспрессия которого значительно снижает их биодоступность. Перфузию верапамила в кору головного мозга крысам осуществляли с использованием микро- диализного зонда. В собранной межклеточной жидкости отмечалось увеличение противоэпи- лептических лекарственных средств, что подтверждает ингибирующий эффект верапамила на P-гликопротина, тем самым повышает биодоступность данной группы препаратов в мозге [39].

Для изучения количественной информации о доставке метотрексата и его липосомаль- ных композиций в мозг в исследовании [40] применяли микродиализ. Для создания жирорастворимых форм использовали два вида фософолипидов: 1 - гидрогенизирован- ный соевый фосфатидилхолин (hydrogenated soy phosphatidylcholine, HSPC) и 2 - фос- фатидилхолин яичный желток (egg-yolk phosphatidylcholine, EYPC). Самцам крыс устанавливали направляющую канюлю в стриатум, после чего помещали в специальный бокс, где животное могло свободно перемещаться. Эксперимент проводили через 24 часа после операции. Скорость подачи перфузуата равнялась 0,5 мкл/мин. Собранная межклеточная жидкость анализировалась путем применения ВЭЖХ с тандемной масс-спек- трометрией. Физико-химический анализ продемонстрировал, что концентрация композиции метотрексата-EYPC была выше в 3 раза в межклеточной жидкости мозга, в то время как метотрексат-HSPC не показал статистически достоверного повышения биодоступности относительно введения самого метотрексата.

Применение микродиализа in vivo в эксперименте на мышах предоставило возможность доказать участие авкапорина-4 (AQP4) - белка, образующего водопроводящие каналы в клетках периваскулярной астроглии, в регуляции высвобождения нейромедиаторов. Были изучены изменения в выбросах нейротрансмиттеров в стандартных условиях и после стимуляции высокими концентрациями K(+) полосатого тела мышей дикого типа и AQP4-нокаутированных животных. Через 24 часа после деполяризующего стимула секреция нейротрансмиттеров не изменялась и была аналогичной у всех животных, за исключением таурина. Тем не менее, внеклеточная концентрации дофамина и его метаболитов были значительно увеличены у нокаутированных грызунов с последующим снижением или отсутствием реакции на деполяризующие раздражители при измерении через 7 дней после операции [41].

Для выявления влияния локальной инсулинорезистентности в ткани головного мозга на динамику отложения в-амилоида (Ав) при болезни Альцгеймера Wakabayashi T. и соавт. стереотаксически имплантировали направляющую канюлю с мембраной (30 кДа MWCO) в левый гиппокамп мышей. Образцы собирали каждый час, после чего были анализированы с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) [42].

Используя метод микродиализа in vivo, авторы работы [43] установили, что именно липопротеин ApoE4 у мышей увеличивает период полувыведения Ав в мозге при нейродегенерации альцгеймеровского типа.

Уровни нейротрансмитттеров (допамина, серотонина, норадреналина, гомованиловой кислоты и норметанефрина) и их метаболитов были изучены in vivo в диализатах, полученных от крыс с кетаминовой моделью шизофрении. Образцы собирали у свободно движущихся животных с имплантированными канюлями в область стриатума (полосатое тело) мозга. Биологический материал немедленно замораживали на сухом льду (-70° С) до момента востребования. Количественное определение проводили с помощью ВЭЖХ с электрохимическим детектированием [44].

Для изучения роли и влияния инотропных глутаматных рецепторов (AMPA-R), на уровни Я-амилоидов, которые непосредственно влияют на возникновение болезни Альцгеймера, авторы исследования [45] использовали микродиализ in vivo на мышиной модели APP/ PS1. Направляющую канюлю имплантировали стереотаксически в левый гиппокамп и закрепили с помощью зубного цемента. Капилляры и зонды перфузировали искусственной спинномозговой жидкостью, содержащей 0,15% бычьего сывороточного альбумина (скорость 0,5 мкл/мин). Hettinger J.C. с соавторами, используя шприцевой насос, вводили а-ами- но-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионо- вой кислоту (AMPA) и одновременно собирали интерстициальную жидкость для анализа AЯ с помощью перистальтического насоса. В конце эксперимента все образцы межклеточной жидкости анализировали на уровни AЯx- 40 или AЯx-42 с помощью ИФА.

Авторы работы [46] разработали автоматизированный метод онлайн-сбора и количественного определения нейропептидов в микродиализатах мозга крыс. Межклеточная жидкость, собранная из гиппокампа, была изучена количественно использованием тандемной масс-спектрометрии и капиллярной жидкостной хроматографии (cLC-MS). Количественное определение концентраций нейропептидов лей-энкефалина и мет-энкефалина в диализате гиппокампа крыс анализировали с использованием деметилирования их на колонке.

Установлено, что сочетание методов микродиализа и ВЭЖХ в тандеме с масс-спектрометрией позволяет проводить одновременный и непрерывный количественный анализ нейроактивных веществ в биологической жидкости гиппокампа и плазме, изучая при этом терапевтический эффект активного целевого соединения на бодрствующих ишемизированных крысах [47].

Тканевая инженерия и регенеративная медицина для исследования и восстановления нервной системы предоставляют новые перспективные направления, прогресс в которых обусловлен новыми технологическими возможностями в создании микрофизиологических систем в формате brain-on-chip или blood-brain barrier-on-chip [48, 49].

Не менее интересные возможности открывает применение подхода, сочетающего сбор образца с помощью метода микродиализа головного мозга и определение концентрации веществ в микрочипах, ассоциированных с зондом, например, для автоматического мониторинга концентрации серотонина и малонового диальдегида в разных регионах головного мозга [50] или для регистрации концентрации глутамата в активных зонах головного мозга [51]. Samper и др. изготовили 3D-печатную микрожидкостную биосенсорную платформу для записи on-line нейрохимических изменений в мозге человека. Система базировалась на методе микродиализа - для сбора и обнаружения нейротрансмиттеров и других молекул в межклеточной жидкости ткани, и электрохимических биосенсоров - для контроля различных биомаркеров. Используя это микрофлюидное устройство совместно с методом микродиализа, можно было обнаружить изменения концентрации переходного метаболита, а также динамическое изменение целевых компонентов в мозге живого человека в режиме реального времени впервые [52]. Другое направление совершенствования метода микродиализа головного мозга основано на разработке миниатюрных зондов, как это было сделано в работе [53]: зонд 140 на 140 микрометров позволяет обеспечивать сбор перфузата по 20 3-микрометровым каналам, что обеспечивает площадь диффузии 1200 квадратных микрометров.

Еще одно перспективное направления в развитии метода микродиализа головного мозга связано с его применением для оценки функционирвоания субклеточных органелл. Так, например, оценка уровней лактата и пирувата позволила исследователям [54] оценить развитие митохондриальной дисфункции в клетках головного мозга голубей при химической гипоксии. Изучение особенностей реализации реакций цикла трикарбоновых кислот в клетках головного мозга, а также влияния различных нейротрансмиттеров на энергетическую функцию митохондрий достижимо в эксперименте с применением метода микродиализа [19]. Не менее интересным является исследование функциональной активности митохондрий клеток головного мозга эксперименталььных животных с применением метода микродиализа и 13С-меченых метаболитов цикла трикарбоновых кислот, в том числе на фоне церебральной ишемии, индуцированной эндотелином-1 [55]. В клинической практике определение отношения уровней лактата и пирувата во внеклеточной жидкости головного мозга позволяет оценить повреждение митохондрий [56, 57].

Универсальный характер метода микродиализа позволяет широко использовать этот протокол в биомедицинских и клинических исследованиях. Тем не менее, чтобы использовать преимущества микродиализа, необходимо в полной мере учесть немалое количество параметров для минимизации ошибок и предотвращения погрешностей. Метод микродиализа в медицинской практике может быть совмещён с различными приспособлениями для детектирования того или иного типа нейротрансмиттеров. Однако предпочтение отдается тандемной масс-спектрометрии (МС/МС), которая часто используется для анализа. В этом методе задается "интересующий" целевой компонент для анализа, который фрагментируется масс-спектрометром, что в итоге приводит к увеличению селективности, количественной оценке и чувствительности по сравнению с одностадийными измерениями МС Повреждения, происходящие на клеточном и молекулярном уровнях, уклоняются от обнаружения с помощью обычного гемодинамического мониторинга и неврологического обследования. Церебральный микродиализ является инвазивным средством обеспечения почти непрерывного измерения метаболизма любого отдела головного мозга (таблица 1) и перспективным инструментом, который может обнаружить признаки клеточной патологии до системных проявлений заболевания [36].

Этот метод развивался с разработкой высокочувствительных аналитических методов, позволяющих количественно определять низкие концентрации в образцах малого размера. Потенциальная и ценная роль этого метода может заключаться в использовании метода в качестве локального устройства для отбора проб в метаболомике. Тем не менее, выбор подходящего метода должен быть тщательно продуман, поскольку чувствительность и специфичность имеют решающее значение при измерении этих медиаторов в образцах микродиализа с ограниченным объемом [12].

Таблица 1. Сводные данные некоторых экспериментальных исследований по изучению метаболизма головного мозга на грызунах методом микродиализа

Table 1. Summary of the ex-perimental studies on brain metabolism in rodents by microdi-alysis

Литература / References