Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов пациента с муковисцидозом

RECEIVING INDUCED PLURIPOTENTIAL STEM CELLS FROM FIBROBLASTS OF PATIENTS WITH CYSTIC FIBROSIS

E.V. Kondrateva¹, E.P. Adilgereeva¹, E. L. Amelina², V. Yu. Tabakov¹, A. A. Anuchina¹, K. D. Ustinov¹, M. I. Yasinovsky¹, E. S. Voronina¹, A. V. Lavrov^1,3, S. A. Smirnikhina¹

Research Centre for Medical Genetics, Moscow 115522, Russian Federation ²Pulmonology Scientific Research Institute, Moscow 115682, Russian Federation ³Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow 117997, Russian Federation

The aim of the researchis the development of protocol for receiving induced pluripotent stem cells (iPSCs) and the creation of line from iPSCs received from cells of patients with cystic fibrosis caused by homozygous mutation F508del.

Material and methods.IPSCs were received reprogramming cultured fibroblasts of a patient with cystic fibrosis using Sendai virus. Presence of CFTR gene mutations in fibroblasts and the obtained iPSCs were confirmed by Sanger DNA sequencing. The obtained iPSC clone was cultured till embryoidbodies stage and, after spontaneous differentiation, it was stained immunocytochemically. Analysis of gene expression in the obtained iPSC line was performed using immunocytochemical staining and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). To confirm the absence of chromosomal rearrangements, analysis of karyotype of the obtained iPSCs was performed.

Results.The obtained iPSC line demonstrated embryonic stem cells morphology. The cells had normal karyotype 46, XY, they were specifically stained by antibodies for pluripotency markers (Oct4, Nanog, TRA-1-81 and SSEA-4) in immunocytochemical analysis, also they demonstrated the expression of markers for pluripotency (OCT4, NANOG and FOXD3) in RT-PCR. Cells, positively stained with antibodies for markers of three germ layers - ectoderm (b-III-tubulin), mesoderm (fibronectin) and endoderm (a-fetoprotein), were detected in the culture of differentiated iPSCs.

Conclusion.Thus, a protocol for obtaining and characterizing iPSCs has been worked out, iPSC line has been created, and also their functional and phenotypic pluripotency has been confirmed.

Key words:induced pluripotent stem cells, cell reprogramming, fibroblasts, cystic fibrosis, Sendai virus.

Муковисцидоз (МВ) является одним из самых распространённых наследственных заболеваний: по данным ВОЗ, частота заболевания в разных популяциях, нациях и этнических группах существенно варьирует, составляя в среднем 1 случай на 2000-2500 новорожденных у представителей белой расы. Данная патология обусловлена мутациями в гене CFTR (cysticfibrosistransmembrane conductance regulator, муковисцидоз-ный трансмембранный регулятор проводимости), частота их носительства среди европеоидов достигает 1 на 25 человек [1]. Самой частой мутацией является F508del, ее частота достигает 85 % среди больных МВ [2]. В результате мутаций в гене CFTRнарушается транспорт ионов хлора и натрия через клеточную мембрану, что вызывает у пациента нарушения функционирования желёз внешней секреции, а наиболее распространенной формой МВ является лёгочная форма, при которой возникает секреторная недостаточность бронхиального дерева. В результате развивается му-костаз, нарушение вентиляции лёгких, что приводит к ослаблению неспецифического механизма защиты, присоединению респираторной инфекции и формированию множественных бронхоэктазов. Именно дыхательная недостаточность является причиной смерти подавляющего большинства детей и взрослых с МВ [3].

На сегодняшний день МВ, как и большинство других наследственных заболеваний, не имеет этиотропной терапии. Пациенты вынуждены на протяжении всей жизни принимать муколитики, антибиотики, следить за должным удалением мокроты и бороться с тяжелыми обострениями болезни.

Между тем, в последние годы широко распространились и продолжают развиваться методы геномного редактирования, позволяющие корректировать мутации. Эти методы являются технологически не очень сложными, демонстрируют довольно высокую эффективность и позволяют получить стабильный результат. При этом патогенетические методы лечения подходят не всем пациентам, так как разработаны для лечения больных с определённым перечнем мутаций, в отличие от технологии геномного редактирования CRISPR/Cas9, которая является более универсальной.

Для разработки метода лечения МВ путем коррекции мутации в гене CFTRс помощью технологии CRISPR/Cas9 у человека теоретически можно использовать два подхода: ex vivo(забор клеток у пациента, их редактирование и последующая их аутологичная трансплантация) и invivo(системное введение в организм человека компонентов для геномного редактирования). Чтобы отработать подходы к лечению, в первую очередь, необходимо получить индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из фибробластов больных МВ, провести редактирование мутации и вызвать дифференцировку ИПСК, например, в клетки респираторного эпителия. В дифференцированных клетках можно показать восстановление функции канала CFTR, в отличие от ИПСК, в которых этот белок не экспрессируется.

В течение последнего десятилетия ученым уже неоднократно удавалось получить ИПСК из соматических клеток взрослого организма путем их репрограммирования до плюрипотентного состояния с помощью набора определенных транскрипционных факторов. Факторы Oct4, Sox2, Klf4 и c-Mycявляются классическими трансгенами и используются с 2006 года, когда С. Яманака и К. Такахаши впервые описали их необходимость и достаточность для индукции плюрипотентного состояния в мышиных эмбриональных фибробластах [4]. Позднее было показано, что та же самая комбинация факторов способна индуцировать плюри-потентное состояние в клетках человека [5].

Опубликовано множество протоколов, которые различаются по способу доставки трансгенов в клетки, условиям культивирования клеток в процессе репрограммирования, а также эффективности [6].

Одним из способов доставки факторов Яманаки(Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc) является доставка с помощью лентивирусов. Были получены ИПСК с применением данного метода доставки трансгенов как на мышиных, так и на человеческих клетках invitro[7, 8, 9]. Однако, лентивирусы, используемые в качестве способа доставки, обладают способностью интегрироваться в геном клетки и сохранять в дальнейшем транскрипционную активность в ИПСК [10], что делает лентивирусный метод небезопасным для использования. Подобное интегрирование может вызывать непредвиденные модификации структуры генома, приводить к развитию злокачественных новообразований.

В другом способе доставки трансгенов используются ретровирусные векторы [4, 11], однако они аналогично лентивирусам способны интегрироваться в геном клеток, и существуют исследования, показывающие, что трансгенные факторы начинали вновь экспрессироваться уже в дифференцированной клетке, полученной из ИПСК после репрограммирования с помощью ретровируса [10].

Были предприняты попытки получить стабильный, качественный, а главное - безопасный способ доставки факторов репрограммирования с помощью невирусных моделей [12]. Но до сих пор ещё не создан невирусный метод, удовлетворяющий условиям. Все попытки приводили к тому, что методика оказывалась или недостаточно эффективной, не позволяя клетке полноценно дедифференцироваться в плюрипотентное состояние, или слишком опасной и бесконтрольной, что могло вызвать различные спонтанные мутации в клетках пациента.

Наконец, существует способ репрограммирования соматических клеток в ИПСК с помощью вируса Сендай - РНК-содержащего вируса, который не проникает в ядро клетки, и, следовательно, не встраивается в клеточный геном [13, 14, 15]. Репрограммирование клеток в ИПСК с использованием вируса Сендай достигается благодаря экспрессии факторов Яманаки, трансгены которых содержатся в векторных частицах, и является достаточно эффективным и безопасным.

Целью нашего исследования была разработка эффективного протокола получения ИПСК и получение линии ИПСК из клеток от пациента с муковисцидозом, вызванным гомозиготной мутацией F508del.

Материал и методы

муковисцидоз плюрипотентный стволовая клетка

Получение первичной культуры фибробластовУ пациента с муковисцидозом после подписания им формы информированного согласия в качестве анонимного участника исследования и донора биологических материалов проводили биопсию кожи со средней трети внутренней поверхности предплечья. Все услуги по культивированию и пробоподго-товке были предоставлены Центром коллективного пользования «Биобанк» (ФГБНУ «МГНЦ», Москва, Россия). Первичную культуру фибробластов кожи получали из биопсийного материала с помощью разработанной процедуры подготовки культуры клеток фибробластов. Фибробласты изначально размножали в пролиферативной среде «Амниокар» (ПанЭко). Полученные культуры депонированы и доступны в ЦКП «Биобанк».

Подтверждение мутацииИз первичной культуры фибробластов и из культуры ИПСК выделяли геномную ДНК с помощью набора Quick-DNAMiniprepKit (ZymoResearch) и оценивали ее концентрацию с помощью набора QubitdsDNABRAssayKit (LifeTechnologies) согласно инструкциям производителей. ПЦР-амплификацию продукта реакции проводили с помощью Taq-полимеразы и смеси dNTP(Евроген) в аплификаторе(Eppendorf) и пары специфических праймеров (см. табл.). ПЦР-продукты анализировали методом секве-нирования ДНК по Сэнгеру.

Таблица Список использованных праймеров Table List of primers used

Получение ИПСК с помощью вирусных векторов

Первичную культуру фибробластов, замороженную на втором пассаже, размораживали в среде для культивирования фибробластов (состав:DMEM+GlutaMax(LifeTechnologies), 1 % смесь аминокислот MEM (LifeTechnologies), 5,5 мМ бета-меркаптоэтанол(Sigma- Aldrich), пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/ мл) (ПанЭко)) с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Hyclone) и засевали в культуральные флаконы 25 см²(Costar). После достижения клетками конфлюэнтности 95-100 % их пересевали в 6-луноч-ныекультуральные планшеты (Costar) в плотности 20-80 тыс. клеток на одну лунку. Репрограммирование проводили с использованием набора CytoTune™ -iPS2.0 SendaiReprogrammingKit (ThermoFisherScientific) согласно протоколу производителя. Клетки культивировали в среде для культивирования фибробластов с добавлением 10% FBS. На 8 день после репрограммирования клетки пересевали в культуральные планшеты (Costar), предварительно покрытые витронектином(LifeTechnologies) согласно протоколу производителя. Через сутки после пересева клетки переводили на среду Essential8™ Medium (ThermoFisherScientific). На 1012 день наблюдалось появление первых колоний. К 28му дню после репрограммирования колонии выделяли механически и пересевали.

Иммуноцитохимическое окрашивание

В иммуноцитохимическом анализе экспрессии маркеров SSEA4, OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 использовали мышиные моноклональные антитела против SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 (все ThermoFisherScientific), SOX2 (Abcam), кроличьи поликлональные антитела против OCT4 (Abcam) и против NANOG (Thermo Fisher Scientific), а также вторичные проти-вомышиные и противокроличьи (все Invitrogen) антитела согласно инструкциям производителей. Иммунофлуоресценцию регистрировали с помощью флуоресцентного микроскопа AxioVERTA1 (Zeiss) и программного обеспечения ZEN.

Полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией

Тотальную РНК выделяли из клеток с помощью набора RNeasy Plus mini kit (Qiagen) и оценивали ее концентрацию с помощью набора Qubit RNA BR Assay Kit (Life Technologies) согласно инструкциям производителей. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием случайных шестинуклеотидныхпраймеров (ДНК-Синтез), обратной транскриптазы M-MLV (Promega), ингибитора рибонуклеаз(Promega), смеси нуклеотидов (Fermentas) согласно инструкциям производителей, используя 1 мкг тотальной РНК на одну реакцию. ПЦР-амплификацию продуктов реакции проводили с помощью Taq-полимеразы и смеси dNTP(Евроген) в аплификаторе(Eppendorf). Список использованных праймеров, специфичных для генов OCT4, NANOGи FOXD3,приведен в таблице (см. выше). ПЦР-продукты анализировали путем электрофореза ДНК в 1,5 % агарозном геле.

Кариотипирование

Анализ кариотипа полученных ИПСК проводили методом GTG-дифференциального окрашивания в соответствии со стандартными цитогенетическими протоколами на основе Международной системы цитогенетической номенклатуры человека (2016 г.). Высушенные на воздухе препараты метафазных хромосом выдерживали несколько дней при комнатной температуре. Препараты обрабатывали 0,05 % трипсином (Hyclone) в течение 1-5 минут при комнатной температуре, промывали фосфатным буфером (ПанЭко). Затем препараты окрашивали в красящем 5 % растворе Гимза (ПанЭко) в течение 1-5 минут, промывали дистиллированной водой и высушивали при комнатной температуре, после чего проводили микроскопический анализ.

Формирование и культивирование эмбриоидных телец (спонтанная дифференцировка ИПСК)

Колонии ИПСК снимали раствором Версена (ПанЭко) по стандартному протоколу, диссоциировали на фрагменты в 1 мл среды TeSR-E8 (StemCellTechnologies) с 5 мкМ ROCK-ингибитора Y27632 (StemCellTechnologies) и переносили в 6-луночный планшет с предельно низкой адгезией Corning® Costar®

Ultra-Low Attachment 6-well plate (Corning).

Через 3 дня среду заменяли на свежую, состоящую из 12 объема среды TeSR-E8 и 12 объема ES-среды (состав:DMEM/F12 (Hyclone),

20% KOSerumreplacement

(ThermoFisherScientific), 2 мМL-глутамин(Hyclone), 0,1 мМ в-меркаптоэтанол(Sigma-Aldrich), 1% смесь аминокислот (Hyclone), пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл) (ПанЭко)). Еще через 3 дня заменяли половину объема среды в лунках на среду для культивирования эмбриоидных телец (EB-среда), состоящую из 12 объема ES-среды и 12 объема среды для фибробластов без FBS. Далее смену 12 объема среды в лунке проводили раз в 2-3 дня в течение 14 дней, при этом вводили FBS (Hyclone) и при каждой последующей смене постепенно увеличивали его содержание в свежей среде, начиная с 1 % и заканчивая 10 % от общего объема среды.

На 16-й день эмбриоидные тельца аккуратно собирали в стерильные пластмассовые наконечники (ULPlast) с помощью автоматических пипеток (ThermoFisherScientific) и переносили на покрытые желатином (Sigma-Aldrich) 60-мм чашки Петри (SPLLifeSciences) в среду для культивирования эмбрио-идных телец с добавлением 10 % FBS. Эмбриоидные тельца прикреплялись к желатиновой подложке, начиналась миграция клеток из эмбриоидных телец на поверхность чашки.

Через 16-20 дней образовывались обширные области дифференцированных клеток. На 30-й день культивирования клетки фиксировали в 4 % параформальдегиде (З^та-АЫпсЬ) и проводили иммуноцитохимический анализ на маркеры клеток, принадлежащих трём зародышевым листкам. Для анализа использовали мышиные моноклональные антитела против Ь-тубулина и а-фетопротеина и кроличье поликлональное антитело против фибронектина (все АЬсат), а также вторичные противомышиные и противокроличьи (все Invitrogen) антитела согласно инструкциям производителей.