Применение современных методов в микробиологической диагностике хронической инфекции легких у больных муковисцидозом

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи

Медико-генетический научный центр

Применение современных методов в микробиологической диагностике хронической инфекции легких у больных муковисцидозом

Л.Р. Аветисян, М.Ю. Чернуха

И.А. Шагинян, О.С. Медведева

Е.М. Бурмистров, Е.В. Русакова

В.Г. Жуховицкий, Н.Б. Поляков

Е.А. Козлова, Р.М. Будзинский²

Москва, Российская Федерация



Аннотация

Цель исследования. Обосновать применение комплексного подхода с использованием современных методов идентификации микроорганизмов для микробиологической диагностики ХИЛ у больных муковисцидозом и подтвердить его эффективность.

Материал и методы. Исследованы 2300 мазков из зева и образцов мокроты от больных МВ и штаммы S. aureus, P aeruginosa, Bcc и Achromobacter spp., выделенные от больных МВ с 2006 по 2018гг. Использовали бактериологические, биохимические и молекулярно-генетические методы, а также MALDI-TOF.

Результаты. Показано, что применение только классических бактериологических методов не обеспечивают достоверную этиологическую диагностику. Установлено, что наиболее трудно с помощью бактериологических методов является идентификация бактерий Achromobacter spp. и Burkholderia cepacia complex. В результате исследования с помощью MALDI-BIOTYPERtm было идентифицировано 90 видов бактерий, которые были выделены из зева и мокроты больных муковисцидозом. Изоляты Achromobacter spp., выделенные от российских больных МВ, с помощью MALDI-BIOTYPERtm были отнесены к A. ruhlandii, A. xylosoxidans, A. insolitus, A. piechaudii, A. insuavis, A. spanius, среди которых 76% принадлежали к виду A. ruhlandii и 7,2% к виду A. xylosoxidans. Для дифференциации бактерий Всс и Achromobacter spp. до вида необходимо использовать мультилокусное секвенирование (MLST) или однолокусное секвенированине генов nrdA765, gltB, blaOXA (для Achromobacter spp.) и gyrB, hisA, fur (для Всс). C помощью MLST среди изолятов Burkholderia cepacia complex (Всс) были идентифицированы 4 вида: B. cenocepacia, B. cepacia, B. contaminans и B. multivorans. Из них 83,3% принадлежали к виду B. cenocepacia. В результате MLST штаммов P aeruginosa удалось установить, что среди больных МВ циркулирует международный эпидемический клон - ST235, который был причиной госпитальных инфекций в медицинских учреждениях различных стран. MLST позволило выявить генотипы В. cenocepacia ST709 и ST208, A. ruhlandii ST36 и S. aureus ST8 и подтвердить их эпидемическую значимость для больных МВ в России.

Заключение. Комплексный подход с использованием MALDI-TOF, амплификации и секвенирования специфических генов, рРНК секвенирования, MLST и секвенирования полного генома (WGS) позволяет идентифицировать возбудителей с максимальной достоверностью, а также установить их эпидемическую значимость.

Ключевые слова: муковисцидоз, хроническая инфекция легких, микробиологическая диагностика, MALDI-TOF, молекулярно-генетические методы, комплексный подход.



Annotation

Application of modern methods in microbiological diagnosis of chronic infection of lungs in patients with cystic fibrosis

L.R. Avetisyan, M.Yu. Chernukha, I.A. Shaginyan, O.S. Medvedeva, E.M. Burmistrov, E.V. Rusakova, V.G. Zhukhovitsky, N.B. Polyakov, E.A. Kozlova, R.M. Budzinskiy; N.F. Gamaleya national research center for epidemiology and microbiology, Research centre for medical genetic

The aim of the research is to justify the use of integrated approach, using modern methods of identification of microorganisms for microbiological diagnosis of chronic infection of lungs in patients with cystic fibrosis and to confirm its effectiveness.

Material and methods. 2300 throat swabs and sputum samples from patients with CF and S. aureus, P aeruginosa, Bcc and Achromobacter spp. strains, received from patients with CF during 2006 - 2018, were examined. Bacteriological, biochemical and molecular genetic methods, as well as MALDI-TOF were used.

Results. It has been proved that the use of only classical bacteriological methods does not provide reliable etiological diagnosis. It is found that using identification of bacteria Achromobacter spp. and Burkholderia cepacia complex by means of bacteriological methods is the most difficult. As a result of the study, 90 species of bacteria were identified using MALDI-BIOTYPERtm, which were taken from pharynx and sputum of patients with CF. Achromobacter spp. isolates, taken from Russian patients with CF, using MALDI-BIOTYPERtm, were considered to be A. ruhlandii, A. xylosoxidans, A. insolitus, A. piechaudii, A. insuavis, A. spanius, 76% among which belonged to A. ruhlandii species and 7.2% - to A. xylosoxidans species. To differentiate Bcc and Achromobacter spp. bacteria up to the species, it is necessary to use multilocus sequencing (MLST) or single-locus sequencing of nrdA765, gltB, blaOXA genes (for Achromobacter spp.) and gyrB, hisA, fur (for Bcc). Using MLST the following 4 species were identified among Burkholderia cepacia complex (Bcc) isolates: B. cenocepacia, B. cepacia, B. contaminans and B. multivorans. 83.3% of which belonged to B. cenocepacia species. MLST strains of P aeruginosa made it possible to establish the fact that there was an international epidemic clone, ST235, circulating among CF patients, which caused hospital infections in medical institutions in various countries. MLST helped to reveal genotypes of B. cenocepacia ST709 and ST208, A. ruhlandii ST36 and S. aureus ST8 and to confirm their epidemic significance for CF patients in Russia.

Conclusion. Integrated approach using MALDI-TOF, amplification and sequencing of specific genes, 16S rRNA sequencing, MLST and full genome sequencing (WGS) allows to identify pathogens with maximum confidence, as well as their epidemiological significance.

Key words: cystic fibrosis, chronic lung infection, microbiological diagnostics, MALDI-TOF, molecular genetic methods, integrated approach.



Введение

Хроническая инфекция легких (ХИЛ), которая диагностируется у 9,5% детей в возрасте до 1 года, а к 18 годам - у 80% больных муковисцидозом (МВ), является основным фактором, определяющим тяжесть клинического течения и прогноз заболевания у больных муковисцидозом [1]. В связи с этим, контроль инфекционного процесса при МВ, включающий предупреждение инфицирования, колонизации и формирования хронической инфекции нижних дыхательных путей, а также предупреждение обострения и развития цепация-синдрома, является одним из основных направлений в борьбе с инфекционными осложнениями у больных МВ.

Для контроля инфекционного процесса при МВ необходим постоянный микробиологический мониторинг, в основе которого лежит лабораторная диагностика. Точная и своевременная идентификация возбудителей ХИЛ у больных МВ имеет большое значение для своевременного начала лечения соответствующими антибиотиками и организации надлежащего инфекционного контроля для профилактики распространения патогенных микроорганизмов среди больных МВ.

В настоящее время в России не все бактериологические лаборатории, используя стандартные схемы исследования материала из дыхательных путей, способны проводить точную микробиологическую диагностику. Трудности в диагностике обусловлены тем, что микробная флора дыхательных путей у таких больных представлена часто ассоциациями. Анализ историй болезней 114 больных МВ детей показал, что при 191 микробиологическом обследовании в 59,4% случаях наблюдали ассоциации из различных видов бактерий [1]. Сложность диагностики обусловлена также тем, что ряд видов, вызывающих ХИЛ у больных МВ, могут проявлять атипичные для своего вида фенотипические свойства, например, фенотип мелких колоний S. aureus, S. maltophilia и P. aeruginosa [2], отсутствие лецитиназной активности у S. aureus, отсутствие пигмента у P. aeruginosa и др. [3] Кроме того, часто происходит ложная идентификация некоторых близкородственных неферментирующих грамотрицательных микроорганизмов (НФМО) биохимическими тестами или анализаторами из-за схожести фенотипических свойств. Была определена точность идентификации НФМО для четырех различных коммерческих тест систем, которая составляла 57-80%, а точность идентификации бактерий комплекса Burkholderia cepacia (Всс) 43-86% [4]. Сравнение результатов идентификации НФМО с помощью тест системы API 20NE 88 с результатами секвенирования 16S rDNA, показали, что точность идентификации НФМО с помощью биохимических тестов составляла 17% [5].

В связи с этим возникает необходимость применения различных методов как классических бактериологических, так и новых молекулярно-биологических и молекулярно-генетических методов идентификации микроорганизмов, позволяющих рационально и максимально достоверно провести диагностику смешанной хронической инфекции легких.

Цель данной работы: обосновать применение комплексного подхода с использованием современных методов идентификации микроорганизмов для микро биологической диагностики хронической инфекции легких у больных муковисцидозом и продемонстрировать его эффективность.



Материал и методы

В работе с больными соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (Сеул, 2008). Все участники /законные их представители добровольно подписывали информированное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования утвержден этическим комитетом ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи», Минздрава России.

За период с 2008 по 2018 было исследовано 2300 мазков из зева и образцов мокроты от больных МВ. Материалом исследования также были штаммы S. aureus, P. aeruginosa, Bcc и Achromobacter spp. из со-бранной в лаборатории коллекции, которые были вы-делены от больных МВ в период с 2006 по 2018 гг. Культуральный метод идентификации включал посев материала на универсальные питательные среды - 5% кровяной агар и шоколадный агар, селективные среды - желточно-солевой агар (ЖСА), среду Эндо и среду Сабуро, цетримидный агар и BCSA (Burkholderia cepacia селективный агар).Посевы инкубировали при 35-37°С в течение 24-48 часов. Для выявления медленнорастущих микроорганизмов (некоторых НФМО) инкубацию увеличивали при комнатной температуре до 5-7 суток. После выделения чистой культуры дальнейшую идентификацию выде-ленной культуры проводили с использованием стандартных схем идентификации и различных биохимических тест-систем (Entero 24 “Lachema”, API 20NE “BioMerieux”, Staphylotest 16 “Lachema”, BioMerieux API Staph и др.) согласно инструкции производите-ля, а также c помощью МАЛДИ масс-спектрометрии (технология MALDI-BIOTYPERtm) (MALDI - matrix-assisted laser desorption ionization или метод «матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации») и молекулярно-генетическими методами. Пробоподготовку и масс-спектрометрический анализ проводили как описано в статье М.Ю. Чернуха и соавт. [6].

Для выделения ДНК из культуры и из клинического материала использовали набор «ДНК-сорб-А» или «ДНК-сорб-В» (Амплисенс). Для идентификации бактерий с помощью ПЦР использовали праймеры BCR1-BCR2 - для Всс, Burkf (f)-CeMuVi-16-2 - универсальный для Всс, Achromobacter spp. иS. maltophilia, SM1-SM4 - S. maltophilia, AX-F1 - AX-B1 - Achromobacter spp., PA-SS-F-PA-SS-R - P. aeruginosa иclfA-clfA1 - S. aureus. Результаты ПЦР регистрировали с помощью электрофореза в 1,5%-2% агарозном геле, приготовленном на 1-кратном трис-ацетатном (1хТАе) буфере. Мультилокусное секвенирование P. aeruginosa проводили пo методике B. Currran et al. [7]. Для проведения MLST Bcc использовали модифицированную схему T. Spilker et al. [8]. Секвенирование 16S rDNA проводили как описано в статье О.Л. Воронина и др. [9]. Полногеномное секвенирование (WGS) S. aureus, Всс, P. aeruginosa, Achromobacter spp. проводили на плат-форме Ion PGM Torrent с наборами Ion Sequencing Kit и чипами 316v1 (Life Technologies Thermo Fisher, США) по протоколу производителя.

Результаты и обсуждение

Для установления диагноза хронической инфекции обязательным является неоднократное в течение 6 месяцев обнаружение патогена в биологическом материале из дыхательных путей. При этом «золотым стандартом» является культуральный метод - посев на питательные среды, выделение чистой культуры и дальнейшая идентификация.

Для выделения чистой культуры из биологического материала, кроме приведенных в приказе сред, мы использовали специальные селективные среды для выделения Всс и P aeruginosa - BCSA и цетримидный агар. BSCA применяли для выделения и учета бактерий Всс, так как на 5% кровяном агаре при низких концентрациях Всс в материале и наличии ассоциаций из различных видов микроорганизмов бактерии Всс невозможно выделить. В 35% случаев бактерии Всс нами были выявлены только на среде BSCA: на среде Эндо и кровяном агаре даже после длительной инкубации бактерии Всс не вырастали. Исследование, проведенное в США, показало, что 14 из 15 (95%) лабораторий, которые использовали BSCA, выделяли Bcc из образцов мокроты, в то время как из 100 лабораторий, которые не использовали в своей работе селективную среду, только 22 (22%) выделяли бактерии Bcc (р <0,0001) [10].

Эти данные показывают необходимость использования BSCA при исследовании биоматериала от больных МВ. Кроме того, на BSCA мы выделяли также Burkholderia gladioli, S. maltophilia, Serratia marcescensи Achromobacter spp., устойчивые к колистину. После выделения чистой культуры проводили исследование микроорганизмов с использованием фенотипических методов по принятым схемам, в основе которых лежат бактериоскопическое и биохимическое исследование с использованием различных сред, тест-систем и бактериологических анализаторов. Применение только классических фенотипических методов (бактериоскопических и бактериологических) позволяют легче всего нам удалось идентифицировать грамположительные кокки, Enterobacteriaceae, некоторые НФМО, такие как P. aeruginosa, S. maltophilia и Acinetobacter spp., за исключением атипичных по фенотипу бактерий. Например, в наших исследованиях 2 штамма атипичной P. aeruginosa, 5 штаммов S. maltophilia и 13 штаммов A. ruhlandii были неправильно идентифицированы как Всс. 6 штаммов атипичной P. aeruginosa, 11 штаммов A. ruhlandii, 3 штамма A. piechaudii и13 штаммов Bcc биохимическими тестами были неправильно идентифицированы как другие НФМО. Около 3,4% штаммов не удалось идентифицировать биохимическими тестами. Аналогичная ситуация была описана и зарубежными исследователями, в частности с касающаяся дифференциации бактерий P. aeruginosa с A. xylosoxidans или S. maltophilia [11], S. aureus и S. pneumoniae [12], Bсс и Alcaligenes spp., Ralstonia pickettii, Stenotrophomonas и Pandoraea [13]. Ложная идентификация может иметь нежелательные последствия, ведущие к выбору неправильной терапии и неправильной тактики профилактики. В связи с этим для окончательной точной идентификации нами были использованы MALDI-BIOTYPER^tm и молекулярно-генетические методы.

Идентификация при помощи масс-спектрометрии (MALDI-BIOTYPER^tm) C помощью MALDI-BIOTYPER^tm были проанализированы культуры, выделенные из биологического материала от 250 пациентов с МВ [7]. В результате удалось идентифицировать 50 видов НФМО и установить, что наиболее трудно идентифицировать фенотипическими методами бактерии, принадлежащие к роду Achromobacter, Bcc и некоторые редко встречающиеся НФМО.

С помощью MALDI-BIOTYPER^tm изоляты Achromobacter spp., выделенные от российских больных МВ, были отнесены к A. ruhlandii, A. xylosoxidans, А. insolitus, A. piechaudii, A. insuavis, A. spanius, среди которых 76% принадлежали к виду A. ruhlandii и 7,2% к виду A. xylosoxidans.

Надо отметить, что первоначально у 23 пациентов бактериологическими методами A. ruhlandii был идентифицирован как НФМО, у 8 - как бактерии Bcc, у 2 - как Acinetobacter lwoffii, у 1 - как Acinetobacter haemolyticus.

В 2-х случаях MALDI-BIOTYPER^TM ошибочно идентифицировал штаммы как A. ruhlandii, которые в дальнейшем были определены с помощью полногеномного секвенирования как A. xylosoxidans.

Среди НФМО наиболее значимыми для больных МВ, представляющими трудность для идентификации классическими методами, являются виды микроорганизмов, входящие в Burkholderia cepacia complex.

С помощью MALDI-BIOTYPER™ были идентифицированы Bcc 4 видов: B. cenocepacia, B. cepacia, А. contaminans и B. multivorans. Из них 83,3% принадлежали к виду B. cenocepacia. Кроме того, от 3 детей нами была выделена культура, которая была идентифицирована c помощью МАЛДИ масс-спектрометрии как Burkholderia gladioli, не входящая в Всс.

После внесения в локальную библиотеку MALDI- BIOTYPER™ вида B. contaminans 3 штамма Brc, которые WGS определил как B. cepacia, MALDI- BIOTYPER^TM ошибочно идентифицировал как B. contaminans.

С помощью МАЛДИ масс-спектрометрии выделенные от российских больных МВ бактерии рода Pseudomonas были отнесены к 11 видам. Из них 72% принадлежали к P. aeruginosa, среди которых было 12 с атипичным фенотипом, 2 из которых бактериологическим методом были идентифицированы как Всс, 3 - Pseudomonas montelii, 1 - Pseudomonas mendocina, 6 - как НФМО. 29 изолятов, идентифицированных бактериологическим методом как P. aeruginosa были также идентифицированы в MALDI-BIOTYPER^TM как P. aeruginosa.

Таким образом, наименьшее количество ложной идентификации при использовании классических бактериологических методов среди доминирующих бактерий наблюдали при определении бактерий P. aeruginosa.

Кроме того, некоторые бактерии первоначально идентифицированные нами как НФМО с помощью MALDI-BIOTYPER™ были идентифицированы как Acinetobacter baumanii, Acinetobacter junii, Acinetobacter ursingii, Acinetobacter haemolyticus, Rothia mucilaginosa, Delftia acidovorans, Leclercia adecarboxylata, Elizabethkingia miricola, Ochrobactrum anthropi, Kocuria kristinae, Comomonas testosteroni, Corynebacterium falsenii, Moraxella catarrhalis, Eikinella corrodens, Chryseobacterium indologenes, Arthrobacter aurescens, Aeromonas caviae, Brevundimonas diminuta, Sphingomonas paucimobilis, S. maltophilia, Pseudomonas poae, Pseudomonas koreensis, Pseudomonas talaasi, B. gladioli, Wautersiella falsenii, Trichosporon mycotoxinivorans. При этом этиологическое значение этих микроорганизмов в настоящее время не ясно.

Использование MALDI-BIOTYPER™ позволило выявить разнообразие микроорганизмов, колонизирующих дыхательные пути больных МВ, что невозможно сделать только классическими методами. Основными возбудителями, являющимися представителями НФМО и имеющими клиническое и эпидемиологическое значение для больных МВ, требующими подтверждения идентификации более точными методами, были представители рода Achromobacter и Всс. При этом MALDI-BIOTYPER™ позволяет определить бактерии Всс до рода, а также некоторые виды Всс (В. cenocepacia и В. multivorans), но, как показали наши исследования, допускает ошибки при идентификации В. contaminans: 3 штамма В. cepacia прибором MALDI-BIOTYPER™ были идентифицированы как В. contaminans. Достоверная идентификация бактерий рода Achromobacter до вида с помощью MALDI-BIOTYPER™, несмотря на наличие в его базе 6905 видов микроорганизмов (MALDI biotyper compass explorer версия 4.1 build 30) также затруднена. В нашем исследовании несколько штаммов A. ruhlandii были ошибочно идентифицированы как A. xylosoxidans. В таких случаях возникает необходимость идентификации молекулярно-генетическими методами (MLST, амплификацией и секвенированием специфических генов).

В результате исследования с помощью MALDI- BIOTYPER™ нами было идентифицировано 90 видов бактерий, которые были выделены из зева и мокроты больных муковисцидозом.

микробиологический этиологический инфекция легкий муковисцидоз

Молекулярно-генетические методы исследования на этапе идентификации

Полимеразная цепная реакция

В связи с тем, что наиболее трудной с помощью классических бактериологических методов является идентификация бактерий Achromobacter spp. и Вгс, в случае отсутствия в лаборатории прибора MALDI-BIOTYPER^TM, для идентификации этих микроорганизмов необходимо применять молекулярно-генетические методы.

Наибoлее прoстым и дешевым являeтся ПЦР (или реал-тайм ПЦР) с использованием праймеров, комплементарных специфическим последовательностям ДНК возбудителей, то есть амплификация специфических для данного микроорганизма генов.

В связи с тем, что наиболее часто встречающимися у больных МВ и клинически наиболее значимыми микроорганизмами являются S. aureus,

P aeruginosa, Bcc, Achromobacter spp., S. maltophilia, нами предложено для идентификации атипичных форм этих микроорганизмов использовать ПЦР с праймерами, с уже известной чувствительностью и специфичностью [14, 15, 16, 17, 18]. При этом, при дифференциации Всс, Achromobacter spp., S.maltophilia можно применить мультиплекс ПЦР (триплекс), то есть ПЦР в одной пробирке.

Чем больше праймеров в мультиплексной ПЦР, тем чувствительность и специфичность данного метода более низкая. Для этого нами предложена система в виде ПЦР-панели, где возможно проведение ПЦР одновременно в 3 пробирках при одинаковых условиях амплификации в виде схемы: 1-ая пробирка (триплекс) с праймерами Burkf (f)-CeMuVi-16-2, AX-F1 - AX-B1 и SM1-SM2 для идентификации бактерий Всс, Achromobacter spp. и S. maltophilia; 2-я (дуплекс) - PA-SS-F-PA-SS-R и ClfA- ClfA1 для идентификации P aeruginosa и S. aureus; 3-я - BCR1-BCR2 - для подтверждения принадлежности культуры к Всс (рис. 1).

Рисунок 1. Электрофоретическая картина мультиплексной ПЦР со смесью равных концентраций ДНК Всс, Achromobacter spp., P. aeruginosa, S. aureus и S. maltophilia

1-2 ряды (1) - 3 полосы соответствуют амплифицированным участкам ДНК Achromobacter spp. - 163 п.н., Всс, Achromobacter spp. и S. maltophila - 320 п.н., S. maltophilia - 531 п.н.; 3-4 ряды (2) - 2 полосы соответствуют участкам ДНК P aeruginosa - 956 п.н. и S. aureus - 638 п.н.; 5 ряд (М) - маркер молекулярного веса; 6 ряд (3) - полоса соответствует ДНК Всс - 1040 п.н.

Figure 1. Electrophoretic picture of multiplex PCR with a mixture of equal concentrations of Bcc DNA, Achromobacter spp., P aeruginosa, S. aureus and S. maltophilia

1-2 rows (1) - 3 bands correspond to amplified DNA areas of Achromobacter spp. - 163 bp, Bcc, Achromobacter spp. and S. maltophila - 320 bp, S. maltophilia - 531 bp; 3-4 rows (2) - 2 bands correspond to P. aeruginosa DNA sections - 956 bp. and S. aureus - 638 bp; 5 row (M) - molecular weight marker; 6 row (3) - the band corresponds to DNA of Bcc - 1040 bp.

Мультиплекс (дуплекс, триплекс) ПЦР в виде панели с теми же праймерами можно использовать в качестве экспресс диагностической тест-системы на первом этапе микробиологического исследования одновременно с посевом, что обеспечит одновременную экспресс-диагностику инфекций, вызванных S. aureus, P aeruginosa, Всс, Achromobacter spp., S. maltophilia у больных МВ с помощью детекции геномной ДНК указанных возбудителей в тотальной ДНК, полученной непосредственно из биологического материала больного (рис. 2).

Рисунок 2. Электрофоретическая картина мультиплексной ПЦР с тотальной ДНК, полученной из мокроты. Figure 2. Electrophoretic picture of multiplex PCR with total DNA taken from sputum

1 - полоса соответствует амплифицированному участку ДНК S. aureus, то есть показывает наличие в мокроте S. aureus; 2 и 8 - в мокроте отсутствуют искомые ДНК; 3, 4, 6 - наличие в мокроте ДНК P aeruginosa; 5, 10, 11 - присутствие в мокроте одновременно S. aureus и P. aeruginosa; 9 - наличие в мокроте S. maltophilia; 7 и 12 - маркер молекулярного веса.

1 - the band corresponds to amplified area ofS. aureus DNA, i.e., it indicates the presence ofS. aureus in sputum; 2 and 8 - there is no desired DNA in sputum; 3, 4, 6 - there is P. aeruginosa in sputum; 5, 10, 11 - there are S. aureus and P aeruginosa simultaneously in sputum; 9 - there is S. maltophilia in sputum; 7 and 12 - molecular weight marker.

Наличие полoс oпределенной массы указывает на присутствие возбудителя в биологическом материале.

Диагностическая чувствительность при содержа-нии в биологическом материале достаточного количества копий искомой ДНК для S. aureus, P. aeruginosa, Achromobacter spp., бактерий Всс и S. maltophilia - 90-99,9% в зависимости от вида возбудителя.

Невысокая аналитическая чувствительность указывает на то, что данный метод должен быть скрининговым и результаты необходимо подтверждать культуральным методом.

Секвенирование специфических генов и MLST для идентификации бактерий Всс и Achromobacter spp

При наличии секвенатора вид возбудителя ХИЛ можно определить с помощью амплификации и секвенирования фрагмента гена 16S рибосомальной РНК (16S rDNA) или других специфических генов. Этот метод также можно использовать для идентификации ДНК микроорганизмов, непосредственно полученной из биологического материала. В связи с тем, что как классическими бактериологическими методами, так и с использованием MALDI-BIOTYPERTM и ПЦР, идентификация некоторых возбудителей, имеющих клиническое значение для больных МВ, например, Всс и Achromobacter spp., достоверно возможна только до рода, для окончательной видовой идентификации можно применить секвенирование 16S rDNA или других специфических участков ДНК, а также MLST. Надо отметить, что секвенирование 16S rDNA некоторых микроорганизмов, в частности бактерий рода Achromobacter, не позволяет их дифференцировать до вида, так как данный участок у разных видов Achromobacter spp. имеет 99% идентичность [19, 21]. Об этом свидетельствуют также результаты нашего исследования (совместно с лабораторией анализа геномов ФГБУ НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи) мокроты c использованием секвенирования 16S rDNAтотальной ДНК, при котором во всех случаях был поставлен диагноз A. xylosoxidans. Дальнейшее исследование выделенных изолятов в сотрудничестве с коллегами из ФГБУ «НМИЦАГиП им. В.И. Кулакова» показало, что часть изолятов, идентифицированных первоначально путем секвенирования 16S rDNAкак A. xylosoxidans, с помощью MALDI-BIOTYPERTM были идентифицированы как A. ruhlandii. В связи с этим были секвенированы полные геномы 3 представителей из этих штаммов. Результаты секвенирования полного генома этих штаммов показали, что они относились к A. ruhlandii. В связи с тем, что16SrDNA секвенирование не позволяет различать виды бактерий рода Achromobacter, то при необходимости для дифференциации до вида нужно в алгоритм идентификации включить амплификацию и секвенирование других генов, предложенных различными авторами - nrdA765[19], gltB [21], blaOXA [20]. Последний позволяет дифференцировать некоторые виды бактерий рода Achromobacter, в том числе наиболее распространенные в России, а также дифференцировать Bсс от Achromobacter spp.

При отсутствии возможности секвенировать можно проводить рестрикцию амплифицированного участка гена blaOXA с помощью рестриктазы ApaI, что также может дифференцировать blaOXA-258, и blaOXA-114, то есть A. xylosoxidans от A. ruhlandii [20].

Таким образом, достоверно дифференцировать виды Achromobacter можно амплификацией и секвениро- ванием генов nrdA, gltB и схеме MLST, предложенной Spilker [22].

При дифференциации бактерий Всс как и Achromobacter spp. секвенирование 16S rDNA также не позволяет полностью различать виды, входящие в комплекс Всс, из-за большого сходства данного гена у разных видов (98 до 99%) [23]. Амплификация recA гена является высокоспецифичным методом при идентификации Всс. Предложенный метод ПДРФ данного гена с использованием рестриктазы HaeIII [24], который способен определить первые пять геномоваров (B. cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia IIIA, B. cenocepacia IIIB, Burkholderia stabilis и Burkholderia vietnamiensis), также имеет ограничения в связи с появлением новых видов, которые невозможно дифференцировать с помощью этого метода [25]. Максимально достоверно дифференцировать виды бактерий Всс может амплификация и секвенирование recA гена и MLST по 7 генам домашнего хозяйства [26] С помощью MLST (совместно с лабораторией анализа геномов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи») нами было выявлено, что среди российских больных МВ встречаются 5 видов Всс: B. cenocepacia, B. multivorans, B. cepacia, B. contaminans и B. vietnamensis.

MLST позволяет не только определить вид возбудителя, но и определить сиквенс-типы, что имеет огромное значение при проведении эпидемиологических исследований. Так, в результате MLST штаммов P aeruginosa нам удалось установить, что среди больных МВ циркулирует международный эпидемический клон - ST235, который был причиной госпитальных инфекций в медицинских учреждениях различных стран, в том числе и в России [27]. MLST позволило генотипы В. cenocepacia ST709 и ST208, A. ruhlandii ST36 и S. aureus ST8 признать эпидемически значимыми в отношении больных МВ в России и показать их высокую трансмиссивную способность.

Для дифференциации различных видов Всс в алгоритм исследования можно также включить предложенное Tabacchioni et al. однолокусное секвенирование: амплификация и дальнейшее секвенирование gyrB фрагмента ДНК размером 1900 п.н. [28], hisA (биосинтез гистидина) фрагмента ДНК гена размером 442 п.н. [29], fur гена, кодирующего белок регулирующий захват железа [23]. Несмотря на высокую достоверность и скорость определения патогенов с помощью одно- или мультилокусного секвенирования, данная методика доступна не всем лабораториям, что ограничивает ее широкое применение в РФ.

Использование (при возможности) на начальном этапе микробиологического исследования мокроты методов молекулярной диагностики, позволяющих определить возбудителей непосредственно в биологическом материале, позволит быстро начать этиотропную терапию, а также проводить адекватные противоэпидемические мероприятия.

Результаты проведенного нами исследования подтвердили необходимость использования комплексного подхода, то есть применения как классических микробиологических, так и молекулярно-генетических методов при диагностике инфекции у больных МВ. Так, исследование мокроты 34 больных МВ детей классическим микробиологическим методом и молекулярно-генетическим методом - секвенированием 16S rDNA тотальной ДНК, полученной непосредственно из мокроты (совместно с лабораторией анализа геномов ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) показало, что молекулярно-генетическим методом в основном были идентифицированы микроорганизмы, которые преобладали в пробе мокроты и концентрация которых составляла 10³ КОЕ/мл и выше, в то время как классическим микробиологическим методом с использованием селективных сред выявляли также микроорганизмы в концентрации 10 КОЕ/мл и менее. С другой стороны, в некоторых пробах мокроты молекулярно-генетическим методом выявлены анаэробные микроорганизмы, например, Prevotella spp., которые были идентифицированы также другими авторами как постоянные члены сообщества нижних дыхательных путей у людей с МВ всех возрастов и стадий заболевания [30]. Есть предположение о провоспалительном действии анаэробов, что подтверждается резким увеличением их концентрации в период обострения. Точно определить клиническое значение этих бактерий на сегодня не представляется возможным [30]. В ряде случаев в пробах мокроты молекулярно-генетическим методом выявлены также некоторые аэробные микроорганизмы (Achromobacter spp., P. aeruginosa, Staphylococcus spp.), которые не были выявлены нами классическим методом. Кроме того, некоторые НФМО были ложно-идентифицированы биохимическими тестами (Всс, Moraxella lacunata), что также было обнаружено молекулярно-генетическим методом. В свою очередь, культуральный метод обеспечивает количественное определение наличия возбудителей, что дает возможность судить более точно об этиологической значимости выделенных микроорганизмов, оценить динамику микрофлоры и эффективность проводимой антибиотикотерапии.

Кроме того, позволяет выделять чистую культуру, оценивать чувствительность к антибиотикам, изучать различные биологические свойства, а также их изменчивость в процессе персистенции в легких больного МВ. Это важно с практической точки зрения, так как для правильного подбора антибиотиков при лечении обострения, важно понять, обусловлена ли ХИЛ циркуляцией в организме одного генотипа или меняющимися генотипами, что можно определить с помощью генотипирования выделенных в динамике изолятов возбудителей различными методами: RAPD-PCR, типированием гена, обеспечивающего синтез коагулазы у S. aureus, MLST, spa типированием. Последние позволяют определить распространенность эпидемически значимых клонов возбудителей среди больных МВ в России.

Также культуральный метод позволяет учитывать все морфотипы бактерий при проявлении возбудителем фенотипической гетерогенности на твердой питательной среде, когда разные колонии одного и того же вида (или одного генотипа) могут иметь разную морфологию (например, мукоидный и немукоидные фенотипы) или обуславливать разную чувствительность к антибиотикам, что имеет важное значение при выборе антибиотикотерапии.

Таким образом, с помощью комплексного подхода при диагностике ХИЛ, нами было показано, что у больных МВ ХИЛ является динамическим процессом, который обусловлен меняющимися генотипами или длительной персистенцией одного генотипа с высокой степенью фенотипической и генотипической изменчивости, что доказано с помощью входящих в алгоритм микробиологической диагностики различных методов.



Заключение

Для проведения достоверной этиологической диагностики необходимо применить комплексный подход и включить в алгоритм микробиологического исследования биоматериала из дыхательных путей больного МВ не только классические бактериологические методы, но и современные молекулярно-генетические методы, а также методы идентификации микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии.

При этом культуральный метод («золотой стандарт» диагностики, позволяющий точно установить факт наличия возбудителя в материале) и метод ПЦР, предназначенные для рутинной идентификации, обеспечивают идентификацию бактерий с достоверностью 40-99% в зависимости от возбудителя (табл.).

Таблица / Table

Точность идентификации микроорганизмов при использовании различных методов / Accuracy of microorganisms' identification by means of various methods

Методы идентификации	Микро-биологический	Молекулярно-генетический - ПЦР со специфическими праймерами	MALDI-BIOTYPER™	MLST	Секвенирование 16SrDNA, 23SrDNA и др.	WGS
Микроорганизм
S. aureus	70-80%	90-99%	99,9%
P. aeruginosa	80-90%	90-99%	99,9%		Окончательная идентификация
B.cepacia complex	43-86%	90-99%	95-99%
Achromobacter spp.	57-80%	90-99%	95-99%
S. maltophilia	90-99%	90-99%	99,9%
Другие НФМО	57-80%	90-99%	90-95%

Примечание: максимум и минимум точности идентификации согласно данным различных авторов, включая результаты представленного исследования.

Note: maximum and minimum accuracy of identification according to data from various authors, including the results of the presented research.

Применение на последующих этапах дополнительных методов - MALDI-BIOTYPER™, амплификации и секвенирования специфических генов, 16S rDNA секвенирования, MLST и секвенирования полного генома (WGS) позволяет идентифицировать возбудителей с максимальной достоверностью.



Литература/ References

1. Шагинян И.А., Капранов Н.И., Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Семыкин С.Ю., Аветисян Л.Р., Каширская Н.Ю., Пивкина Н.В., Данилина Г.А., Батов А.Б., Бусуек Г.П. Микробный пейзаж нижних дыхательных путей у различных возрастных групп детей, больных муковисцидоз. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010;(1):15-20. [Shaginyan I.A., Kapranov N.I., Chernukha M.Yu., Alexeeva G.V., Semikin S.Yu., Avetisyan L.R., Kashirskaya N.Yu., Pivkina N.V., Danilina G.A., Batov AB, Busuek G.P. Microbial landscape of the lower respiratory tract in different age groups of children suffering from cystic fibrosis. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2010;(1):15-20. (In Russian)]

2. Сиянова Е.А., Чернуха М.Ю., Аветисян Л.Р., Шагинян И.А., Прилипов А.Г., Усачев Е.в., Кондратьева Е.И., Припутневич Т.В., Гордеев А.Б., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И., Ильенкова Н.А., Красовский С.А., Шерман В.Д., Воронкова А.Ю., Амелина Е.Л., Усачева М.В. Мониторинг хронической инфекции легких у больных муковисцидозом, вызванной бактериями Pseudomonas аeruginosa. Педиатрия. 2018; 97 (2): 77-86. [Siyanova E.A., Chernuha M.Yu., Avetisyan L.R., Shaginyan I.A., Prilipov A.G., Usachev E.V., Kondrateva E.I., Priputnevich T.V., Gordeev A.B., Kashirskaya N.Yu., Kapranov N.I., Ilenkova N.A., Krasovskiy S.A., Sherman V.D., Voronkova A.Yu., Amelina E.L., Usacheva M.V. Monitoring of chronic lung infection in patients with cystic fibrosis caused by Pseudomonas аeruginosa. Pediatria. 2018; 97 (2): 77-86. (In Russian)]

3. Kahl B.., Herrmann M, Everding A.S., Koch H.G., Becker K., Harms E., Proctor R.A., Peters G. Persistent infection with small colony variant strains of Staphylococcus aureus in patients with cystic fibrosis. The Journal of Infectious Diseases. 1998;177(4):1023-9.

4. Kiska D.L., Kerr A., Jones M.C., Caracciolo J.A., Eskridge B., Jordan M., Miller S., Hughes D., King N., Gilligan P.H. Accuracy of four commercial systems for identification of Burkholderia cepacia and other Gramnegative non-fermenting bacilli recovered from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 1996; (34): 886-891.

5. Wellinghausen N., Kothe J., Wirths B., Sigge A., Poppert S. Superiority of molecular techniques for identification of Gram-negative, oxidase-positive rods, including morphologically nontypical Pseudomonas aeruginosa, from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 2005;43(8):4070-5.

6. Чернуха М.Ю., Шагинян И.А, Жуховицкий В.Г., Аветисян Л.Р., Кулястова Д.Г., Сиянова Е.А., Медведева О.С., Поляков Н.Б., Соловьев А.И., Грумов Д.А., Кондратьева Е.И., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И., Шерман В.Д., Воронкова А.Ю., Никонова В.С., Амелина Е.Л., Красовский С.А., Усачева М.В. Применение системы MALDI Biotyper и алгоритма микробиологической диагностики для идентификации неферментирующих микроорганизмов, выделенных из дыхательных путей у больных муковисцидозом. Клиническая микробиология и антимикробная xимиотерапия. 2017;19(4):327- 334. [Chernuha M.Yu., Shaginyan I.A., Zhikhovitsky V.G., Avetisyan L.R., Kuliastova D.G., Siyanova E.A., Medvedeva O.S., Poliakov N.B., Soloviev A.I., Grumov D.A., Kondrateva E.I., Kashirskaya N.Yu., Kapranov N.I., Sherman V.D., Voronkova A.Yu., Nikonova V.S., Amelina E.L., Krasovskiy S.A., Usacheva M.V. Use of the MALDI Biotyper system and the microbiological diagnosis algorithm for identification of nonfermenting bacteria isolated from respiratory tract in cystic fibrosis patients. Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. 2017;19(4):327-334. (In Russian)]

7. Curran B., Jonas D., Grundmann H., Pitt T., Dowson C.G. Development of a multilocus sequence typing scheme for the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa. Journal of Clinical Microbiology.

8. Zueter A.R., Rahman Z.A., Abumarzouq M., Harun A. Expanded Multilocus Sequence Typing for Burkholderia Species. BMC Infectious Diseases. 2018;

9. Воронина О.Л., Кунда М.С., Аксенова Е.И., Орлова А.А., Чернуха М.Ю., Лунин В.Г., Амелина Е.Л., Чучалин А.Г., Гинцбург А.Л. Экспресс-диагностика микроорганизмов, поражающих дыхательные пути больных муковисцидозом. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; (11): 53-57. [Voronina O.L., Kunda M.S., Aksenova E.I., Orlova A.A., Tchernukha M.Yu., Lunin V.G., Amelina E.L., Tchutchalin A.G., Ginzburg A.L. The express diagnostic of microorganisms affecting respiratory tract of patients with mucoviscidosis. Russian Clinical Laboratory Diagnostics. 2013; (11): 53-57.

10. Tablan O.C., Carson L.A., Cusick L.B., Bland L.A., Martone W.J., Jarvis W.R. Laboratory proficiency test results on use of selective media for isolating Pseudomonas cepacia from simulated sputum specimens of patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 1987; 25(3):485-7.

11. Kidd T.J., Ramsay K.A., Hu H., Bye PTP, Elkins M.R., Grimwood K., Harbour C., Marks G.B., Nissen M.D., Robinson P.J., Rose B.R., Sloots T.P., Wainwright C.E., Bell S.C., A.C. Pin C.F. Investigators 2009. Low rates of Pseudomonas aeruginosa misidentification in isolates from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 2009; 47(5):1503-9.

12. Bittar F., Richet H., Dubus J.C., Reynaud-Gaubert M., Stremler N., Sarles J., Raoult D., Rolain J.M. Molecular detection of multiple emerging pathogens in sputa from cystic fibrosis patients. PLoS One. 2008; 3(8):e2908.

13. Miller M.B., Gilligan P.H. Laboratory aspects of management of chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 2003;41(9):4009-15.

14. Ramette A., LiPuma J.J., Tiedje J.M. Species abundance and diversity of Burkholderia cepacia complex in the environment. Applied and Environmental Microbiology. 2005;71(3):1193-201

15. Spilker T., Coenye T., Vandamme P., LiPuma J.J. PCR-based assay for differentiation of Pseudomonas aeruginosa from other Pseudomonas species recovered from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 2004;42(5):2074-9.

16. Whitby P.W., Carter K.B., Burns J.L., Royall J.A., LiPuma J.J., Stull T.L. Identification and detection of Stenotrophomonas maltophilia by rRNA-directed PCR. Journal of Clinical Microbiology. 2000;38(12):4305-9.

17. Liu L., Coenye T., Burns J.L., Whitby P.W., Stull T.L., LiPuma J.J. Ribosomal DNA-directed PCR for identification of Achromobacter (Alcaligenes) xylosoxidans recovered from sputum samples from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 2002;40(4):1210-3.

18. Mason W.J., Blevins J.S., Beenken K., Wibowo N., Ojha N., Smeltzer M.S. Multiplex PCR Protocol for the Diagnosis of Staphylococcal Infection. Journal of Clinical Microbiology. 2001;39(9):3332-8.

19. Spilker T., Vandamme P., Lipuma JJ. Identification and distribution of Achromobacter species in cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 2013; 12(3):298-301.

20. Papalia M., Almuzara M., Cejas D., Traglia G., Ramirez M.S., Galanternik L., Vay C., Gutkind G., Radice M. OXA-258 from Achromobacter ruhlandii: a Species- Specific Marker. Journal of Clinical Microbiology. 2013;51(5):1602-5.

21. Воронина О.Л., Кунда М.С., Рыжова Н.Н., Аксенова Е.И., Семенов А.Н., Лазарева А.В., Семыкин С.Ю., Амелина Е.Л., Симонова О.И., Красовский С.А., Лунин ВГ, Баранов А.А., Чучалин А.Г., Гинцбург А.Л. Разнообразие и опасность Achromobacter spp., поражающих дыхательные пути больных муковисцидозом. Пульмонология. 2015;25(4):389-402. [Voronina O.L., Kunda M.S., Ryzhova N.N., Aksenova E.I., Semenov A.N., Lazareva A.V., Semykin S.Y., Amelina E.L., Simonova O.I., Krasovskiy S.A., Lunin V.G., Baranov A.A., Chuchalin A.G., Gintsburg A.L. Diversity and hazard of respiratory infection of Achromobacter spp. in cystic fibrosis patients. Russian Pulmonology. 2015;25(4):389-402. (In Russian)]

22. Spilker T., Vandamme P., Lipuma J.J. A multilocus sequence typing scheme implies population structure and reveals several putative novel achromobacter species. Journal of Clinical Microbiology. 2012;50(9) :3010-5.

23. Lynch K.H., Dennis J.J. Development of a Species- Specific fur Gene-Based Method for Identification of the Burkholderia cepacia Complex. Journal of Clinical Microbiology. 2008;46(2):447-55.

24. Mahenthiralingam E., Bischof J., Byrne S.K., Radomski C., Davies J.E., Av-Gay Y., Vandamme P DNA-based diagnostic approaches for identification of Burkholderia cepacia complex, Burkholderia vietnamiensis, Burkhol- deria cepacia genomovars I and III. Journal of Clinical Microbiology. 2000;38(9):3165-73.

25. Moore J.E., Millar B.C., Xu J., Crowe M., Redmond A.O., Elborn JS.Misidentification of a genomovar of Burkholderia cepacia by recA restriction fragment length polymorphism. Journal of Clinical Pathology. 2002;55(4):309-11.

26. Cesarini S., Bevivino A., Tabacchioni S., Chiarini L., Dalmastri C. RecA gene sequence and Multilocus Sequence Typing for species-level resolution of Burkholderia cepacia complex isolates. Letters in Applied Microbiology. 2009;49(5):580-8.

27. Аветисян Л.Р., Воронина О.Л., Чернуха М.Ю., Кунда М.С., Габриелян Н.И., Лунин В.Г., Шагинян И.А. Персистенция штаммов Pseudomonas aeruginosa среди пациентов ФНЦ трасплантологии и искусственных органов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2012;(4):99-104. [Avetisyan L.R., Voronina O.L., Chernukha M.Yu., Kunda M.S., Gabrielyan N.I., Lunin V.G., Shaginyan I.A. Persistence of Pseudomonas aeruginosa strains in patients of Federal Scientific Center of Transplantology and Artificial Organs. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2012;(4):99-104.

28. Tabacchioni S., Ferri L., Manno G., Mentasti M., Cocchi P., Campana S., Ravenni N., Taccetti G., Dalmastri C., Chiarini L., Bevivino A., Fani R. Use of the gyrB Gene to Discriminate Among Species of the Burkholderia Cepacia Complex. FEMS. Microbiological Letters. 2008; 281(2):175-82.

29. Papaleo M.C., Perrin E., Maida I., Fondi M., Fani R., Vandamme P. Identification of species of the Burkholderia cepacia complex by sequence analysis of the hisA gene. Journal of Medical Microbiology. 2010;59(10):1163-70.

30. Sherrard L.J., Bell S.C., Tunney M.M. The role of anaerobic bacteria in the cystic fibrosis airway. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 2016;22(6):637-43.

Размещено на allbest.ru

...