Изучение влияния глутоксима на продукцию цитокинов семейства интерлейкин - 12 (IL-12, IL-23, IL-27, IL-35) в сперме и сыворотке мужчин больных на малосимптомные формы хронической урогенитальной инфекции

Размещено на http://allbest.ru

Изучение влияния глутоксима на продукцию цитокинов семейства интерлейкин - 12 (IL-12, IL-23, IL-27, IL-35) в сперме и сыворотке мужчин больных на малосимптомные формы хронической урогенитальной инфекции

Ципоренко Сергей Юрьевич

Ассистент кафедры семейной медицины и амбулаторно-поликлинической помощи Национальной медицинской академии последипломного образования имени П. Шупика

Summary

Key words: inflammation, male infertility, cytokines, seminal plasma, immunotherapy, glutoxim

Аннотация

цитокины семенной воспаление урогенитальный бесплодие

Целью исследования было определение концентраций цитокинов семейства IL-12: IL-12, IL-23, IL-27, IL-35 в сперме и сыворотке крови у мужчин, больных на малосимптомные формы хронической урогенитальной инфекции осложненной бесплодием. Установлено, что повышение уровня IL-12 и IL-27 в сыворотке крови во время воспаления в урогенитальном тракте сопровождается их достоверным снижением в сперме. Нарушение цитокиногенеза у мужчин с воспалительными процессами в половых органах приводит к хронизации заболевания и к возникновению осложнений. Снижение концентрации IL-12, IL-27, IL- 35 и повышение уровня IL-23 в сперме даёт начало развитию бесплодия. Применение иммунотерапии с использованием глутоксима приводит к нормализации изученных цитокинов.

Ключевые слова: воспаление, мужское бесплодие, цитокины, семенная плазма, иммунотерапия, глу- токсим

Постановка проблемы: Клинический опыт показывает, что в настоящее время преобладают латентные и персистирующие формы течения урогенитальных инфекций, что очень затрудняет их своевременную диагностику. В то же время, половые бактериально-вирусные инфекции часто остаются нераспознанными, поскольку имеют скудную клиническую симптоматику или вообще ее не имеют, поэтому пораженные мужчины не обращаются за медицинской помощью, тогда как патология прогрессирует и часто осложняется развитием инфертильности [1].

Анализ последних исследований и публикаций

Мужская сперма содержит не только сперматозоиды, но и популяции несперматозоидних клеток, преимущественно это лейкоциты [16]. Активация белых кровяных клеток в семенной плазме во время воспаления генитального тракта и клеточные реакции против микробных агентов могут провоцировать высвобождение ряда продуктов, таких как, цитокины (ЦК) и реактивные кислородные соединения (РКС) [9].

У мужчин с наличием хронических урогенитальных инфекций было зарегистрировано значительное увеличение концентрации ряда ЦК - интерлейкина (IL)-ip, IL-5, IL-6, IL-13, IL-15, IL-17, интерферона (INF) -а, моноцитарного хемотаксического фактора (МСР) и в меньшей степени - IL-2, IL-10, IL-12, IL-18, фактора некроза опухолей (TNF)-a, INF-y [10]. Повышенные уровни этих медиаторов воспаления указывают на привлечение иммунных факторов для защиты мужского генитального тракта. В норме в мужских гонадах ЦК действуют как иммуномодуляторы, тогда как избыточный рост их концентрации в сперме во время инфекции вызывает повреждение тканей и уменьшение качественных семиологических параметров.

В литературе отмечается, что влияние белых кровяных клеток на функцию спермы зависит от доминирования субтипов лейкоцитов, которые создают определенный цитокиновый профиль, и, следовательно, модулируют течение гаметообразова- ния [8].

Секреция ЦК является одним из первых сигналов врожденной защиты в борьбе с инфекцией. ЦК 26 представляют собой большую группу протеинов генерируемых как клетками иммунной системы так и клетками окружающих тканей в ответ на внешние стимулы, вызывающие повреждение. ЦК принимают участие в трансмиссии сигналов между клетками и выполняют регуляторную роль в различных биологических процессах, таких как, клеточная активация, пролиферация, рост, дифференциация и т.д. Они включают ЦК семейства IL-1, такие как IL- 18, семейство IL-6, надсемейство TNF и INF, семейство IL-2, провоспалительные хемокины (IL-8, МСР, фракталкин), семейство IL-12 и IL-15 [9]. Течение воспалительных реакций зависит от уровней продукции ЦК, также как и от присутствия ингибиторов ЦК и их специфических рецепторов и антагонистов. Характерной чертой провоспалительных ЦК является их плеотропность, т.е. действуют в разных направлениях. Если они встречаются вместе, они действуют синергически, аддитивно или антагонично на функцию клеток мишеней. Провос- палительные ЦК ускоряют развитие воспалительных реакций действуя в соответствии с причинным фактором: 1) пролиферация клеток (IL-1, IL-2, IL- 12, и IL-18), 2) хемоаттракция лейкоцитов к месту воспаления (IL-1 и IL-8; 3) активация или дифференцировка лейкоцитов (IL-1, IL-2, и IL-6) и 4) индукция апоптоза [9].

Провоспалительные ЦК обычно действуют локально, так как они выделяются местными активированными клетками. В мужских гонадах ЦК продуцируются физиологически и привлекаются к нормальному функционированию органа. В этом аспекте, они выступают в роли нормальных компонентов семенной плазмы. Участие некоторых ЦК в регуляции фертильности зависит от их концентрации. Например, уровень IL-12 коррелирует с количеством спермы и морфологией сперматоцитов [10]. Эти же ЦК, которые действуют как иммуномодуляторы в мужских гонадах, появляются в большой концентрации в сперме во время инфекции и когда повреждается ткань. В последнее время привлекает большое внимание IL-12, как уникальный ЦК с иммуномодулирующими свойствами и его возможным привлечением к некоторым физиологическим и патофизиологическим процессам [13]. Исследования показывают наличие этого ЦК в плазме спермы как фертильных так и инфертильних мужчин. Однако, в инфертильних мужчин уровни IL-12 в семенной плазме достоверно отличались (P <0,05) от уровня у фертильных мужчин. Также установлена достоверная корреляция между уровнем IL-12 и количеством спермы и процентом морфологически нормальных сперматозоидов спермы мужчин. Эти данные свидетельствуют о заангажированности IL-12 в оплодотворяющей способности спермы и его дискореляции могут приводить к бесплодию [6].

IL-12 является частью семейства интерлейкинов, которое включает, помимо собственно IL-12: IL-23, IL-27 и IL-35. Эти различные молекулы играют разную клеточную и функциональную роль в развитии Th1 ответа [5]. В настоящее время признана способность IL-23 стимулировать Т-клетки к производству IL-17 [2] и доказано доминирующую роль этого цитокина в аутоиммунном воспалении. В противоположность, IL-27 играет важную роль в ограничении интенсивности и продолжительности адаптивного иммунного ответа, причем, IL-27 действует локально, в то же время, когда INF-у проявляет свое действие на системном уровне [12]. IL-35 обладает иммуносупрессивным действием в отношении Th17 опосредованно через стимуляцию Treg клеток [14]. Под влиянием IL-35 CD4+ CD25+ Т- клетки продуцируют IL-10, а CD4+ CD25- Т-клетки вырабатывают INF-у. Кроме того, IL-35 ингибирует дифференцировку клеток Th17. Таким образом, IL- 35 является противовоспалительным цитокином, подавляя иммунный ответ [7,11].

Выделение нерешенных ранее частей общей проблемы

Сегодня является актуальным изучение применения иммуномодулирующей терапии мужчин с ма- лосимптомными урогенитальными воспалительными процессами осложненными бесплодием, учитывая, что данное направление является патогенетически обоснованным. Нами исследовалась эффективность использования иммуноактив- ного препарата глутоксим в лечении больных с хронической урогенитальной патологией.

Глутоксим - представитель нового класса медицинских препаратов - тиопоэтинов, обладающих иммуномодулирующим действием на процессы тиолового обмена, который играет важную роль в регуляции метаболических процессов в клетках и тканях. Глутоксим способствует реализации действия регуляторных молекул пептидной природы на нормальные (регуляция метаболических процессов) и трансформированные (индукция программированной клеточной гибели) клетки. К основным иммунофизиологическим свойствам препарата относятся: высокая тропность препарата к клеткам центральных органов иммунитета и системы лимфоидной ткани; усиление костномозгового кроветворения: процессов эритропоэза, лимфопоэза и гранулоцито-моноцитопоэза; активация системы фагоцитоза, в том числе в условиях иммунодефицитных состояний, восстановление в периферической крови уровня нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов и функциональной дееспособности тканевых макрофагов. Среди иммунобиохимических эффектов препарата следует выделить: стимулирующее действие препарата на каскадные механизмы фосфатной модификации ключевых белков сигнал-передающих систем; инициацию действия системы цитокинов, в том числе IL-1, IL-2, IL-6, TNF, INF, эритропоэтина. Показано положительное влияние глутоксима на фертильные показатели спермы [3]

Цель статьи

Целью работы было оценить уровни цитокинов семейства IL-12: IL-12, IL-23, IL-27, IL-35 в семенной плазме и сыворотке крови мужчин с малосимптомными формами хронического воспаления урогенитального тракта осложненного бесплодием и влияние на их концентрацию применения иммунотропного препарата глутоксим.

Материалы и методы исследования. Под нашим наблюдением находилось 56 больных мужчин на малосимптомные формы хронического воспаления урогенитального тракта (ХВУТ) в возрасте от 20 до 40 лет осложненного бесплодием. Все обследованные были разделены на две группы. При этом пациенты первой группы (29 человек) в составе комплексной терапии применяли глутоксим внутримышечно ежедневно в суточной дозе 30 мг (3% 1 мл) в течение 10 дней, затем еще в течение 5 недель 2 раза в неделю в суточной дозе 10 мг (1% 1 мл). Всего 25 инъекций на курс лечения (суммарно 400 мг). Пациенты второй группы (27 человек) проходили общепринятый курс терапии. Всех пациентов обследовали клинически, включая осмотр и пальпацию полового члена, мошонки и предстательной железы, а также тщательно собирали анамнез. Все пациенты сдавали сперму для анализа. Накануне сдачи анализа не должно было происходить эякуляции в течение 4-5 дней. Анализ спермы проводился через пол часа после эякуляции и согласно инструкции ВОЗ [15]. Учитывали концентрацию сперматозоидов, рН семенной жидкости, содержание лейкоцитов и их популяций (гранулоциты, макрофаги, лимфоциты). Для определения морфологии использовали окрашивание по Папа- николлау. В исследование не включались пациенты с лейкоспермией и патоспермией. Сперму перед анализом центрифугировали при 1700 оборотах в минуту с целью отделить сперматозоиды от семенной плазмы.

Концентрации цитокинов IL-12, IL-23, IL-27 и IL-35 в сыворотке крови и семенной плазме определяли иммуноферментным методом с помощью анализатора «STAT-FAX-303 PLUS» (США) при длине волны 492 нанометра, и тест системы Panomics Quantitative Assays компании “Affymetrix” (США).

Контрольные показатели концентраций всех вышеперечисленных цитокинов получены при исследования 24 фертильных мужчин без клинических признаков болезни, аналогичного состава по возрасту.

Статистический анализ проводили на персональном компьютере с помощью пакета программы «MedStat» [4]. При этом для проверки показателей на нормальное распределение использовали критерий /2. Вычисляли медиану, 25% квартиль, 75% квартиль, доверительные интервалы. Для сравнения показателей использовали критерий /2, двусторонняя критическая область. Для сравнения средних значений признака для двух независимых выборок использовали метод углового преобразования Фишера с учетом поправки Йейтса. Достоверным считали различие при р<0,01. Проводили количественную оценку эффекта иммунотерапии - вычисляли снижение абсолютного риска (САР), снижение относительного риска (ОР) и количество больных, которых необходимо лечить (ЧБНЛ).

Таблица 1.

Иммунологические показатели семенной плазмы мужчин больных ХВУТ (Ме ± m [95% доверительный интервал])

Примечание: достоверность различия показателей по сравнению с нормой Р: * - <0,05, ** - <0,01, ***

Изложение основного материала

Иммунологическое исследование свидетельствует (таблица 1), что в обследуемых пациентов с бесплодием наблюдается значительное снижение в семенной плазме концентрации IL-12 (9,4 ± 2,3 пг/мл, р <0,001), IL-27 (10,4 ± 1,3 пг/мл, р <0,001) и IL-35 (15,3 ± 3,4 пг/мл, р <0,001) на фоне достоверного повышения концентрации IL-23 (24,2 ± 2,4 пг/мл, р <0,01). Кратность различия для IL-12, IL- 23, IL-27, IL-35 соответственно составила - 1,4; 1,6; 1,7 и 3,6.

В сыворотке крови бесплодных мужчин (таблица 2) концентрации IL-12 и IL-27 резко увеличивались (средние значения составили соответственно 125,8 ± 13,7 пг/мл, р <0,001 и 89,4 ± 10,5 пг/мл, р<0,001, кратность различия - 4,3 и 3,5). Уровень IL-35 в сыворотке крови, напротив, значительно понижался (кратность различия - 2,4). Не отличался от нормативных показателей уровень в сыворотке крови IL-23, хотя и имел тенденцию к незначительному повышению.

Таблица 2.

Иммунологические показатели сыворотки крови мужчин больных ХВУТ (Ме ± m [95% доверительный интервал])

Примечание: достоверность различия показателей по сравнению с нормой Р: * - <0,05, ** - <0,01, *** <0,001.

Таким образом, установлено, что уровни изученных ЦК имеют противоположные тенденции к сдвигам в сперме и в сыворотке крови при ХВУТ. Так, уровень IL-12 в сперме снижается, а в сыворотке крови, наоборот, резко возрастает. Уровень IL- 23 в сперме повышается, а в сыворотке крови остается почти без изменений. Концентрация IL-27 в сперме резко уменьшается при развитии инферти- льности, а в сыворотке крови увеличивается. Только уровни IL-35 имеют одинаковые тенденции к уменьшению и в сперме и в сыворотке крови. С целью изучения влияния иммунокорекции на уровни ЦК семейства IL-12 в семенной плазме и сыворотке крови мужчин с ХВУТ, осложненного бесплодием, пациенты первой группы применяли в комплексе лечения глутоксим инъекционно. Вторая группа иммуноактивных препаратов в схеме терапии не использовала.

Изучение концентрации ЦК после проведенного лечения показало достоверное увеличение уровней IL-12, IL-27, IL-35 и достоверное снижение уровня IL-23 в семенной плазме у пациентов первой группы (таблица 3). В то же время, у пациентов второй группы отмечалась лишь тенденция к нормализации их уровней.

Таблица 3.

Влияние глутоксима на концентрацию цитокинов семейства IL-12 в семенной плазме мужчин больных ХВУТ (Ме ± m [95% доверительный интервал])

Примечание: достоверность различия показателей до и после лечения Р: * - <0,05, ** - <0,01, *** - <0,001; Р - достоверность различия между показателями групп.

Что касается концентраций ЦК в сыворотке крови после проведенного лечения, уровни IL-35 нормализовались у пациентов обеих групп (таблица 4). Количество IL-12 и IL-27 в сыворотке крови у мужчин первой группы достоверно понижалось до уровня контрольных значений. У части пациентов второй группы (6 человек - 22,2%) их концентрации в сыворотке крови имели тенденцию к восстановлению, а у остальных (22 человека - 77,8%) не претерпевали изменений и оставались на высоком уровне.

Таблица 4.

Влияние глутоксима на уровни цитокинов семейства IL-12 в сыворотке крови мужчин больных ХВУТ (Ме ± m [95% доверительный интервал])

Примечание: достоверность различия показателей Р: * - <0,05, ** - <0,01, *** - <0,001; Р -

Достаточно интересным оказался факт увеличения концентрации IL-23 в сыворотке крови у части пациентов, которые не получали иммунотерапию, не смотря на его исходный нормальный уровень. Это может указывать на постепенное развитие аутоиммунного процесса, несмотря на проводимое общепринятое лечение.

Проводя количественную оценку эффекта лечения глутоксимом у больных с ХВУТ, осложненного бесплодием, установлено, что предложенный метод снижает неэффективность лечения (САР) на 43,4% (интервальная оценка: 14,8 - 62,2%, р = 0,05) по сравнению с общепринятым методом. Новый метод лечения снижает риск неэффективности лечения (ОР) в 4,24 раза (интервальная оценка: 1,74 - 9,25 раза, р = 0,05) по сравнению с контрольным методом лечения, причем число больных, которых необходимо лечить (ЧБНЛ) составляет 2,2 человека (интервальная оценка: 1,4 - 6,4 человека, р = 0,05), то есть необходимо пролечить 2 - 3 человек, чтобы получить дополнительного вылеченного больного по сравнению со стандартным методом терапии.

Выводы и предложения

1. При развитии инфертильности в сперме резко уменьшаются концентрации IL-12, IL-27, IL- 35 и растет уровень IL-23.

2. Повышение уровня IL-12 и IL-27 в сыворотке крови во время воспаления в урогенитальном тракте сопровождается их достоверным снижением в сперме.

3. Нарушение цитокиногенеза у мужчин с воспалительными процессами в урогенитальном тракте сопровождается развитием инфертильности.

4. Новым направлением лечения бесплодия у мужчин может быть регуляция уровней интерлейкинов семейства IL-12.

5. Применение глутоксима, при проведении иммуннокорекции у мужчин с ХВУТ приводит к нормализации уровней цитокинов семейства IL-12 в семенной жидкости и в сыворотке крови.

Список литературы:

1. Быков В.Л. Сперматогенез у мужчин в конце ХХ века. Пробл репрод 2000; 1: 6-13.

2. Дранник Г.М., Порошина Т.В. Особенности локальной продукции интерлейкинов -6, -17, -23 и трансформирующего фактора роста - Р1 у больных с хроническим абактериальным простатитом, осложненного бесплодием // Імунологія та алергологія. - 2010. -№3-4. -С. 140-145.

3. Жуков О. Б., Зубарев А. Р., Мезенцева М. В., Дондуков Ц. В. Влияние препарата Глутоксим на показатели фертильности спермы у больных с хроническим бактериальным простатитом // Врачебное сословие. - 2005. №4-5.

4. Лях Ю.Є., Гурьянов В.Г. Основы компьютерной биостатистики: анализ информации в биологии, медицине и фармации статистическим пакетом MedStat. Донецк. - 2004. - 212 с.

5. Aggarwal S., Ghilardi N., Xie M.H., de Sauvage F.J., Gurney A.L. Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17 // J. Biol. Chem. - 2003. -Vol. 278. -P.1910-1914.

6. Chehimi J., Trinchieri G. Interleukin-12: A bridge between innate resistance and adaptive immunity with a role in infection and acquired immunodeficiency // J. Clin. Immunol. -1994. - Vol. 14. - P.149161.

7. Collison L.W., Workman C.J., Kuo T.T. et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function // Nature. - 2007. - Vol. 450 (7169). - P.566-569.

8. el-Demiry M.I., Hargreave T.B., Busuttil A., James K., Ritchie A.W., Chisholm G.D. Lymphocyte sub-populations in the male genital tract// Br. J. Urol.- 1985.- Vol. 57.-P. 769 -774.

9. Fedder J. Nonsperm cells in human semen: with special reference to seminal leukocytes and their possible influence on fertility//. Arch. Androl.- 1996.- Vol.36.- P. 41 -65.

10. Gruschwitz M.S., Brezinschek R., Brezinschek H.P. Cytokine levels in the seminal plasma of infertile males// J. Androl.- 1996.- Vol.17.- P.158 -163.

11. Lin Y., Huang Y., Lu Z., Luo C., Shi Y. et al. Decreased plasma IL-35 levels are related to the left ventricular ejection fraction in coronary artery // Jour- nal.pone. - 2012. Dec. 21.

12. Lucas S., Ghilardi N., Li J., de Sauvage F. J. IL-27 regulates IL-12 responsiveness of naive CD4+ T cells through Stat1-dependent and -independent mechanisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2003. - Vol.100(25). - P.15047-15052.

13. Naz R.K., Evans L. Presence and modulation of interleukin-12 in seminal plasma of fertile and infertile men // J. Androl. -1998.- Vol.19.- P.302 -307.

14. Niedbala W., Wei X.Q., Cai B., Hueber A.J., Leung B.P. et al. IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells // Eur. J. Immunol. - 2007. - Vol.37. - P.3021-3029.

15. WHO laboratory manual for the examination of human sperm and semem-cervical mucus interaction.- WHO, 4-th edn.: Cambridge universiti press. - 1999.- P.128.

16. Wolff H., Anderson D.J. Immunohistologic characterization and quantitation of leukocyte subpopulations in human semen// Fertil. Steril. -1988.- Vol.49.- P.497 -504.

Размещено на Allbest.ru