Стимулирующая роль Spla-протеиназы Staphylococcus aureus в развитии аллергического типа иммунных реакций у бактерионосителей с аллергическим ринитом

Введение

Аллергический ринит (АР) является одним из распространенных аллергических заболеваний человека, которое характеризуется наличием клинических симптомов: существенное нарушение носового дыхания, ринорея (слизистые выделения из полости носа), чихание и зуд [6].

В патогенезе АР первоначальное воздействие аллергенов и сенсибилизация запускают клеточный каскад из антигенпрезентирующих клеток (АПК), Т- и В-лимфоцитов, что приводит к формированию пула аллерген-специфических Т-клеток памяти и аллерген-специфичных IgE антител (реагинов). В классическом виде повторное воздействие аллергенов приводит к связыванию IgE на тучных клетках, запуская каскад реакций, приводящих к выделению важнейшего медиатора гиперчувствительности - гистамина, и развитию острых симптомов ринита.

Однако среди распространенных аллергенов, участвующих в развитии АР, выделяют гликопротеины, содержащиеся не только в частицах вдыхаемого воздуха, но и в продуктах жизнедеятельности назальной микробиоты, колонизирующей слизистую носа у таких пациентов. Существенную роль в процессе начальной сенсибилизации при АР могут играть протеазы, которые облегчают доступ других аэроаллергенов к АПК слизистой оболочки носа путем расщепления плотных соединений в эпителии дыхательных путей и активации эпителиальных клеток [12].

Среди таких протеолитических ферментов существенный интерес представляют секретируе- мые бактериальные сериновые Spl протеиназы Staphylococcus aureus (S. aureus), который является одним из доминирующих таксонов в составе микробиоты слизистой носа у пациентов с различными формами АР.

В ряде экспериментальных исследований было установлено, что сериновые протеиназы Spl- типа могут индуцировать Th2-иммуный ответ (на мышиной модели) при внутритрахеальном введении. При этом происходило развитие аллергического воспаления в легочной ткани и продукция в дренирующих лимфатических узлах специфических IgE и цитокинов Th2-профиля [16, 18].

Многие неизученные компоненты бактериальной микробиоты верхних дыхательных путей могут выступать потенциальными триггерами сдвига иммунного ответа по ТЪ2-типу и, вероятно, способствовать хроническому течению аллергических заболеваний дыхательных путей [11]. Однако роль белков компонентов микробиоты, в частности, протеиназ Staphylococcus aureus, в потенцировании Th2-rarn иммунного ответа у пациентов с проявлениями респираторной аллергии не изучена.

Цель: изучить потенцирование профиля Th2-ram иммунного ответа на Spl-протеиназы Staphylococcus aureus как значимого представителя микробиоты слизистых оболочек верхних дыхательных путей у пациентов с аллергическим ринитом.

Материалы и методы исследования. В исследование вошли 65 пациентов с диагнозом «круглогодичный аллергический ринит» (при сенсибилизации к бытовым аллергенам - клещи домашней пыли, и эпидермальным - перхоть животных) и 65 человек с сезонным АР. В возрастной структуре пациентов с АР преобладали взрослые и подростки (всего 65,7 %), дети составили 34,3 %. Пациенты были разделены также на 2 группы - бактерионосителей с преимущественно интермиттирующим АР (ИАР) (сезонный, острый) и персистирующим АР (ПАР) (круглогодичный, хронический, длительный). Группу контроля составили здоровые бактерионосителей S. aureus (n = 50 человек) и здоровые S. aureus-негативные лица (n = 20 человек), у которых в слизистой носа этот микроорганизм не обнаружен.

Исследованы образцы сыворотки и клетки крови, биоматериал со слизистой носа пациентов с АР и здоровых бактерионосителей S. aureus и здоровых лиц - не носителей S. aureus.

Работа одобрена Локальным этическим комитетом ФБУН «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора. Все пациенты дали письменное информированное согласие.

Изучены 180 изолятов S. aureus, выделенные со слизистой носа и носоглотки от бактерионосителей: 1) больных АР, 2) здоровых лиц. Титр выделения S. aureus составил от 104-106 КОЕ/тампон.

Бактериологическое исследование. Проведено на базе лаборатории микробиологии ФБУН «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора. Мазки со слизистой носа засевали на питательные среды: 5 % кровяной агар, желточно-солевой агар и среду Са- буро согласно рекомендациям [3]. Идентификацию штаммов осуществляли программно-аппаратным методом MALDI BioTyper («BrnkerDaltonics», США) при значениях параметра Score 2,3-3,0.

Детекция генов Spl-оперона в геноме S. aureus. Осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием набора специфических праймеров, представленных для детекции генов секретируемых Spl-протеиназ (splA-splF) по последовательностям и протоколу проведения ПЦР, как указано в работе M. Zdzalite соавторов (2012) [20]. Праймеры синтезированы в ЗАО «Син- тол» (Россия).

Получение белковых экстрактов S. aureus. 2D-электрофорез. Изоляты S. aureus культивировали 12 часов в среде 199 с добавлением 1 % глюкозы при 37° С. Культуральную жидкость (КЖ) центрифугировали при 7 000 об/мин для осаждения основной массы клеток при 4° С.

Для извлечения внеклеточных белков S. aureus использовали метод осаждения трихлоруксус- ной кислотой из КЖ. КЖ пропускали через мембранный фильтр (22 мкм), затем к очищенной фракции КЖ вносили 33 мл холодной 100 % трихлоруксусной кислоты, инкубировали на льду 30 мин, белки отделяли центрифугированием 30 мин при 13,2 000 об/мин. Белковый осадок промывали ацетоном. Полученный осадок растворяли в 300 мкл растворителя белка (8 молярная мочевина; 3,0 % 3-(3-холамидопропил) диметиламмоний-3-пропансульфонат (CHAPS); 2,0 % NP40; 0,2 % амфолитов, pH 3-10; 50 ммоль дитиотреитола; 10 ммоль трис, pH 8,5).

Отбирали аликвоты, содержащие по 150 мкг белка, в первом направлении проводили изоэлектрофокусирование белков (30 мкг белка на стрип) на коммерческих стрипах (immobilized pH gradient (IPG)) 17 см, pH 4-11 («Bio-Rad», США), далее проводили активную регидратацию (12 часов) и изоэлектрофокусировку (8 часов) на приборе «Proteani12 IEFcell» («Bio-Rad», США). Во втором направлении проводили градиентный электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ, от 9 до 16 %) в течение 5 часов при температуре 10° С. Белки окрашивали флуоресцентным красителем «Flamingo» («Bio-Rad», США) в соответствии с инструкциями производителя. Гели сканировали с использованием сканера «Typhoon 9500» («GE Healthcare», США).

2D-Иммуноблотинг. После проведения 2D-электрофореза разделенные белковые пятна переносили на мембрану PVDF. После блокировки 5,0 % сухим обезжиренным молоком в Трис-HCl буфере (20 ммоль трис-HCl, 137 ммоль NaCl, 0,1 % объем/объем Твин-20 [pH 7,6]), мембраны обрабатывали сывороточными антителами путем инкубации с пулированной сывороткой пациентов с АР в разведении (1 : 10 000). Иммуноглобулины IgG4, IgE определяли вторичными мышиными антителами против IgG4 человека, конъюгированными с пероксидазой («Abcam», Великобритания) в концентрации 0,2 мкг/мл и мышиными моноклональными антителами против IgE человека в концентрации 0,3 мкг/мл, и визуализировали с помощью хемилюминесцентного субстрата с максимальной чувствительностью Super-Signal West Femto («Thermo Fisher Scientific Inc.», США).

Идентификация белка. Белки S. aureus, соответствующие зонам детекции IgG4, IgE антител, идентифицировали путем сопоставления 2D-иммуноблотов с окрашенными 2D-гелями. Соответствующие белковые пятна вырезали из геля и идентифицировали с помощью масс-спектрометрии.

Масс-спектрометрическую идентификацию проводили с помощью масс-спектрометра «MaXis impact» («Bruker», Германия). Полученные пептиды разделяли на хроматографе «UltiMate 3000 UHPLC» («Thermo Fisher Scientific Inc.», США). Элюированные пептиды водили в масс- спектрометр с помощью источника ионизации «Captive Spray» («Bruker», Германия), диапазон детектируемых масс 50-2200 m/z, режим autoMS/MS. Масс-спектры анализировали с помощью программы «Data Analysis 4.1» («Bruker Daltonics», Германия), по полученным масс-листам белки идентифицировали с помощью программы «Mascot 2.4.0».

Получение рекомбинантной стафилококковой сериновой протеиназы - rSplA-Strep-tag II. Для получения экспрессионной конструкции использован плазмидный вектор «pASG-IBA2» («IBA GmbH», Германия). Фрагмент гена splA, кодирующий зрелую сериновую SplA протеиназу без сигнального пептида (SP), амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК референс-штамма S. aureus 8325-4 и клонировали по протоколам, представленным в руководстве [13]. После инкубации на чашках с LB-агаром, содержащим 5-бромо-4-хлоро-3-индоил-бетаШ-галактопиранозид (X-Gal), отбирали трансформанты в виде белых колоний E. coli и выделяли плазмидную ДНК. Белковый профиль рекомбинантных клонов анализировали методом SDS-PAGE электрофореза. Очистку продуцируемого рекомбинантного белка осуществляли коммерческой системой «Strep-tag» по рекомендациям, представленным в протоколе руководства [13].

Выделение мононуклеаров периферической крови и их стимуляция рекомбинантной инактивированной протеиназой rSplA-Strep (tag) и белком А (protein A) S. aureus. Выделение мононуклеаров крови (МК) проводили из периферической крови здоровых добровольцев (n = 10) и пациентов с АР (n = 10) после информированного согласия. Кровь забирали в пробирки, содержащие антикоагулянт (гепарин), МК выделяли в градиенте плотности фиколл-урографина (р = 1,077 г/мл) по методу A. Boyum. Полученную фракцию МК вносили в питательную среду «RPMI-1640» («Gibco», «Thermo Fisher Scientific Inc.», США) до концентрации 2 х 106 клеток/мл. Оценку жизнеспособности клеток проводили на автоматическом анализаторе в соответствии с методикой производителя. Полученную клеточную массу разводили 10,0 мл питательной среды «RPMI 1640» с L-глутамином («Gibco», «Thermo Fisher Scientific Inc.», США), содержащей 200 ед/мл пенициллита, 200 мкг/мл стрептомицина, 1,0 ммоль пирувaтa штрия, 50 нмоль Я-меркаптоэтанола и 5 % человеческой сыворотки. Клетки инкубировали в течение 3 суток во флаконах для культивирования, 75 см3 («Thermo Fisher Scientific Inc.», США) при 37° С в газовой среде, содержащей 5 % СО2 при 95 % влажности [2]. В качестве стимуляторов применяли полученную рекомбинантную термоинактивированную SplA -протеиназу и белок А (protein A) S. aureus («Sigma-Aldrich», США) в концентрации 5 мкг/мл. Контрольные культуры МК инкубирoвали в отсутствии бактериальных антигенoв. После окончания инкубации МК отделяли центрифугированием, а полученные супернатанты отбирали в объеме 250,0 мкл и сохраняли при температуре -70° С.

Концентрация цитокинов ИЛ-17, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13, ИНФ-у, TGF-Я, ТНФ-а. Определяли методом мультиплексного анализа на автоматическом анализаторе «Bio-Plex 200», («Bio-Rad», США) с помощью программы «Bio-PlexManager 5.0» («Bio-Rad», США).

Изменение тонцентрации цитокинов в супернатантах КЖ культуры клеток (AKc) рассчитывали как разницу между концентрацией цитокинов в культуре стимулированных бактериальным антигеном клеток и концентрацией цитокинов в культуре нестимулированных клеток.

Статистическая обработка. Использовали средства параметрической и непараметрической статистики. Статистический анализ проводили в программе «GraphPadPrism 5.0» (2007) («GraphPad Software», США). Расчет 95 % доверительного интервала (95 % CI) осуществляли по методу Р. Ньюкомба (1998) с помощью бесплатного веб-ресурса для статистических вычислений» «VassarStats».

Биоинформативный анализ. Поиск гомологичных SplA-протеиназе белков проводили, используя ресурс, представляющий собой инструмент для выравнивания и поиска последовательностей на основе базы данных Universal Protein Resource (UniProt) [19].

Результаты исследования и их обсуждение. По клинико-анамнестическим данным установлено, что в группе пациентов с ПАР выявлено преобладание наследственной отягощенности по материнской линии и линиям обоих родителей по сравнению с группой пациентов с ИАР. Результаты исследования иммунологического статуса, включающего в себя цитокиновый профиль, а также клеточный состав риноцитограммы в группах пациентов с АР, представлен в таблице 1.

Таблица 1 Иммунологические особенности пациентов с АР

Примечание: M ± SD, t-критерий, различия достоверны: *при p < 0,05 и **при p < 0,01