Антитромботическое действие соединения РУ-1144 на модели системного артериального тромбоза

Размещено на http://www.allbest.ru/

Антитромботическое действие соединения РУ-1144 на модели системного артериального тромбоза

А.А. Спасов, А.Ф. Кучерявенко, А.В. Смирнов, К.А. Гайдукова, В.С. Сиротенко, Н.Г. Паньшин, ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет»; О.Н. Жуковская, НИИ Физической и органической химии Южного федерального университета

В настоящем исследовании была изучена антитромботическая активность нового химического соединения производного бензимидазола, имеющего в своей структуре экранированный фенольный заместитель, под лабораторным шифром РУ-1144, которое проявляет высокую антиагрегантную и антиоксидантную активности в тестах in vitro и in vivo. Было показано, что тестируемый образец обладает выраженным антитромботическим эффектом и превосходит по активности препараты сравнения ацетилсалициловую кислоту и клопидогрел на модели клеточного тромбоза, генерированного у мышей.

Ключевые слова: артериальный тромбоз, агрегация тромбоцитов, перекисное окисление липидов, соединение РУ-1144, ацетилсалициловая кислота, клопидогрел.

Antithrombotic effect of a compound RU-1144 on the model of systemic arterial thrombosis

A.A. Spasov, A.F. Kucheryavenko, A.V. Smirnov, K.A. Gaidukova, V.S. Sirotenko, N.G. Panshin; FSBEI HE «Volgograd State Medical University»; O.N. Zhukovskaya, Research Institute of physical and organic chemistry, Southern Federal University

In this study, the antithrombotic activity of a new chemical compound of a benzimidazole derivative, which has a shielded phenolic substituent in its structure, under the laboratory code RU-1144 was studied, which exhibits high antiplatelet and antioxidant activity in vitro and in vivo tests. It was shown that the test sample has a pronounced antithrombotic effect and is superior in activity to the comparison drugs acetylsalicylic acid and clopidogrel in a model of cell thrombosis generated in mice.

Key words: arterial thrombosis, platelet aggregation, clopidogrel.

Важным фактором, который определяет исход заболеваний сердечно-сосудистой системы, являются артериальные тромбозы. В случае развития атеросклеротического повреждения сосудистой стенки происходит фиксирование скоплений тромбоцитов на поврежденном эндотелии сосудов, происходящее с помощью фибриновых нитей, и, в итоге, образуются белые тромбы [9]. Несмотря на то, что изначально тромбоциты рассматривались лишь как элементы, участвующие в образовании гемостатического тромба в месте повреждения сосудистой стенки, в настоящее время доказано, что они являются ключевыми медиаторами патогенеза артериальных тромбозов и атеросклероза. Кроме того, в последние годы сформировалась концепция о важнейшей роли перекисного окисления липидов в патогенезе повышения тромбогенного потенциала крови, определены источники активных форм кислорода и азота, которые вносят вклад в развитие данной патологии [7, 8]. Все вышеперечисленное является теоретическим обоснованием использования антиагрегантных и антиоксидантных препаратов в качестве средств патогенетической терапии.

Химический класс замещенных гетероциклических азотосодержащих соединений считается перспективным для создания на его основе новых препаратов, о чем свидетельствует широкий спектр проявляемой биологической активности [4, 5]. В ранее проведенных исследованиях была установлена способность химического соединения РУ-1144, содержащего в своей структуре пространственно затрудненный фенол, проявлять выраженную антиагрегантную и антиоксидантную активности.

Цель работы. Изучить антитромботическую активность на модели артериального адреналин-коллагенового тромбоза у мышей in vivo.

Методика исследования

Эксперименты выполнены на 40 белых беспородных мышах обоего пола массой 20-25 г, содержащихся в условиях вивария (температура 22-24 °С, относительная влажность воздуха 40-50 %) с естественным световым режимом на стандартной диете (ГОСТ Р 50258-92) при соблюдении правил лабораторной практики проведения доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 1000.4-96), а также правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Эксперименты были одобрены региональным исследовательским этическим комитетом Волгоградской области (протокол № 2022-2016 от 7 октября 2015 г.).

Данное исследование выполнено в соответствии с требованиями действующего «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (под ред. Миронова А.Н., 2012 г.) [3].

Изучение антитромботической активности соединения 1 -(2,6-дитретбутил-4-(1 -гидроксиэтил)- фенил-пиримидобензимидазол гидрохлорид (НИИ ФОХ ЮФУ, г. Ростов-на-Дону) in vivo проводили на модели клеточного адреналин-коллагенового тромбоза в соответствии с методикой Di Minno G. (1983) [6]. В качестве тромботического агента использовали смесь растворов коллагена и адреналина в дозе 0,5 и 0,06 мг/кг соответственно. Данную смесь в объеме 0,1 мл вводили в хвостовую вену животного в течении 10 с. Соединение РУ-1144 растворяли в дистиллированной воде и вводили перорально при помощи атравматичного металлического зонда за 2 часа до моделирования тромбоза. В качестве препаратов сравнения использовали лекарственные средства с высоким уровнем доказательности - ацетилсалициловую кислоту (Sigma, США) и клопидогрел (Sanofi, Франция). Тестируемые образцы вводили в дозах ED₅₀, полученных при изучении антиагрегантной активности in vivo согласно методу [1]. Для соединения РУ-1144 доза составила 18,8 мг/кг, а для ацетилсалициловой кислоты и клопидогрела - 28, и 13,8 мг/кг соответственно. Животным контрольной группы вводился растворитель в эквивалентном объеме. Для оценки эффективности тестируемых образцов отмечалось количество выживших животных по сравнению с контрольной группой, а также наличие тромбов в сосудах легких. В течение суток устанавливалось наблюдение за выжившими животными. Погибшие и выжившие мыши (для эвтаназии применялся эфирный наркоз) подвергались вскрытию для гистологической оценки легких. У животных контрольной группы была также проведена гистологическая оценка печени, сердца, почек, головного мозга.

После забора материал фиксировали в 10%-м растворе нейтрального забуференного формалина (pH 7,4) на 24 часа, обезвоживали и заливали в парафин. Затем из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4-6 мкм и окрашивали их по методу Саркисова (1996) гематоксилином и эозином. Фотографирование гистологических препаратов осуществляли цифровой камерой Olympus (Japan, 4.0 мегапикселей) на базе микроскопа Micros (Austria) c использованием объектива х10, х40 и окуляра х10. При морфологическом исследовании проводили оценку наличия признаков тромбообразования в стенке артериальных сосудов мышечного типа.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Excel 2007 (среднее значение и стандартная ошибка средней величины), а также программы GraphPad Prism 5.0 с использованием критерия one-way ANOVA с поправкой Бонферрони и критерия Фишера.

При исследовании гистологических срезов микропрепаратов оценивали наличие признаков тромбообразования в стенке артериальных сосудов мышечного типа. Статистическую обработку данных гистологических исследований проводили с использованием программы «Видео Тест Морфо-4».

Результаты исследования и их обсуждение

При исследовании антитромботического действия соединения РУ-1144 на модели генерализованного адреналин-коллагенового тромбоза была продемонстрирована его высокая активность.

После введения тромботических агентов в группе контрольных животных наблюдалось увеличение частоты дыхания, выраженный экзофтальм, парез задних конечностей и характерные тетанические судороги: мыши не были способны отдергивать задние лапы при сильном нажатии и принимали характерную позу, при которой задние лапы были выпрямлены и отведены назад. Через 1-3 минуты после внутривенного введения смеси адреналина и коллагена животные погибали от удушья. В группе контрольных животных наблюдалась гибель 95 % животных.

Введение соединения РУ-1144 и препаратов сравнения ацетилсалициловой кислоты и клопидогрела достоверно повышало выживаемость мышей при создании данной модели тромбоза до 80, 60 и 50 % соответственно (рис. 1).

Рис. 1. Выживаемость мышей на модели генерализованного адреналин-коллагенового тромбоза под действием соединения РУ-1144 и препаратов сравнения ацетилсалициловой кислоты и клопидогрела

* Данные, достоверные по отношению к контролю (точный критерий Фишера, р ?0,01)

При этом дыхательная и двигательная активность выживших животных полностью восстанавливались через 1-2 минуты, а у погибших животных смерть наступала только спустя 5-10 минут. При этом у мышей наблюдались менее выраженные симптомы дыхательной недостаточности.

Таким образом, было показано, что соединение РУ-1144 обладает выраженной антитромботической активностью, при этом превосходя препараты сравнения ацетилсалициловую кислоту и клопидогрел в 1,3 и 1,6 раз соответственно.

Согласно литературным данным [2] гибель животных в результате введения тромботических агентов наступает в результате массивной окклюзии микрососудов легких тромбоцитарными агрегатами. Поэтому было выполнено гистологическое исследование легких, а также печени, сердца, почек и головного мозга животных. В результате было показано наличие тромбов только в микрососудах легких. Во всех остальных органах повреждений не обнаружено, что соответствует данным, полученным другими исследователями [2].

При исследовании срезов легких (рис. 2) контрольных животных при помощи электронномикроскопического исследования было выявлено преобладание альвеол средних размеров, в значительной части сосудов микроциркуляторного русла были обнаружены тромбы, адгезированные к сосудистой стенке и находящиеся в просвете сосуда. Отмечалось выраженное расширение межальвеолярных перегородок за счет полнокровия и отека, обнаружены также явления диапедеза эритроцитов в межальвеолярные перегородки, в просвет некоторых альвеол, явления стаза и очаговые мелкие кровоизлияния. Выявлялась слабо выраженная лимфоидная инфильтрация в периваскулярных отделах и в стенках мелких бронхов. Также в контрольных образцах наблюдалось большое количество тромбов в просветах сосудов. При проведении морфометрического исследования срезов легких контрольных животных выявлено, что относительная площадь тромбов на срезах легкого составила (4,15 ± 1,12) %, а средняя площадь тромба на срезах составила (9858,41 ± 2261,26) мкм² (табл.).

Рис. 2. Тромбообразование в легких под влиянием внутривенного введения смеси коллагена и адреналина. Окраска гематоксиллином и эозином Ув. 100

Таблица 1 Антитромбогенная активность соединения РУ-1144 и препаратов сравнения на модели генерализованного адреналинколлагенового тромбоза в дозах ED₅₀, полученных в тестах ex vivo

`Данные достоверны относительно контроля, one-way ANOVA с поправкой Бонферрони (р < 0,05).

На срезах легких мышей, получавших соединение РУ-1144, наблюдались единичные тромбы в венах, адгезированные к сосудистой стенке. Кровоизлияния отсутствовали (рис. 3). Относительная площадь тромбов на срезах легкого составила (1,51 ± 0,42) %, то есть снижалась на 2,64 % (р < 0,05) по сравнению с контролем, а средняя площадь тромба на срезах составила (3590,17 ± 1097,21) мкм², то есть снижалась на 63,58 % (р < 0,05) по сравнению с контролем (см. табл.).

Рис. 3. Влияние соединения РУ-1144 на тромбообразование в легких мышей, вызванное внутривенным введением смеси коллагена и адреналина.

Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100

У животных, получавших ацетилсалициловую кислоту, наряду с альвеолами средних размеров, встречались эмфизематозно-расширенные альвеолы и альвеолы меньших размеров. Преобладали нарушения кровообращения по типу полнокровия капилляров межальвеолярных перегородок и других сосудов микроциркуляторного русла. Выявлялись небольшие единичные тромбы, преимущественно, в сосудах венозного типа. Отмечалось утолщение межальвеолярных перегородок за счет полнокровия (рис. 4).

Рис. 4. Влияние ацетилсалициловой кислоты на тромбообразование в легких мышей, вызванное смесью коллагена и адреналина. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100

При проведении морфометрического исследования срезов легких животных, получавших ацетилсалициловую кислоту, выявлено, что относительная площадь тромбов на срезах легкого составила (1,83 ± 0,58) %, то есть снижалась на 2,32 % (р < 0,05) по сравнению с контролем, а средняя площадь тромба на срезах составила (4372,69 ± 1237,61) мкм², то есть снижалась на 55,65 % (р < 0,05) по сравнению с контролем.

У животных, получавших клопидогрел, преобладали нарушения кровообращения по типу полнокровия капилляров межальвеолярных перегородок и других сосудов микроциркуляторного русла. Были выявлены небольшие единичные тромбы. Отмечалось утолщение межальвеолярных перегородок за счет полнокровия. Мелкоочаговые кровоизлияния в стенку капилляров и просвет альвеол (рис. 5).

Рис. 5. Влияние клопидогрела на тромбообразование в легких мышей, вызванное смесью коллагена и адреналина.

Окраска гематоксиллином и эозином. Ув.100

При проведении морфометрического исследования срезов легких животных, получавших клопидогрел, выявлено, что относительная площадь тромбов на срезах легкого составила (1,98 ± 0,67) %, то есть снижалась на 2,17 % (р < 0,05) по сравнению с контролем, а средняя площадь тромба на срезах составила (4768,83 ± 1479,71) мкм², то есть снижалась на 51,63 % (р < 0,05) по сравнению с контролем.

Заключение

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что в результате изучения влияния соединения РУ-1144 на процессы тромбообразования, вызванные повреждением стенки артерий введением тромботических агентов, установлена его высокая способность увеличивать выживаемость животных в эксперименте при однократном внутрижелудочном введении, превосходящая ацетилсалициловую кислоту и клопидогрел в 2 и 1,6 раза соответственно. В инициации данной модели тромбоза ключевую роль играют именно тромбоциты, в мембранах которых при их активации происходит усиление ПОЛ. Следовательно, полученные данные подтверждают, что способность соединения РУ-1144 угнетать процессы агрегации тромбоцитов и ПОЛ приводит к предотвращению тромбообразования. Это подтверждают и данные морфологического исследования срезов легких мышей. Так, соединение РУ-1144 снижает среднюю и относительную площадь тромбов на срезе легкого в 3,8 и 2,7 раза соответственно по отношению к контролю, при этом превосходя по данным показателям препараты сравнения - ацетилсалициловую кислоту и клопидогрел.

антитромботический клопидогрел ацетилсалициловый кислота

Литература

1. Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю., По- зин Е.Я., Маркосян Р.А. Новый методический подход к исследованию агрегации тромбоцитов in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1989. - № 10. - С. 437-439.

2. Кучерявенко А.Ф., Спасов А.А., Смирнов А.В. Антитромботическая активность нового гипогликемического соединения лимиглидола на модели клеточного тромбоза у мышей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2015. - Т. 159, № 1. - С. 49-51.

3. Макаров В.А., Спасов А.А., Плотников М.Б. и др. Методические рекомендации по изучению лекарственных средств, влияющих на гемостаз // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоцразвития России. - М., 2012. - С. 453-479.

4. Спасов А.А., Кучерявенко А.Ф., Косолапов В.А., Анисимова В.А. Антитромбогенная активность антиоксидантных соединений // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 155, № 6. - С. 740-742.

5. Спасов А.А., Сиротенко В.С., Гайдукова К.А. и др. Антитромботическая активность нового производного тетрагидро[1,3]диазепино[1,2-а]-бензимидазола соединения ДАБ-15 на модели артериального тромбоза // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - 2016. - № 1 (57). - С. 56-58.

6. DiMinno G., Silver M.J. Mouse antithrombotic assay simple method for the evaluation of antithrombotic agents in vivo. Potentiation of antithrombotic activity by ethyl alcohol // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1983. - № 225. - P. 57-60.

7. Kudriashova M.V., Dovgaliuk U.V., Mishina I.E., et al. Possibilities of correction of rheological properties of the blood and free radical processess in patients with acute myocardial infarction combined with type 2 diabetes mellitus // Kardiologiia. - 2010. - № 50 (5). - P. 9-12.

8. Mozaffarian D., Benjamin E.J., Go A.S., Arnett D.K., Blaha M.J., et al. Heart disease and stroke statistics (a report from the American Heart Association) // Circulation. - 2016. - № 133. - P. 38-60.

9. Suzuki-Inoue K. Activation and inhibitory mechanisms of blood platelets // Nihon Rinsho. - 2014. - № 72 (7). - P. 1212.

Размещено на Allbest.ru