Способ получения радиотрейсера на основе модифицированной адресной молекулы белковой природы и технеция-99ы и оценка его специфичности in vitro для диагностики онкомаркера HER2

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

Сибирский государственный медицинский университет,

Национальный исследовательский Томский политехнический университет

Национальный исследовательский институт онкологии

Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН

Способ получения радиотрейсера на основе модифицированной адресной молекулы белковой природы и технеция-99m и оценка его специфичности in vitro для диагностики онкомаркера HER2

М.С. Ларькина, Е.С. Стасюк, В.И.Чернов

О.Д. Брагина, Е.В. Подрезова, В.В. Боденко

М.С. Юсубов, Е.А. Нестеров, М.В. Белоусов

Аннотация

Наличие гиперэкспрессии онкомаркера HER2 выявляется на поверхности опухолевых клеток при раке молочной железы, легкого, яичников, желудка, простаты и др. Новый класс адресных молекул неиммуноглобулиновой природы DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein), являющихся специфичными к раковоассоциированному антигену HER2, предлагается для радионуклидной диагностики этого антигена. Ранее мы предложили способ модификации адресных молекул белковой природы (DARPin929) с применением хелатирующего агента сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата (DPAH-NHS) для эффективного связывания ^99mTc. В настоящем исследовании были подобраны оптимальные условия радиосинтеза и предложена двухстадийная методика мечения ^99гаТс DPAH-DARPin9_29. Оптимизация методики мечения заключалась в подборе оптимального времени инкубации и температуры, а также в оптимальном соотношении количеств белка и комплекса ^99mTc(CO)₃. Радиохимический выход и радиохимическую чистоту радиотрейсера оценивали тонкослойной радио-хроматографией на полосках iTLC-бумаги в фосфатно-буферном растворе. При оптимизации методики установлено, что в условиях инкубации (60 мин при 60°C) на 50 мкг белка необходимо 50 мкл раствора ^99mTc(CO)₃ (с активностью 100-200 МБк). Радиохимический выход радиотрейсера Tc-DPAH-DARPin9_29 составил более 83% (изолированный выход более 70%) при чистоте свыше 96% после очистки гель-фильтрацией c G25. При этом была доказана высокая стабильность радиотрейсера (чистота более 97%) после инкубации с 5000-кратным молярным избытком L-гистидина в течение 6 часов. Изучение специфичности in vitro ^99mTc-DPAH-DARPin9_29 выполняли на клеточных линиях с различным уровнем экспрессии HER2: SKOV-3 > BT-474. Блокирование рецептора HER2 проводили путем добавления 100-кратного молярного избытка немеченого DARPin9_29 в половину чашек Петри каждой клеточной линии с последующей инкубацией в течение 60 минут при температуре 37 °С. Установлено, что накопление радиотрейсера пропорционально уровню экспрессии HER2 в клетках, при этом при блокировании рецепторов избытком немеченого белка отмечается значительное снижение связывания радиотрей- сера в обеих группах клеток.

Ключевые слова: адресная молекула, хелатирующий агент, сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноат, технеций-99м, радиотрейсер, онкомаркер HER2

Annotation

Preparation of technetium-99m labeled radiotracer target protein molecules derivative and in vitro assessment of its specificity for the diagnosis of HER2

M.S. Larkina, E.S. Stasyuk, O.D. Bragina, V.I. Chernov, E.V. Podrezova, VV. Bodenko, M.S. Yusubov, Е.А. Nesterov, M.V. Belousov

Siberian state medical university,

National research Tomsk polytechnic university,

Cancer research institute,

Tomsk national research medical center,

Russian academy of science

The presence of overexpression of the HER2 tumor marker is detected on the surface of tumor cells in cancer of the breast, lung, ovary, stomach, prostate, etc. A new class of targeted molecules of non-immunoglobulin nature DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein), which are specific for the cancer- associated HER2 antigen, is proposed for radionuclide diagnosis of this antigen. Earlier, we proposed a method for preparation the targeted protein molecule DARPin9_29 derivate (DPAH-DARPin9_29) using the chelating agent succinimid-1-yl 6- (bis (pyridin-2-ylmethyl) amino)hexanoate for efficient binding of ^99mTc. In this study, the optimal conditions for radiosynthesis were selected and a two-stage ^99mTc labeling method DPAH-DARPin9_29 was proposed. The optimization of the labeling technique consisted in the selection of the optimal incubation time and temperature, as well as in the optimal ratio of protein to complex ^99mTc(CO)3. Radiochemical yield and purity were measured using radio-iTLC in PBS. It was found that, under incubation conditions (60 min at 60°C), 50 мl of a ^99mTc(CO)3 solution (with an activity of 100-200 MBq) is necessary for 50 мg of protein. The radiochemical yield of radiotracer ^99mTc-DPAH- DARPin9_29 was over 83% (isolated yield about 70%), the radiochemical purity after gel-filtration purification was over 96%. The stability of ^99mTc-DPAH-DARPin9_29 has been proven in accordance with a 5,000-fold mol excess of L-histidine. Binding specificity of ^99mTc-labeled DPAH-DARPin9_29 to HER2 was evaluated using HER2-expressing SKOV3 and BT474 cells. To saturate HER2 receptors, a 100-fold excess of non-labeled DARPin9_29 (100-fold mol excess) was added to the control group of cells. In vitro studies showed that the accumulation of ^99mTc-DPAH-DARPin9_29 was directly proportional to the level of HER2 expression in cells (SKOV-3 > BT-474), while blocking the receptors with an excess of unlabeled protein showed a significant reduction in binding in the group of cells.

Keywords: target molecule, chelating agent, succinimid-1-yl 6-(bis(pyridin-2-ylmethyl)amino) hexanoate, technetium-99m, radiotracer, HER2

Постановка проблемы

Наличие гиперэкспрессии онкомаркера HER2 выявляется на поверхности опухолевых клеток при раке легкого, яичников, желудка, простаты и др. [1-3]. Особое место среди злокачественных новообразований занимает рак молочной железы, амплификации гена при котором отмечается у 1520% больных и ассоциируется с агрессивным течением заболевания, а также с низкими показателями общей и безрецидивной выживаемости [4-5].

В связи с этим HER2 активно применяется в качестве молекулярной мишени для диагностики и таргетной терапии у пациентов с гиперэкспрессией данного рецептора [5]. При этом новый класс адресных молекул неиммуноглобулиновой природы DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein), являющихся специфичными к раковоассоциированному антигену HER2, предлагается для радионуклидной диагностики этого антигена [6-11].

Ранее в рамках государственного контракта №14.N08.11.0163 от «31» августа 2017 г. ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» по теме «Доклинические исследования радиофармацевтического препарата на основе меченных ^99mTc рекомбинантных адресных молекул для радионуклидной диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER-2/neu» нами был предложен способ получения производного DARPin9_29 (DPAH- DARPin9_29) с применением хелатирующего агента сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата (DPAH-NHS) для прочного связывания ^99mTc [12-15].

Кроме того, нами была показана специфичность связывания радиотрейсера на основе DPAH-DARPin9_29 и ^99mTc с использованием двух клеточных линий аденокарцином человека с экспрессией (ВТ-474) и без экспрессии (MCF-7) HER2. Таким образом, данная работа является продолжением работ по разработке отечественного радиотрейсера на основе модифицированной адресной молекулы белковой природы DPAH- DARPin9_29 и ^99mTc [14].

Целью настоящего исследования явилась оптимизация способа получения радиотрейсера на основе модифицированной адресной молекулы белковой природы DPAH-DARPin9_29 и ^99mTc и оценка его специфичность in vitro для диагностики HER2.

Методика эксперимента

В качестве объекта исследования использовали рекомбинантныеадресныемолекулыбелковойпри- роды с антикириновыми повторами (DARPin9_29), модифицированные хелатирующим агентом сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил) амино)гексаноатом (DPAH-NHS) как описано в способе получения (DPAH-DARPin9_29) [13].

Методика мечения ^99mTc DPAH-DARPin9_29 и изучение стабильности in vitro. Элюат натрия пертехнетата ([^99mTcO^4-]) (500 мкл), содержащий 1-2 ГБк, добавляли в набор для приготовления трикарбонильного ^99mTc ([^99mTc(CO)3]⁺) «CRS Isolink» (Center fOr Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) [1618], который затем инкубировали при 100 °C в течение 30 минут. После инкубации 50 мкл приготовленного раствора комплекса [^99mTc(CO)3]⁺ добавляли к 50 мкг DPAH-DARPin9_29 в 100 мкл фосфатного буферного раствора (PBS). Смесь инкубировали в течение 60 мин при 60 °С. Полученный комплекс очищали, используя колонки c G25 NAP-5 (GE Healthcare, Швейцария), предварительно уравновешенные элюирование PBS.

Радиохимический выход (РХВ) и радиохимическую чистоту (РХЧ) радиотрейсера оценивали тонкослойной радио-хроматографией (радио- ТСХ) на полосках iTLC-бумаги [19, 20], (iTLC- SG paper, Agilent, США) в PBS. Визуализацию радиохроматограмм проводили с помощью ТСХ- сканера (ELYSIA Raytest. Model: Gamma BGO-V, Detector +miniGita, Германия), для измерения абсолютной радиоактивности использовали дозка- либратор ATOMLAB 500 (Biodex, США).

Меченный ^99mTc DPAH-DARPin9_29 и коллоид восстановленного гидролизованного ^99mTc оставались в точке нанесения, в то время как [^99mTcO^4-], [^99mTc(CO)₃]⁺ мигрировали с фронтом растворителя. Для определения присутствия коллоида восстановленного гидролизованного ^99mTc полоски iTLC элюировали в системе пиридин: уксусная кислота: вода (10 : 3 : 1,5). В этой системе коллоид оставался в месте нанесения, в то время как меченный ^99mTc DPAH-DARPin9_29, [^99mTcO^4-], [^99mTc(CO)₃]⁺ мигрировали с фронтом растворителя.

Тест на стабильность проводили путем инкубации очищенного радиотрейсера ^99mTc-DPAH- DARPin9_29 с 5000-кратным молярным избытком Z-гистидина в PBS в течение до 6 часов при комнатной температуре; контрольные образцы инкубировали в PBS. Образцы были проанализированы с помощью радио-iTLC в PBS.

Методика изучения особенности накопления радиотрейсера 9_29 в культуре клеток злокачественных опухолей. В in vitro исследованиях использовались 2 клеточные линии с различным уровнем экспрессии HER2: SKOV-3 (1.6Ч10⁶ рецепторов/клетка) > BT474 (1.2Ч10⁶ рецепторов/клетка). Клетки высевали в чашки Петри диаметром 3,5 см (0,7 млн клеток на чашку) по 10 чашек на каждую линию за 2 дня до исследования до образования монослоя. Далее перед экспериментом среду удаляли, клетки промывали 1 мл PBS. Блокирование клеток выполняли путем добавления немеченого белка DARPin9_29 (по 500 мкл, 1000 нмоль) в половину из чашек Петри каждой клеточной линии (в оставшуюся половину чашек по 500 мкл культуральной среды), после инкубации в течение 60 минут при температуре 37⁰С во все чашки добавляли испытуемый радиотрейсер (по 500 мкл, 10 нмоль). Клетки инкубировали 1 ч при температуре 37⁰С, раствор в каждой чашки собирали в пробирки, клетки промывали 1 мл PBS в те же пробирки и отделяли, добавляя по 500 мкл раствора трипсина (инкубация при температуре 37⁰С, 3-5 мин). Затем суспендировали клетки, добавляя по 500 мкл среды, собирали суспензию клеток в пробирки (отбор 20 мкл для подсчета клеток), дополнительно промывали чашки по 1 мл PBS. Радиоактивность каждой фракции клеток измерялась с помощью гамма-спектрометра многоканального CANBERRA (Canberra Industries, Inc., США) и считали связанную клетками радиоактивность в % на 10⁶ клеток.

Результаты исследований обрабатывали с помощью программного комплекса Statistica 10.0 и Excel. Достоверность различий оценивалась с использованием t-теста (различия считали достоверными при р ? 0.05). Результаты определения представлены как x ± S (n=3-5), где x - значение среднего результата, S - стандартное отклонение.

радиотрейсер модифицированный онкомаркер опухолевый радиосинтез

Оптимизация методики мечения заключалась в подборе оптимального времени инкубации и температуры, а также в оптимальном соотношении количеств белка и комплекса ^99mTc(CO)₃.

Для DPAH-DARPin9_29 в условиях инкубации 60 мин при 60 °C были подобраны оптимальные соотношения количеств белка и комплекса ^99mTc(CO)₃, что составило 50 мкг белка и 50 мкл раствора ^99mTc(CO)₃. РХВ при этом рассчитан свыше 74% (табл. 1).

Инкубация DPAH-DARPin9_29 с комплексом ^99mTc(CO)₃ в течение 60 мин при 60°C обеспечивала РХВ более 75% (табл. 2).

Таблица 1

Оптимизация методики мечения DPAH-DARPin9 29 с ^99mTc(CO)₃ в зависимости от соотношения количеств белка и комплекса ^99mTc(CO)₃

Примечание: n = 3; *условия инкубации - 60 мин при 60 °C, количество раствора 99mTc(CO)3 (90 МБк) 50 мкл; ** - условия инкубации - 60 мин при 60 °C, количество белка 50 мкг.

Таблица 2

Оптимизация методики мечения DPAH-DARPin9 29 с 99mTc(CO)3 в зависимости от времени инкубации (при 60°С) и от температуры инкубации (при 60 мин инкубации)