Определение количественного содержания эфавиренза методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектором

Размещено на http://www.allbest.ru/

OOO ”АМЕДАРТ

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России

ООО «Фарм-Синтез Лаб»

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ ЭФАВИРЕНЗА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ДЕТЕКТОРОМ

О.Ю. Захода, Н.П. Садчикова,

Н.Б. Демина, С.А. Золотов,

А.С. Золотова, И.И. Краснюк

г. Москва

Аннотация

Данная статья является результатом разработки методики количественного определения эфавиренза с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в лекарственных препаратах.

Для достижения оптимальных значений параметров пригодности хроматографической системы были обработаны данные, полученные при исследовании более чем 10 хроматографических колонок в разных хроматографических условиях. Обработанна доступная литература в том числе и из иностранных источников информации. Наилучший результат достигнут при использовании хроматографической колонки Zorbax SB-CN, силикагельной колонки, химически модифицированной нитрильными группами Она характеризуется хорошей эффективностью, стабильностью к условиям агресивных сред, термостабильностью.

Преимуществами разработанной методики являются скорость, однозначность результатов и диапазон применения (от 5 % до 130 % от ожидаемой концентрации целевых веществ в растворе). Такой широкий диапазон значений концентраций позволяет использовать данную методику как для исследования кинетики растворения и при проведении теста сравнительной кинетики растворения, так и для определения предельно допустимых уровней загрязнений производственного оборудования (ПДУЗ) и сточных вод. Это доказывает, что разработанная методика подходит для решения различных задач фармацевтического производства. Кроме того, она соответствует требованиям современного хроматографического анализа - скорости и экономичности.

В ходе подготовки статьи были проведены необходимые исследования для подтверждения валидности методики, были учтены все основные требования государственной фармакопей РФ. Хроматограммы, приведенные в статье доказывают селективность методики. Рассчитаны стандартное отклонение площадей пиков эфавиренза, относительное стандартное отклонение по 5 хроматограммам стандартного раствора, а также коэффициент корреляции, доказывающий линейность методики. Кроме того, был проведен анализ прецизионности (сходимости и внутрилабораторной прецизионности) аналитической методики, статистическая оценка была проведена с использованием F-критерия Фишера и t-критерия Стьюдента.

Работоспособность данного метода охарактеризована следующими параметрами: фактор ассиметрии пика, число теоритических тарелок (ЧТТ), относительное стандартное отклонение.

На основе полученных данных сделано заключение о работоспособности методики.

Ключевые слова: эфавиренз, ВЭЖХ, количественное определение.

Annotation

хроматографический эфавиренз жидкостный лекарственный

DETERMINATION OF THE QUANTITATIVE CONTENT OF EFAVIRENZ BY HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH AN ULTRAVIOLET DETECTOR

O. Yu. Zakhoda, N. P. Sadchikova, N. B. Demina, S. A. Zolotov, A. S. Zolotova, I. I. Krasnyuk

AMEDART, LLC

First Mosco^w State Medical University

«Farm-Sintez Lab» LLC

This article is the result of the development of a method for the quantitative determination of efavirenz using high-performance liquid chromatography (HPLC) in medicinal products.

To achieve optimal system suitability parameters, data were analyzed with using more than 10 chromatographic columns under different chromatographic conditions. Available literature has been analyzed too, including from foreign sources of information. The best result is achieved when using the Zorbax SB-CN chromatographic column, a silica column chemically modified with nitrile groups. it is characterized by good efficiency, stability to aggressive media conditions, and thermal stability.

The advantages of the developed method are the speed, unambiguity of the results and the range of application (from 5 % to 130 % of the expected concentration of the target substances in the solution). This wide range of concentration values makes it possible to use this technique both for studying the dissolution kinetics and for conducting a comparative dissolution kinetics test, and for determining the maximum permissible levels of contamination of production equipment (PDUZ) and wastewater. This proves that the developed method is suitable for solving various problems of pharmaceutical production. In addition, it meets the requirements of modern chromatographic analysis-speed and efficiency.

During the preparation of the article, the necessary studies were carried out to confirm the validity of the method, and all the main requirements of the state Pharmacopoeia of the Russian Federation were taken into account. The chromatograms given in the article prove the selectivity of the method. The standard deviation of the efavirenz peak areas, the relative standard deviation for 5 chromatograms of the standard solution, and the correlation coefficient proving the linearity of the method were calculated. In addition, an analysis of the precision (convergence and intra-laboratory precision) of the analytical technique was performed, and a statistical evaluation was performed using the Fisher F-test and the student t-test.

The efficiency of this method is characterized by the following parameters: the peak asymmetry factor, the number of theoretical plates (CHT) and the relative standard deviation.

Based on the data obtained, a conclusion was made about the efficiency of the method.

Keywords: efavirenz, HPLC, quantitative determination.

Основная часть

Распространение ВИЧ-инфекции в мире остаётся серьёзной научной, медицинской и социально-экономической проблемой [1]. Одним из противовирусных средств, рекомендованных для системного применения при терапии ВИЧ, является эфавиренз [2] [3] [4] [5] Т» ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы.

Эфавиренз выпускается в капсулах, таблетках, покрытых оболочкой.

Лекарственное средство представлено в Фармакопее США (2006) [6].

Установление количественного содержания эфавиренза в лекарственных препаратах может быть осуществлено различными методами колориметрии [7], тонкослойной хроматографией [8], спектрофотометрии [9], масс-спектрометрии [10] [11].

Отдельно отметим методы ВЭЖХ с детектором УФ, как наиболее близкие к нашему методу. Анализ многокомпонентной смеси, включающей эфавиренз [12], анализ эфавиренза с внутренним стандартом [13], селективный анализ эфавиренза на длинной хроматографической колонке с относительно большим временем удерживания [14] [15], относительно короткие методики анализа [16].

Метод УФ-спектрофотометрии рекомендован Ф США [17] для определения эфавиренза в среде растворения при оценке его высвобождения из таблеток. Метод актуален только при условии, что раствор не содержит других компонентов, мешающих проведению анализа. Установление количественного содержания лекарственного вещества осуществляется одновременно с испытанием на посторонние примеси методом ВЭЖХ. С точки зрения экономии времени желательно использовать экспресс-метод определения количественного содержания лекарственного средства, это помогает свести к минимуму простои производства между технологическими стадиями. Методика Ф США неприемлема для решения различных аналитических задач в условиях фармацевтического производства: определение предельно допустимых уровней загрязнений производственного оборудования (ПДУЗ), сточных вод, исследовании кинетики растворения и проведении теста сравнительной кинетики растворения.

Нами изучены условия ВЭЖХ анализа эфа- виренза для оптимизации методики его количественного определения при контроле качества препарата, целевого продукта на технологических стадиях производства с целью сокращения временных и материальных затрат на производство препарата.

Методика эксперимента

Материалы

Эфавиренз стандартный образец (USP № 1234103), додецилсульфат натрия (Panreac № 132363, for analysis), метанол (Macron № 6712-25, for HPLC), вода для ВЭЖХ, трифторуксусная кислота (Sigma-Aldrich № 302031, for HPLC).

Оборудование

Хроматограф Shimadzu LC-20 Prominence c УФ- спектрофотометрическим детектором SPD-20А.

Хроматографические условия

Колонка хроматографическая Zorbax SB-CN 150x4.6 мм, 5 мкм (Agilent № 883975-905). Подвижная фаза А: метанол - трифторуксусная кислота -вода (200:1:1800 по объёму). Подвижная фаза Б: метанол - трифторуксусная кислота - вода (1800:1:200 по объёму); Режим элюирования: изо- кратический (ПФ А:ПФ Б - 41:59); Скорость потока: 1.5 мл/мин; Температура термостата колонок: 40 °С; Объём вводимой пробы: 20 мкл; Длина волны детектирования: 250 нм; Время анализа: 6 минут.

Приготовление стандартного раствора

Около 30 мг стандартного образца эфавиренза помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 1 мл метанола для ускорения растворения эфавиренза, перемешивают до полного растворения, доводят объём раствора 2.0 % раствором натрия додецилсульфата до метки и перемешивают. 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объём раствора до метки 2.0 % раствором натрия додецилсульфата и перемешивают. Концентрация эфавиренза в растворе около 0.012 мг/мл.

Приготовление разбавленного стандартного раствора

1 мл стандартного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объём раствора 2.0 % раствором натрия додецилсульфата до метки и перемешивают. Концентрация эфа- виренза в растворе около 0.0012 мг/мл.

Приготовление испытуемого раствора

В зависимости от целей и задач испытуемый раствор разводят в концентрации 0.012 мг/мл 2.0 % раствором натрия додецилсульфата и перемешивают до полного растворения испытуемого образца. Например, в испытании по тесту «Растворение» таблеток дозировкой 600 мг предусмотрено использование 1000 мл 2.0 % раствора натрия додецилсульфата. Для количественного определения эфавиренза в среде растворения. Пробу фильтруют через шприцевой фильтр Вла- дипор МФФК-3Г с диаметром пор 0.45 мкм. 2 мл фильтрата разводят в 100 мл 2.0 % раствора натрия додецилсульфата, перемешивают и хроматографируют.

Обсуждение результатов

В соответствии с существующими требованиями аналитическая методика, применяемая для контроля качества лекарственного средства, должна быть валидирована [18] [19] [20].

Разработанная методика была валидирована по следующим параметрам:

1. Селективность

2. Аналитиче ская область

3. Линейность

4. Правильность

5. Прецизионность

Селективность методики

Селективность методики оценивали на основании сопоставления хроматограмм стандартного раствора эфавиренза, растворителя и плацебо при длине волны 250 нм.

Отсутствие на хроматограммах растворителя и плацебо пиков с временем удерживания, соответствующим времени удерживания пика эфа- виренза подтверждает специфичность методики (см. рисунок 1-3).

Рис. 1 Хроматограмма растворителя

Рис. 2 Хроматограмма плацебо

Линейность и аналитическая область методики

Концентрация эфавиренза в растворе стандартов (0.012 мг/мл) была принята равной ожидаемой

Рис. 3 Хроматограмма стандартного раствора эфавиренза

концентрации действующего вещества в пробе Область аналитической методики была провали- дирована в диапазоне от 5% до 130% от ожидаемой концентрации целевых веществ в растворе.

Исследование аналитической области проводилось одновременно с исследованием линейности. Результаты приведены в таблице 1.

Для установления линейности были приготовлены растворы из модельной смеси (для приготовления модельной смеси была выбрана смесь вспомогательных веществ препарата Стокрин (активное вещество: эфавиренз 600 мг; вспомогательные вещества: гипролоза, магния стеарат, микрокристаллическая целлюлоза, натрия кро- скармеллоза, лактозы моногидрат, натрия лаурилсульфат; состав оболочки: Опадрай желтый (Opadry® Yellow), в состав которого входят титана диоксид (Е171), гипромеллоза 6сР (НРМС 2910), воск карнаубский, макрогол (PEG400), краситель железа оксид желтый (Е172)) на 8 уровнях концентрации анализируемого вещества (5%, 20%, 50%, 80%, 90%, 100%, 110%, 130%).

Полученные значения приведены в таблице 2.

На рисунке 4 представлена линейная зависимость площади пика эфавиренза от концентрации раствора (мкг/мл).

Установлено, что линейность соблюдается в интервале концентраций: от 5 до 130 %.

Прецизионность

Прецизионность была исследована в двух вариантах:

1. Сходимость

2. Внутрилабораторная прецизионность

Таблица 1

Результаты оценки аналитической области методики