Влияние антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 на поведение крыс в тестах "Открытое поле", "Темно-светлая камера" и "Лабиринт Барнс"

Размещено на http://www.allbest.ru

ФГАОУ ВО «Самарский национальный исследовательский университет им. академика С.П. Королева» Адрес: 443086, Россия, г. Самара, Московское ш., д. 34

Влияние антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 на поведение крыс в тестах "Открытое поле", "Темно-светлая камера" и "Лабиринт Барнс"

Ткачева М.А., учебный мастер кафедры физиологии человека и животных

Инюшкина Е.М., доцент кафедры физиологии человека и животных

Шарафутдинова А.Ю., аспирант кафедры физиологии человека и животных

Анцырев Я.А., бакалавр кафедры физиологии человека и животных

Инюшкин А.Н., д.б.н., профессор, зав. кафедрой физиологии

человека и животных

Аннотация

Недавно открытый эндогенный пептид кисспептин является регулятором репродукции. Поскольку в реализации эффектов кисспептина центральную роль играют GRP-54 рецепторы, целью настоящей работы на самцах крыс было исследование влияния интраназального введения специфического антагониста этих рецепторов р-234 (0,1 мМ) на показатели поведения в стандартных тестах «Открытое поле», «Темно-светлая камера» и «Лабиринт Барнс». В поведенческой установке «Открытое поле» после введения антагониста кисспептиновых рецепторов выявлено снижение медианы показателя «Длительный груминг», в установке «Темно-светлая камера» обнаружено увеличение количество подъемов на задние лапы и заходов в темный отсек. Данные изменения поведения свидетельствуют о стимуляции некоторых аспектов исследовательского поведения в условиях блокады кисспептиновых рецепторов, причем эти реакции реализуются через рецепторы GPR-54.

Ключевые слова: антагонист кисспептиновых рецепторов р-234, поведение, нейропептиды

Summary

Samara National Research University named after S.P. Korolev, Federal State Educational Institution of Higher Education

Address: 443086, Russia, Samara, Moskovskoe highway, 34

Tkacheva M.A., Study Master of the Dept. of Animal and Human Physiology.

In'ushina E.M., Associate Professor of the Dept. of Animal and Human Physiology.

Sharafutdinova A.Yu., Post-Graduate Student of the Dept. of Animal and Human Physiology.

Antcyrev Y.A., Bachelor of the Dept. of Animal and Human Physiology.

In'ushin A.N., Doctor of Biology Science, Professor, Head of the Dept. ofAnimal and Human Physiology.

KISSPEPTIN P-234 RECEPTOR ANTAGONIST INFLUENCE AT BEHAVIOR OF RATS IN TESTS "OPENFIELD", "DARK-LIGHTCAMERA" AND "LABIRINTHBARNS"

The newly discovered endogenous neurochemical regulator kisspeptin is a reproduction regulator. Since GRP- 54 receptors play a central role in realizing effects of kisspeptin, the purpose of this work at male rats was to study specific p-234 receptor antagonist (0.1 mM) intranasal injection effect on behavioral indicators in standard tests “Open Field”, “Dark - Light camera” and “Labyrinth Barnes”. The indicator "Long grooming" decreasing was found after kisspeptide receptors antagonist injection in behavioral installation "Open Field", increasing in the number of hind legs and hikes into dark camera was detected in installation "Dark - Light Camera". These behavioral changes suggest the stimulation of certain aspects of exploratory behavior under kisspeptin receptors block, and these reactions are realized through GPR-54 receptors.

Key words: kisspeptin p-234 receptor antagonist, behavior, neuropeptides

Введение

В настоящее время не подвергается сомнению ключевая роль гипоталамической секреции гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) в контроле репродуктивной функции у млекопитающих. В то же время при изучении нейронной сети ГнРГ клеток в начале 90-х годов были обнаружены особенности, позволяющие говорить о её функциональной ограниченности. В частности, у крыс в этих клетках не было обнаружено экспрессии специфического эстрогеннового альфа-рецептора, что предполагало существование промежуточного пути передачи сигнала обратной связи от гонад. Основой для революционного пересмотра существовавших представлений о нейроэндокринной регуляции репродукции у млекопитающих и человека послужило открытие нового эндогенного регулятора - нейропептида кисспептина. В 1996-м г. был идентифицирован ген KISS1 [7]. В 1999-м г. был открыт его рецептор, ассоциированный с G-протеином, и соответствующий ген на Ch19p13, а в 2001-м г. был охарактеризован белковый продукт гена KISS1R [6, 8]. Первое время после открытия кисспептина он носил название «метастин», и его изучали в качестве эндогенного ингибитора метастатической активности опухолей. Впервые догадки о том, что кисспептин может участвовать в процессах эндокринной регуляции репродукции, возникли в связи с обнаружением экспрессии кисспептиновых рецепторов KISS1R в плаценте, аденогипофизе и гипоталамусе. Кисспептиновая сигнализация играет исключительную роль в активации секреции ГнРГ. Уровень продукции ГнРГ, в свою очередь, определяет выраженность влияния последнего на переднюю долю гипофиза. Данное влияние включает в себя регуляцию продукции лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Эти гонадотропные гормоны стимулируют половое созревание и гаметогенез.

В соответствии с принципом плейотропности, характерным для подавляющего большинства нейропептидов, наряду с участием в центральных механизмах контроля фертильности и репродукции, кисспептин вовлечен в регуляцию других физиологических функций. В частности, доказано участие кисспептина в регуляции гомеостаза энергии на уровне аркуатного ядра, при этом данный пептид активно взаимодействует с лептином [9]. Имеются данные о том, что экспрессия гена Kiss1 в гиппокампе лежит в основе участия кисспептина в регуляции когнитивных функций и эпилептогенеза [1]. Однако роль и механизмы участия кисспептина в регуляции поведения пока практически не исследованы. Имеются лишь отдельные указания на возможное участие этого пептида в регуляции памяти и исследовательского поведения [4].

В ходе настоящей работы изучали влияние интраназального введения антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 на исследовательское поведение и уровень тревожности у самцов крыс вистар в стандартных тестах «Открытое поле», «Темно-светлая камера» и «Лабиринт Барнс».

1. Материалы и методы

Все экспериментальные протоколы были согласованы и одобрены комиссией по биологической этике Самарского национального исследовательского университета имени академика С.П. Королева. Было исследовано по 6 животных контрольной и экспериментальной группы крыс самцов вистар (массой 240-270 г). До и во время эксперимента все животные содержались в виварии биологического факультета Самарского университета и получали пищу и питьевую воду ad libitum. Животные содержались в условиях суточного режима освещения (свет/темнота) 12:12 ч. Экспериментальным животным интраназально в объёме 10 мкл и в концентрации 0,1 мМ вводили антагонист кисспептиновых рецепторов р-234. Вещество вводили троекратно (в течение трёх последовательных суток) в первую половину циркадианного дня в ZT=2-6 (ZT=0 соответствует моменту включения освещения при световом режиме 12:12 часов). Контрольной группе крыс вводили интраназально воду для инъекций в объёме 10 мкл в соответствии с графиком для экспериментальной группы. Экспериментальная методика интраназального введения веществ даёт возможность их быстрого проникновения непосредственно в головной мозг в значительной концентрации вдоль обонятельных и тройничных нервов, минуя гематоэнцефалический барьер [5]. При этом вводимое вещество практически не попадет в кровоток [2], что дает возможность изучать центральные эффекты изолированно от периферических, возникающих при системном введении. Через 15 мин после интраназального введения антагониста кисспептина крысу помещали в установку «Открытое поле», «Тёмно-светлая камера» или «Лабиринт Барнс» и в течение 10-ти мин производили видеорегистрацию поведения. Для регистрации перемещений животных осуществляли видео-трекинг с использованием камеры Panasonic fullhd hc-x810, установленной на штатив. Регистрация и первичная статистическая обработка исследуемых параметров поведения производилась с помощью программы ANY-maze 4.99. Последующая обработка данных производилась с использованием программы SigmaPlot 12.5. Для оценки различий исследуемых показателей в ходе экспериментальных воздействий использовали t-тест или тест Манна-Уитни. Нормальность распределения данных в выборках проверяли с помощью теста Левена. Статистические данные о значениях параметров, соответствующих нормальному распределению, были представлены как средние арифметические ± стандартные ошибки среднего. Изменения исследуемых параметров считались статистически значимыми при р<0,05.

В тестовой методике «Открытое поле» были зарегистрированы следующие характеристики поведения: количество посещенных квадратов, исследование отверстий, обнюхивание, длительный груминг (умывание области глаз с заведением лап за уши и переходом на умывание всей головы, лап, боков, туловища, ано-генитальной области, хвоста). В тесте «Тёмно-светлая камера» регистрировали количество заходов в темный отсек, количество подъемов на задние лапы. В тестовой методике «Лабиринт Барнс» регистрируемыми параметрами были: груминг, обследование ложных убежищ, время нахождения истинного убежища, обнюхивание отверстий, число вертикальных стоек, седация.

2. Результаты исследований

В исходном состоянии исследуемые показатели поведения в стандартных тестах у животных контрольной и экспериментальной групп не различались (Р>0,05).

В поведенческой установке «Открытое поле» в условиях интраназального введения антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 были получены следующие данные.

Изменений количества посещённых квадратов обнаружено не было (Р>0,05). Было выявлено снижение медианы количества актов длительного груминга (P=0,021, рис. 1).

Рис. 1 Влияние интраназального введения антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 на поведенческий параметр «Длительный груминг»

У животных контрольной и экспериментальной групп не было обнаружено статистически значимых различий значения параметра «Исследование отверстий» и параметра «Обнюхивание» (Р>0,05).

В поведенческой установке «Темно-светлая камера» при интраназальном введении 0,1 мМ антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 были получены следующие данные.

Количество заходов в тёмный отсек у животных экспериментальной группы оказалось большим, чем у животных контрольной группы (р=0,002, рис. 2).

Рис. 2 Влияние интраназального введения антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 на поведенческий параметр «Количество заходов в тёмный отсек».

Одновременно после интраназального введения антагониста увеличилось количество подъемов на задние лапы по сравнению с контролем (Р=0,034, рис. 3).

Рис. 3 Влияние интраназального введения антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 на поведенческий параметр «Количество подъемов на задние лапы».

В поведенческой установке «Лабиринт Барнс» при интраназальном введении антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 не были обнаружены статистически значимые изменения поведенческих параметров. Сравнение параметров «Обследование ложных убежищ», «Количество вертикальных стоек», «Обнюхивание отверстий», «Седация» не выявило различий между контрольной и экспериментальной группами животных (Р>0,05). Время нахождения истинного убежища также не изменялось в условиях блокады кисспептиновых рецепторов, несмотря на тенденцию к увеличению (P=0,414).

3. Обсуждение результатов

В настоящей работе на самцах крыс выявлены основные изменения поведенческой активности животных, возникающие в условиях блокады кисспептиновых рецепторов.

В частности, в поведенческой установке «Открытое поле» при интраназальном введении антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 выявлено снижение медианы показателя «Длительный груминг», в установке «Темно-светлая камера» обнаружено увеличение количество подъемов на задние лапы и заходов в темный отсек. Данные изменения поведения свидетельствуют о стимуляции некоторых аспектов исследовательского поведения в условиях блокады кисспептиновых рецепторов. Эти данные согласуются с результатами исследования на самцах мышей с нокаутом кисспептиновых рецепторов, у которых также было обнаружено снижение уровня тревожности и стимуляция исследовательского поведения в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» [3]. В другой работе, выполненной на самках крыс, было выявлено увеличение времени поиска истинного убежища в лабиринте Барнс под действием хронической инфузии антагониста кисспептиновых рецепторов [4]. В ходе настоящей работы с интраназальным введением антагониста статистически значимых изменений данного показателя установить не удалось, несмотря на его тенденцию к увеличению. В целом полученные результаты в совокупности с данными других работ подтверждают участие элементов кисспептиновой системы мозга в регуляции поведения. Данные настоящей работы свидетельствуют о том, что блокада центральных рецепторов кисспептина приводит к стимуляции исследовательской активности, причем эти реакции реализуются через рецепторы GPR54.

Выводы

антагонист кисспептиновый рецептор биологический

Установлено, что антагонист кисспептиновых рецепторов р-234 при интраназальном введении самцам крыс вызывает стимуляцию исследовательского поведения.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 18-34-00542 «Исследование роли антагониста кисспептина (Р-234) в регуляции биологических ритмов у крыс».

Список литературы

1. Arai A.C. The role of kisspeptin and GPR54 in the hippocampus // Peptides. 2009. № 30. Р. 16-25.

2. Born J. Sniffing neuropeptides: a transnasal approach to the human brain / J. Born, T. Lange, W. Kern [et al.] // Nat. Neurosci. 2002. №5. Р. 514-516.

3. Delmas S. Altered aspects of anxiety-related behavior in kisspeptin receptor-deleted male mice / S. Delmas, R. Porteous, D. H. Bergin [et al.] // Sci. Reports. 2018. № 8. Р. 2794.

4. Eyuboglu Dinc S. Effects of chronic infusion of kisspeptin and its antagonist on cognitive functions and behavior in female rats / S. Eyuboglu Dinc, S. Canpolat,

H. Akkaya [et al.] // Proc. Physiol. Soc. Proc 37th IUPS, PCC161. 2014. № 8. Р. 373-377.

5. Frey W.H. Bypassing the blood-brain barrier to deliver therapeutic agents to the brain and spinal cord // Drug Deliv. Tech. 2002. № 2. Р.46-49.

6. Lee D.K. Discovery of a receptor related to the galanin receptors / D. K. Lee, T. Nguyen, G. P. O'Neill [et al.] // FEBS Lett. 1999. № 446. Р.103-107.

7. Li G. Mapping Longitudinal Development of Local Cortical Gyrification in Infants from Birth to 2 Years of Age / G. Li, L. Wang, F. Shi [et al.] // J. Neurosci. 2014. № 34. Р. 4228-4238.

8. Ohtaki T. Metastasis suppressor gene KiSS-1 encodes peptide ligand of a G-protein-coupled receptor / T. Ohtaki, Y. Shintani, S. Honda [et al.] // Nature. 2001. №411 (6837). Р. 613-617.

9. Smith J.T. KiSS-1 neurones are direct targets for leptin in the ob/ob mouse / J.T. Smith, B.V. Acohido, D.K. Clifton [et al.] // J. Neuroendocrinol. 2006. № 18. Р. 298-303.

Размещено на Allbest.ru