Влияние наночастиц высокодисперсного кремнезёма на апоптоз в нативных и девитрифицированных клетках гранулёзы Bos taurus
Анализ причин интенсификации фундаментальных исследований в области физиологии женской гаметы млекопитающих. Анализ особенностей использования кокультуры или монослоя клеток гранулёзы овариальных фолликулов животных в клеточных репродуктивных технологиях.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | статья |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 25.06.2021 |
| Размер файла | 662,7 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ ВЫСОКОДИСПЕРСНОГО КРЕМНЕЗЁМА НА АПОПТОЗ В НАТИВНЫХ И ДЕВИТРИФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ ГРАНУЛЁЗЫ BOS TAURUS
THE EFFECT OF HIGHLY DISPERSED SILICA NANOPARTICLES ON APOPTOSIS IN NATIVE AND DEVITRIFIED BOS TAURUS GRANULOSA CELLS
гамета женский млекопитающий фолликул
Кузьмина Татьяна Ивановна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией биологии развития, главный научный сотрудник.
Kuzmina Tatiana Ivanovna, Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of the Laboratory of Developmental Biology, Chief researcher,
Чистякова Ирэна Валерьевна, младший научный сотрудник лаборатории биологии развития.
Chistiakova Irena Valeryevna, Junior researcher of Laboratory of Developmental Biology
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных филиал федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»
All-Russian researcher Institute of genetics and breeding of farm animals is a branch of Federal state budget scientific institution “Federal scientific center for animal husbandry VIZH named after of academician L. K. Ernst”
Аннотация
Использование кокультуры или монослоя клеток гранулёзы овариальных фолликулов животных в клеточных репродуктивных технологиях обусловлено их большой значимостью при росте и созревании ооцитов in vivo. Сохранность клеток гранулёзы после обработки сверхнизкими температурами (витрификация) детерминирует «качество» среды для культивирования ооцит-кумулюсных комплексов. В настоящем исследовании в сравнительном аспекте проанализированы апоптотические процессы (TUNEL-тест) в нативных и девитрифицированных клетках гранулезы из фолликулов Bos taurus. При использовании наночастиц высокодисперсного кремнезема (ВДК, концентрация 0,001 %) в составе криопротекторных и культуральных сред доля апоптотических клеток в популяции девитрифицированных гранулезных клеток через 24 и 48 часов культивирования снизилась c 61 до 38 %, P<0.001, и с 78 до 45 %, P<0.001, соответственно. Таким образом, анализ результатов проведенных экспериментов выявил положительный эффект наночастиц ВДК на статус хроматина нативных и девитрифицированных клеток гранулёзы коров при пролонгированном культивировании, что позволяет рекомендовать использование наночастиц ВДК при витрификации и культивировании соматических и половых клеток овариальных фолликулов.
Summary
The usage of co-culture or monolayer of granulosa cells from ovarian animal follicles in cellular reproductive technologies is due to their great importance in growth and maturation of oocytes in vivo. The safety of granulosa cells after treatment by ultralow temperatures (vitrification) determines the “quality” of medium for culture of oocyte-cumulus complexes. In the present study, the apoptotic processes (TUNEL test) in native and devitrfied granulosa cells from the follicles of Bos taurus were analyzed in a comparative aspect. In case of use of highly dispersed silica (HDS, concentration 0.001 %) nanoparticles in cryoprotective and cultural media, the proportion of apoptotic cells in the population of devitrified granulosa cells after 24 and 48 hours of culture decreased from 61 to 38 %, P <0.001 and from 78 to 45 %, P <0.001, respectively. So the analysis of experimental results revealed a positive effect of HDS nanoparticles on the chromatin status of native and devitrified bovine granulosa cells during the prolonged culture, which implies the use of HDS nanoparticles for vitrification and culture of somatic and germ cells of ovarian follicles.
Введение
Интенсификация фундаментальных исследований в области физиологии женской гаметы млекопитающих определяется необходимостью совершенствования инновационных клеточных репродуктивных и ДНК-технологий (получение эмбрионов in vitro, клонирование, трансгенез, редактирование генома) [9]. В основе вышеперечисленных технологий лежит метод созревания донорских ооцитов in vitro. Несмотря на значительные успехи в технологии экстракорпорального созревания ооцитов коров, выход развившихся из них эмбрионов на протяжении многих лет составляет не выше 40% [7]. Одной из важнейших задач технологии экстракорпорального созревания и оплодотворения создание системы культивирования, адекватно отражающей условия формирования гаметы in vivo. Известно, что использование кокультуры клеток гранулезы при дозревании донорских ооцитов in vitro значительно повышает выход эмбрионов на стадии бластоцисты [6]. Ядра клеток гранулезы используются в качестве донорских в технологии клонирования [8]. Фундаментальные исследования стероидогенеза подразумевает долгосрочное культивирование гранулезных клеток, а использование клеток гранулезы в качестве тест-системы цитои генотоксичности различных реагентов обуславливает использование культуры этих клеток в фармакологии. Понятно, что хранение, в том числе и долгосрочное (криоконсервация) клеток гранулезы, с сохранением их жизнеспособности позволит значительно повысить эффективность вышеперечисленных биотехнологий и сопутствующих им методов. Определяющую роль в технологии витрификации клеток играют состав криопротекторов.
Высокодисперсный кремнезём (ВДК) аморфная форма диоксида кремния с размером частиц от 4 до 40 нм. Включение наночастиц ВДК (нВДК) в состав криопротекторных агентов может повысить эффективность витрификации за счет изменения свойств растворов, обусловленных структурой и свойствами высокодисперсного кремнезема. Ранее выявлено положительное воздействие наночастиц ВДК в концентрации 0,001 % на жизнеспособность декриоконсервированных сперматозоидов быков, развитие доимплантационных эмбрионов коров, свиней [1, 5]. Цель настоящего исследования идентифицировать эффекты наночастиц ВДК на уровень апоптозов в нативных и девитрифицированых клетках гранулезы коров.
Материал и методы
Клетки гранулезы, использованные в экспериментах, были выделены из антральных фолликулов яичников коров диаметром 3-6 мм, с высоким тургором и обширной васкуляризацией. Взвесь клеток обрабатывали тремя растворами криопротекторов (КПА), приготовленными на среде ТС-199 с 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС, HyClone, Logan, UT). КПА-1: 0.7 M диметилсульфоксид (ДМСО) + 0.9 M этиленгликоля (ЭГ); КПА-2: 1.4 M ДМСО + 1.8 M ЭГ; КПА-3: 2.8 M ДМСО + 3.6 M ЭГ + 0.65 M трегалозы. В каждый раствор криопротекторов вносили по 0,001 % нВДК. Осадок клеток гранулезы после отмыва в фосфатно-солевом буфере поэтапно экспонировали в течение 3 мин в КПА-1, затем в КПА-2 и 5 минут в КПА-3. Перед каждой обработкой растворами криопротекторов клетки центрифугировали при 300 об/мин в течение 60 секунд при комнатной температуре. Криопробирки с заключительной порцией осадка клеток гранулезы помещали в жидкий азот.
В процессе размораживания пробирки, содержащие витрифицированные клеточные осадки, помещали в водяную баню (37°С) и инкубировали в течение 120 с. Затем клетки поэтапно помещали в три раствора с различными концентрациями трегалозы, приготовленными на основе ТС-199: 0,25 М на 3 минуты, затем отмывали в 0,19 М (3 минуты), и далее в 0,125 М трегалозе (3 минуты), окончательно дважды отмывали в ТС-199 с 10 % ФБС. Каждый этап отмывания включал 60-секундное центрифугирование при 300 об/мин. Культивирование клеток проводили при температуре 38,5°C в атмосфере, содержащей 5 % СО2 в течение 48 часов в среде следующего состава: ТС199 + 10 % фетальной бычьей сыворотки + 50 нг/мл пролактина, 10 мкг/мл гентамицина [3]. Концентрация клеток гранулезы составляла 106 клеток гранулезы на мл среды. В опытные группы сред для культивирования добавляли наночастицы 0,001 % ВДК (марка А200оС, институт химии поверхности им. Чуйко, НАН Украины). В отборе концентраций руководствовались указанными разработчиками [2].
Анализу клеток на апоптоз подвергали нативные клетки гранулезы (до культивирования), нативные клетки гранулезы, обработанные и необработанные нВДК (контроль 1 и 2), девитрифицированные клетки гранулезы, обработанные и необработанные нВДК (опыт 1 и 2). Определение апоптозов в гранулезе, проводили перед культивированием через 24 и 48 часов в следующей последовательности. Клетки гранулезы помещали на покрытые poly-L-lysine предметные стекла и подсушивали на воздухе. Далее проводили фиксацию в растворе формалина в течение 30 минут и промывание в фосфатно-буферном растворе (ФБР). Затем клетки выдерживали в течение 2 минут в 10 % растворе Тритона Х -100 на 0,1 % цитрате натрия и повторно отмывали в ФБР. Затем экспонировали клетки с реактивом TUNEL (Kit from Boehringer Mannheim Cat.No. 1684795) и инкубировали в темноте в течение 60 минут при 37°С. После инкубации клетки промывали в растворе ФБР и экспонировали в растворе пропидиума иодида (1 мг/мл), и вновь промывали в ФБР, оставляли в темноте при комнатной температуре на 1 час, затем помещали в холодильник и хранили в горизонтальном положении. Образцы анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Carl Zeiss Axio Imager A 2m.
Результаты обрабатывали с помощью статистической программы Sigma Stat. Все использованные в исследовании реагенты, за исключением обозначенных, производства фирмы Sigma-Aldrich. Пластиковая лабораторная посуда фирмы BD Falcon™. Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значимости: P<0.05; P<0.01; P<0.001 для 3-5 независимых экспериментов с помощью критерия X2.
Результаты исследований
Исследования проводили в соответствии со схемой, представленной на рисунке 1.
Рис. 1. Структурно-логическая схема экспериментов.
Введение наночастиц ВДК в состав криопротекторных и культуральных сред способствовало снижению доли клеток в состоянии апоптоза на всех этапах культивирования, так, после замораживания/оттаивания в контрольных девитрифицированных (необработанных наночастицами ВДК) клетках доля апоптотических клеток достигла 51 % против 33 % в опыте (рис. 2, P<0.001).
Рис. 2. Влияние наночастиц высокодисперсного кремнезема на уровень апоптоза в нативных и девитрифицированных клетках гранулезы овариальных фолликулов коров (TUNEL-test). Достоверность сравниваемых значений (критерий %2):a:c; a:d; b:c; b:d; c:dP<0.001.
Уровень апоптозов через 24 часа культивирования в контрольных нативных клетках составил 22 %, в опытных 15 %, в контрольных девитрифицированных клетках выше обозначенный показатель составил 61 % против 38 % в опытной группе (рис. 3, P<0.001).
Рис. 3. Влияние наночастиц высокодисперсного кремнезема на уровень апоптоза в нативных и девитрифицированных клетках гранулезы овариальных фолликулов коров (24 часа культивирования, TUNEL-test). Достоверность сравниваемых значений (критерий X2).a:c; a:d; b:c; b:d; c:dp<0 001
В девитрифицированных клетках гранулёзы доля апоптотических клеток значительно превышало таковую в нативных клетках на всех исследованных временных промежутках (24 часа: контроль 22 % против 61 %; опыт 15 % против 38 %; 48 часов: контроль 33 % против 78 %; опыт 21 % против 45 %, P<0.001, рис. 2-4).
Рис. 4. Влияние наночастиц высокодисперсного кремнезема на уровень апоптоза в нативных и девитрифицированных клетках гранулезы овариальных фолликулов коров (48 часов культивирования, TUNEL-test). Достоверность сравниваемых значений (критерий ^2):a:bP<0.01; a:c; a:d; b:c; b:d; c:dP<0.001
На рис. 4 представлены результаты анализа деструктивных процессов в нативных и девитрифицированных клетках гранулёзы через 48 часов культивирования. Использование наночастиц ВДК в составе криопротекторных и культуральных сред обеспечило снижение уровня апоптозов, как в нативных, так и в девитрифицированных клетках. В нативных клетках через 48 часов культивирования уровень апоптозов составил 33 % (контроль) против 21 % (опыт), а в девитрифицированных ооцитах снизился с 78 % (контроль) до 45 % (опыт), P<0.001.
Обсуждение
Использование кокультуры или монослоя клеток гранулёзы овариальных фолликулов животных в клеточных репродуктивных технологиях обусловлено их большой значимостью при росте и созревании ооцитов in vivo. Гранулёза продуцент стероидов, вовлеченных в приобретение ооцитом компетентности к оплодотворению и формированию эмбрионов. Кроме того, гранулезные клетки участвуют в реализации эффектов многих гипофизарных гормонов при культивировании in vitro [6]. Понятно, что сохранность клеток гранулёзы после обработки сверхнизкими температурами в значительной степени обеспечит «качество» среды для культивирования женских гамет. Ранее в наших исследованиях выявлены положительные эффекты наночастиц ВДК на сохранность нативных клеток гранулёзы свиней, что выражалось в снижении уровня апоптозов (метод проточной цитофлуориметрии), увеличении количества жизнеспособных клеток и снижении доли клеток с пикнотическими ядрами [4]. В настоящем исследовании в сравнительном аспекте проанализированы деструктивные процессы (апоптоз) в нативных и подвергшихся воздействию сверхнизких температур (витрификация) клетках гранулёзы коров до и после культивирования при введении в состав криопротекторных и культуральных сред наночастиц ВДК. В целом анализ результатов проведенных исследований выявил положительный эффект наночастиц ВДК на статус хроматина нативных и девитрифицированных клеток гранулёзы коров при их культивировании до 48 часов, что позволяет рекомендовать использование наночастиц ВДК в технологии экстракорпорального созревания ооцитов коров (время созревания гамет in vitro 24 часа). Увеличение количества жизнеспособных клеток обеспечит их функциональную активность и необходимую продукцию биологически активных веществ, вовлеченных в процессы формирования яйцеклетки.
Заключение
Совершенствование клеточных репродуктивных технологий, базовой технологией которых является технология экстракорпорального созревания ооцитов in vitro, зависит от создания унифицированных методов культивирования половых и соматических клеток овариальных фолликулов, создания систем созревания с использованием структурных компонентов фолликулов и, прежде всего, гранулёзы. Модернизация сред культивирования и этапов технологии витрификации с использованием наночастиц вызывает необходимость оценки характера их воздействия на клетки. В настоящем исследовании в результате воздействия наночастиц ВДК (концентрация 0,001 %) выявлены эффекты снижения уровня апоптоза в нативных и девитрифицированных клетках гранулёзы при пролонгированном культивировании до 48 часов, что свидетельствует о целесообразности их включения в состав криопротекторных и культуральных сред.
Список литературы
1. Бойцева Е. Н. Влияние наночастиц высокодисперсного кремнезема на апоптоз сперматозоидов Bos taurus. / Е. Н. Бойцева, Н. В. Бычкова, Т. И. Кузьмина // Цитология, 2017, т. 59, № 5, с. 375-380.
2. Зюзюн А. Б. Застосування наноматеріалу в ембріогенетичній системі in vitro отримання ембріонів свиней / А. Б. Зюзюн, О. В. Щербак, O. С. Осипчук, С. I. Ковтун, В. В. Дзіцюк // Фактори експериментальної еволюції організмів. 2015. Т. 17. С. 164-168.
3. Кузьмина Т. И. Модернизация этапов технологии экстракорпорального созревания донорских ооцитов Bos taurus / Т. И. Кузьмина, А. В. Молчанов, Т. И. Станиславович, Д. Н. Татарская // Аграрный научный журнал. 2017. № 3. С. 9-14.
4. Кузьмина Т. И. Эффекты наночастиц высокодисперсного кремнезема на статус хроматина соматических клеток фолликулов свиней / Т. И. Кузьмина, Д. А. Новичкова, О. А. Епишко, И. В. Чистякова // Ветеринария. 2017, № 2. С. 43-45.
5. Чистякова И. В. Воздействие кремнийсодержащих соединений на развитие доимплантационных эмбрионов Bos taurus / И. В. Чистякова, Т. И. Кузьмина, Т. И. Станиславович, Т. Г. Хонина // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. СПб. 2018. С.105-108.
6. Heleil B. Involvement of Granulosa Cells in Realization of Prolactin Effects on the Developmental Competence of Bovine Oocytes Matured in vitro / В. Heleil, T. I. Kuzmina, H. Alm, O. Scotti, A. Tuchscherer, H. Torner // Journal of American Science. 2010, 6(9). P. 796-805.
7. Paul A. K. Vitrification of bovine matured oocytes and blastocysts in a paper container / A. K. Paul, Y. Liang, K. Srirattana, T. Nagai, R. Parnpai // Anim. Sci. J. 2018. V.89. 2. P. 307-315.
8. Park M. J. Effective oocyte vitrification and survival techniques for bovine somatic cell nuclear transfer / Park M. J. // Cell Reprogram. 2015. V17(3). P. 199-210.
9. Soo-Young Y. Development of genome engineering technologies in cattle: from random to specific / SooYoung Y., Ki-Young Y., Woo-Jae C., Goo J. // Journal of Animal Science and Biotechnology. 2018. 9:16.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Апоптоз как уникальный механизм сигналиндуцированной запрограммированной гибели одной клетки или группы клеток многоклеточного организма, его основные причины и характерные симптомы. Этапы исследований данного процесса, его роль в лечении онкологии.
реферат [25,7 K], добавлен 15.03.2011Слияние клеточных мембран. Метод электростимулируемого слияния при реконструкции животных и растительных клеток. Реконструкция зигот млекопитающих при сочетании микрохирургии и электростимулируемого слияния клеток. Особенности и перспективы метода.
реферат [28,7 K], добавлен 28.07.2009Анализ гельминтологической обстановки охотничьих и сельскохозяйственных млекопитающих в восточной части Вологодской области. Структура Государственной ветеринарной службы. Влияние природных и социально-экономических факторов на зараженность млекопитающих.
курсовая работа [1,1 M], добавлен 15.02.2017Некроз - необратимый процесс, который характеризуется гибелью отдельных клеток, части органов и тканей в живом организме. Гангрена - некроз тканей, соприкасающихся с внешней средой. Апоптоз - смерть клеток без предварительных необратимых повреждений.
учебное пособие [1,9 M], добавлен 24.05.2009Отношение к животным и этика их использования в экспериментах, история данного воспроса и его исследование на современном этапе. Изолированные культуры клеток и тканей. Методы, альтернативные работе с животными в медицине, их преимущества и значение.
контрольная работа [32,2 K], добавлен 06.06.2011Сущность и основные свойства флавоноидов, их распространение и предназначение. Гепатопротекторное, желчегонное, антиоксидантное, противовоспалительное, гормоноподобное действие флавоноидов. Другие эффекты флавоноидов, их влияние на иммунитет апоптоз.
курсовая работа [58,8 K], добавлен 15.07.2011Опухолевый рост и клеточный гомеостаз. Перенос паракринного митогенного сигнала. Жизненный цикл здоровой клетки. Схема действия механизма "Checkpoint". Апоптоз – феномен наследственно запрограммированной смерти клеток. Профилактика и лечение опухолей.
реферат [14,5 K], добавлен 13.04.2009Дифференциация стволовых клеток. Использование стволовых клеток в медицине: проблемы и перспективы. Пуповинная кровь как источник стволовых клеток. Лекарства будут испытывать на стволовых клетках. Эмбриональные и соматические стволовые клетки.
реферат [851,0 K], добавлен 24.07.2010Понятие о физиологии животных, как о науке, значимость для жизнедеятельности человека. Виды анатомии домашних животных. Развитие ветеринарной анатомии и физиологии в Китае, Персии, Египте, Греции, Месопотамии и Индии. Значение учения Гиппократа.
реферат [34,3 K], добавлен 17.05.2014Апоптоз как физиологическое явление. Апоптоз как запрограммированная гибель клетки. Митохондриальный путь. Схема молекулярных событий: клеточные стрессы, повреждение ДНК. Фагоцитоз погибшей клетки и её фрагментов. Ультраструктурные признаки некроза.
презентация [10,0 M], добавлен 04.04.2015Фазы жизненного цикла клетки. Общие механизмы повреждения клетки. Патогенез повреждения клеточных мембран. Стадии острого и хронического повреждения клетки. Специфические и неспецифические проявления повреждения. Виды гибели клетки. Некроз и апоптоз.
лекция [12,4 M], добавлен 20.02.2013Понятие о стволовых клетках, сохранение их потенциала к развитию, анализ культур и способы получения. Использование стволовых клеток для лечения заболеваний. Стволовые клетки и проблемы генной и клеточной терапии. Потребности медицины в стволовых клетках.
презентация [2,5 M], добавлен 31.03.2013Обобщение основных причин возникновения в организме человека злокачественных новообразований. Основные положения современной противораковой концепции. Функция особого гена, который через белок р53, реализует антираковую защиту и контролирует апоптоз.
статья [187,4 K], добавлен 13.04.2011Особенности развития патологической физиологии как науки. Связь общей патологии с медицинской практикой, роль экспериментальных методов исследования в выявлении причин болезней. Нобелевские премии в области медицины, физиологии и смежных с ними наук.
дипломная работа [92,4 K], добавлен 23.11.2010Этиология причин ранних самопроизвольных выкидышей, факторы риска. Анализ наблюдений женщин с угрозой невынашивания беременности в женской консультации. Обследование женщин с целью выявления причин невынашивания беременности, реабилитационная терапия.
дипломная работа [182,9 K], добавлен 20.07.2015Термином "мейоз" обозначают два следующих друг за другом деления, в результате которых из диплоидных клеток образуются гаплоидные половые клетки – гаметы. Главные события мейоза развертываются в профазе I деления. Результаты кроссинговера и анафаза.
курсовая работа [272,8 K], добавлен 28.02.2009Отношение к животным и этика их использования в экспериментах. История биомедицинского эксперимента. Методы, альтернативные работе с животными. Преимущества и недостатки работы с изолированными культурами клеток. Особенности этики научных работников.
курсовая работа [57,5 K], добавлен 16.05.2011Ознакомление с понятием и историей использования стволовых клеток. Рассмотрение особенностей эмбриональных стволовых клеток, геном которых находится в "нулевой точке", а также соматических - клеток взрослого организма. Основы процесса регенерации.
реферат [22,6 K], добавлен 21.05.2015Сущность и значение вспомогательных репродуктивных технологий, их эффективность. Характеристика применения экстракорпорального оплодотворения, суррогатного материнства, использования донорских половых клеток, преимплантационной диагностики заболеваний.
реферат [1,0 M], добавлен 15.11.2010Апоптоз как физиологическая смерть клетки, представляющая собой своеобразную генетически запрограммированную самоликвидацию, история исследования, механизм действия. Роль апоптоза в процессах старения, его фазы и причины патологического усиления.
реферат [380,2 K], добавлен 04.05.2015
