Копийность генов, как фактор устойчивости опухолевых клеток предстательной железы к облучению

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Копийность генов, как фактор устойчивости опухолевых клеток предстательной железы к облучению

Кутилин Д.С., Зинькович М.С., Гусарева М.А., Фаенсон А.В., Карнаухова Е.А., Розенко Л.Я., Фатькина Н.Б., Удаленкова И.А., Васильева Е.О., Гаппоева М.А.

Ростов-на-Дону

Лучевая терапия играет ведущую роль в лечении рака предстательной железы, однако появление радиорезистентных форм этого заболевания диктует необходимость персонифицированного подхода, основанного на данных молекулярных маркеров. К подобным маркерам относится показатель изменчивости копийности генов (Copy Number Variation (CNV)). Целью исследования стала валидация в условиях модельного эксперимента потенциальных предикторов радиорезистентности клеток предстательной железы (показатель копийности генов), выбранных на основании данных метаанализа. В исследовании использовалась культура клеток рака предстательной железы PC-3. Определение относительной копийности 32 генов (BRCA1, BRCA2, AKT, ATM, BRIP, H2AX, EXO1, CDK1, XRCC4, RAD50, RAP80, RIF1, RNF168, TOPB1, KU70, CDKN1B, CCND1, CCND3, FGFR2, HIST1, RBBP8, EP300, LIG4, C-FLIP, PTEN, TP53, BAX, CASP8, CASP3, CASP9, MDM2, BCL2) проводили методом Real-Time qPCR. В клетках PC-3 сохранившихся после облучения в дозе 6 Гр была повышена копийность CDK1, CDKN1B, H2AX, PTEN, XRCC4 и RBBP8 и снижена копийность генов BCL2, CCND3, TP53 и BAX относительно клеток контрольной группы. В клетках PC-3, сохранившихся после облучения в дозе 7 Гр, была повышена копийность CDK1, CDKN1B, PTEN, XRCC4, EP300 и RBBP8 и снижена копийность генов CCND3, TP53 и BCL2 относительно клеток контрольной группы. Таким образом, исследование позволило установить, что сохранившие жизнеспособность после пятидневной лучевой терапии клетки линии PC-3 обладают особыми характеристиками, обеспечивающими их выживание: повышенной копийностью генов CDK1, CDKN1B, H2AX, PTEN, XRCC4, RBBP8 и EP300 и сниженной копийностью CCND3, BAX, TP53 и BCL2.

Ключевые слова: рак предстательной железы, лучевая терапия, культура клеток, копийность генов, апоптоз, репарация ДНК

GENE COPY NUMBER VARIATION AS A FACTOR OF RADIATION RESISTANCE OF PROSTATE TUMOR CELLS

National Medical Research Oncology Center, Rostov-on-Don

Radiation therapy plays a leading role in the treatment of prostate cancer, but the emergence of radioresistant forms of this cancer necessitates a personalized approach based on data from molecular markers. These markers include Copy Number Variation (CNV). The aim of study was to validate, under model experiment conditions, potential predictors of prostate cells radioresistance (CNV), selected on the basis of meta-analysis data. The study used PC-3 prostate cancer cell culture. Determination of the relative copy number of 32 genes (BRCA1, BRCA2, AKT, ATM, BRIP, H2AX, EXO1, CDK1, XRCC4, RAD50, RAP80, RIF1, RNF168, TOPB1, KU70, CDKN1B, CCND1, CCND3, FGFR2, HIST1, RBBP8, EP300, LIG4, C-FLIP, PTEN, TP53, BAX, CASP8, CASP3, CASP9, MDM2, BCL2) were performed using the Real-Time qPCR method. In PC-3 cells preserved after irradiation at a dose of 6 Gy, the CNV of CDK1, CDKN1B, H2AX, PTEN, XRCC4 and RBBP8 was increased, and the CNV of the BCL2, CCND3, TP53 and BAX genes was reduced relative to the control group cells. In PC-3 cells preserved after irradiation at 7 Gy dose, the CNV of CDK1, CDKN1B, PTEN, XRCC4, EP300 and RBBP8 was increased, and the CNV of the CCND3, TP53 and BCL2 genes was reduced relative to the control group cells. Thus, the study revealed that the PC-3 cells that survived after five days of radiation therapy have special characteristics that ensure their survival: increased CNV of the CDK1, CDKN1B, H2AX, PTEN, XRCC4, RBBP8 and EP300 genes and a reduced CNV of CCND3, BAX, TP53 and BCL2.

Keywords: prostate cancer, radiotherapy, cell culture, gene copy number variation, apoptosis, DNA repair

Введение

Злокачественные опухоли предстательной железы занимают 2-е место в структуре онкологической заболеваемости в России у мужчин всех возрастных групп. Причем в последнее десятилетие отмечают значительный рост заболеваемости, который составляет 143% и является самым высоким показателем среди опухолей других нозологий. [1].

Основными терапевтическими подходами при данной патологии являются радикальная простатэктомия и лучевая терапия (ЛТ) [2]. Последняя играет одну из ведущих ролей в лечении рака предстательной железы (РПЖ) [3], однако появление радиорезистентных форм диктует необходимость персонифицированного подхода, основанного на данных молекулярно-генетических маркеров [1].

Причины радиорезистентности активно изучаются. Одной из них может быть гиперактивация в опухолевых клетках таких механизмов, как репарация ДНК [4]. Как известно, баланс между повреждением и репарацией ДНК определяет выживаемость клеток после воздействия ионизирующего излучения [5]. Не менее важным фактором, оказывающим влияние на чувствительность опухолевых клеток к излучению, является гипоксия, с учетом роли кислорода в реакции образования активных форм кислорода (АФК), индуцированной облучением [6].

Несмотря на эволюцию методов лучевой терапии злокачественных опухолей предстательной железы и на то, что известны многие механизмы формирования радиорезистентности опухолей разных нозологий, в настоящее время отсутствует возможность достоверного определения чувствительности РПЖ к лучевой терапии. Поэтому проблема прогнозирования радиорезистентности остается актуальной. Для ее решения необходимы модельные эксперименты на клеточных культурах опухолевых клеток с оценкой влияния ЛТ на их выживаемость [7].

Выявление молекулярных маркеров радиорезистентности с последующим дифференцированным подходом к выбору тактики лечения может существенно повлиять на результаты терапии больных РПЖ в сторону их улучшения [1]. К подобным маркерам относится показатель копийности генов (Copy Number Variation (CNV)) - генетический полиморфизм, приводящий к снижению или повышению числа копий определенного гена и, как следствие, к снижению или повышению уровня молекулярного продукта гена - мРНК, не кодирующей РНК или белка [8].

Метаанализ (на основании данных, опубликованных с 2000 по 2020 г.) обобщил результаты лучевой терапии больных локализованным раком предстательной железы и показатели по изменчивости копийности генов, и позволил сформировать перечень потенциальных молекулярных маркеров, состоящий из 32 генетических локусов - компонентов сигнальных путей, регулирующих репарацию ДНК, клеточный цикл и апоптоз.

Поэтому целью исследования стала валидация в условиях модельного эксперимента потенциальных предикторов радиорезистентности клеток предстательной железы (показатель копийности генов), выбранных на основании данных метаанализа.

Материалы и методы исследования

В исследовании использовалась культура клеток человека - рака предстательной железы PC-3. Культивирование клеточной массы проводилось в стандартных условиях, описанных нами в предыдущих работах (стерильные плоскодонные флаконы, среда RPMI- 1640 c 10% фетальной телячьей сывороткой, гентамицин 50 мкг/мл, 5% CO2, 95% влажности и 37 ⁰C) [7].

Для модельного эксперимента использовали дозы 6 и 7 Гр (облучение проводили 5 раз через каждые 24 ч на линейном ускорителе Novalis TX). Подсчет клеток проводили в камере Горяева (0,4% раствор трипанового синего). На 5-й день облучения клетки PC-3 снимали с подложки раствором Трипсин/Версена. Количество клеток, находящихся на различных стадиях апоптоза, оценивали на проточном цитофлюориметре Facs Canto II с использованием Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit [7].

Из клеток фенол-хлороформным методом проводилась экстракция ДНК. Для определения относительной копийности генов нами, с использованием базы данных NCBI GenBank, были разработаны последовательности 32 пар синтетических олигонуклеотидов (BRCA1, BRCA2, AKT, ATM, BRIP, H2AX, EXO1, CDK1, XRCC4, RAD50, RAP80, RIF1, RNF168, TOPB1, KU70, CDKN1B, CCND1, CCND3, FGFR2, HIST1, RBBP8, EP300, LIG4, C- FLIP, PTEN, TP53, BAX, CASP8, CASP3, CASP9, MDM2, BCL2) и 3 пары для референсных локусов (ACTB, B2M, GAPDH) (табл. 1). Определение относительной копийности генетических локусов проводили методом Real-Time qPCR (RT-qPCR).

Таблица 1 Последовательности праймеров для определения копийности генов

Заключение

Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что сохранившие после пятидневной лучевой терапии при 6 и 7 Гр жизнеспособность клетки линии PC-3 обладают особыми генетическими характеристиками, собственно, и обеспечивающими их выживание: повышенной копийностью генов CDK1, CDKN1B, H2AX, PTEN, XRCC4, RBBP8 и EP300 и сниженной копийностью CCND3, BAX, TP53 и BCL2. Данные генетические локусы можно рассматривать как наиболее значимые молекулярные предикторы радиорезистентности клеток предстательной железы и можно рекомендовать определение показателя их копийности к апробации в клинической практике.

Список литературы

1. Зинькович М.С., Максимов А.Ю., Розенко Л.Я., Гусарева М.А., Карнаухова Е.А., Фаенсон А.В., Тимошкина Н.Н., Кутилин Д.С. Радиорезистентность как фактор эволюции лучевой терапии рака предстательной железы // Современные проблемы науки и образования. 2019. № 2. URL: http://science-education.m/ru/artide/view?id=28627 (дата обращения: 24.04.2020)

2. Chaiswing L., Weiss H.L., Jayswal R.D. Profiles of Radioresistance Mechanisms in Prostate Cancer. Crit. Rev. Oncog. 2018. Vol. 23(1-2). P. 39-67

3. Mottet N., Bellmunt J., Bolla M. EAU-ESTRO-SIOG Guidelines on Prostate Cancer. Part 1: Screening, Diagnosis, and Local Treatment with Curative Intent. Eur. Urol. 2017. V. 71. P. 618629.

4. Negre-Salvayre A., Coatrieux C., Ingueneau C., Salvayre R. Advanced lipid peroxidation end products in oxidative damage to proteins. Potential role in diseases and therapeutic prospects for the inhibitors. Br. J. Pharmacol. 2008. Vol.153. P. 6-20.

5. Li Z., Pearlman A.H., Hsieh P. DNA mismatch repair and the DNA damage response. DNA Repair. (Amst). 2016. Vol. 38. P. 94-101.

6. Sonveaux P. ROS and radiotherapy: More we care. Oncotarget. 2017. Vol. 8 (22). P. 35482-3.

7. Кутилин Д.С., Сагакянц А.Б., Зинькович М.С., Максимов А.Ю., Гусарева М.А., Бондаренко Е.С., Потемкин Д.С., Васильченко Н.Г. Влияние различных доз лучевой терапии на выживаемость опухолевых клеток предстательной железы линии PC-3 // Современные проблемы науки и образования. 2019. № 2. URL: http://www.science-education.ru/article/view?id=28740 (дата обращения: 18.04.2020).

8. Кутилин Д.С., Айрапетова Т.Г., Анистратов П.А., Пыльцин С.П., Лейман И.А., Карнаухов Н.С., Кит О.И. Изменение копийности генов в опухолевых клетках и внеклеточной ДНК у больных аденокарциномой лёгкого // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019. Т. 167 (6). С. 731-738.

9. Krishnan A., Zhang R., Yao V., Theesfeld C.L., Wong A.K., Tadych A., Volfovsky N., Packer A., Lash A., Troyanskaya O.G. Genome-wide prediction and functional characterization of the genetic basis of autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 2016. Vol. 19(11). P.1454-1462

10. Wu G., Feng X., Stein L. A human functional protein interaction network and its application to cancer data analysis. Genome Biol. 2010. Vol.11(5). P. 53.

Размещено на Allbest.ru