Антиоксиданты в регуляции функциональной активности селезенки в условиях интоксикации

Размещено на http://www.allbest.ru/

Антиоксиданты в регуляции функциональной активности селезенки в условиях интоксикации

Рожкова И.С.1,

Теплый Д.Л.2

1ФГБОУ ВО Астраханский государственный медицинский университет Минздрава России, Астрахань

Ключевые слова: околочасовые ритмы, ткань селезенки, крысы, хроническая интоксикация, стресс, тималин, витамин Е.

ANTIOXIDANTS IN THE REGULATION OF FUNCTIONAL ACTIVITY OF THE SPLEEN IN THE CONDITIONS OF INTOXICATION

Rozhkova I.S.1, Teply D.L.2

1Astrakhan State Medical University, Astrakhan

2Astrakhan State University, Astrakhan

The use of biochemical research methods revealed the ontogenetic features of ultradian rhythms of albumin and total protein in the spleen tissues of male rats of different ages under normal conditions, intoxication caused by exposure to hydrogen sulfide-containing gas, and during administration of thymalin and vitamin E. During the registration of experimental data, a comparative analysis of the rhythmic activity of the albumin content, as well as the total protein in the tissues of the spleen of the rat with in the ontogenetic aspect, with toxic stress and against the background of the introduction of a complex of antioxidants in conditions of intoxication. The revealed fluctuations in the level of both albumin and total protein can be characterized as ultra-radian with a frequency of 20 to 40-60 minutes. The data obtained during the experiment indicate that, with age, the resistance of spleen tissue to the action of an exotoxicant decreases and the involution processes increase under stress. The recorded changes in the experiment are reversible, since the introduction of thymalin and а-tocopherol modifies the kinetic curve, increasing the amplitude of vibrations in all age groups, as well as the average level of total protein and albumin. The combined introduction of thymalin and а-tocopherol used in the experiment in all age groups against the background of the chronic action of natural gas revealed their antioxidant properties. ультрадианный ритм альбумин

Цель исследования: изучить функциональную активность ткани селезенки крыс-самцов в нормальных условиях, при хроническом воздействии природного газа Астраханского месторождения, а также при действии тималина и а-токоферола в условиях развивающегося токсического стресса в органе.

Материал и методы исследования. Объектом изучения были 90 самцов белых крыс, которые в условиях вивария имели свободный доступ как к пище, так и к воде.

Изучаемые животные были поделены на несколько групп: контрольные и экспериментальные, в то же время согласно возрасту выделены подгруппы: первая - молодые (неполовозрелые) особи, вторая - половозрелые, третья - старые крысы. Все экспериментальные исследования проводились на животных в осенний и зимний период, чтобы максимально исключить действие сезонных ритмов.

Группы всех экспериментальных крыс в течение 6 недель были подвергнуты хроническому воздействию природного газа Астраханского месторождения с концентрацией по сероводороду при 90±4 мг/м 3. Опыты длились 4 часа в день с понедельника до пятницы. Интактных крыс помещали в те же камеры на тот же срок эксперимента, используя состав дыхательной смеси, не содержащей примесей природного газа.

Возрастные группы экспериментальных животных в течение 6-недельного эксперимента через день внутримышечно получали инъекцию 0,01 мг тималина, рассчитанную на 100 г массы тела крысы. Витамин Е в виде 10%-ного масляного раствора а-токоферола ацетата вводили per os с помощью инсулинового шприца без иглы, используя дозу 0,5 мг на 100 г массы тела для каждого стрессированного животного в течение 2 недель до начала постановки эксперимента и на протяжении всего периода воздействия природным газом.

По окончании опытов животным производили инъекцию этаминала натрия внутрибрюшинно, используя дозу 5 мг на 100 г массы тела, затем их декапитировали и осуществляли выделение образцов ткани селезенки. Забор материала проводили с временными интервалами через каждые 20 минут в течение 3 часов начиная от времени прекращения эксперимента. Ткань селезенки гомогенизировали непосредственно перед измерением в гомогенизаторе Даунса, используя фосфатный буфер pH 7,45 при 0,07М.

Биуретовым методом определяли содержание белка в гомогенатах ткани селезенки, используя спектрофотометр Baekman (США) при настройке длины волны на уровне 500-560 нм. Для того чтобы определить уровень содержания альбумина в гомогенатах ткани, мы применяли унифицированный метод, который основан на реакции взаимодействия альбумина и бромкрезолового зеленого. Количественные измерения проводили, используя спектрофотометр Baekman (США) при длине волны на уровне 630-690 нм.

Согласно методике И.Д. Стальной и Т.Т. Гаришвили, модифицированной Е.А. Строевым и В.Г. Макаровой, нами были зарегистрированы показатели свободнорадикальных процессов. По уровню содержания малонового диальдегида (МДА) в нмоль/0,05 г сырого веса ткани изучалось исходное перекисное окисление липидов (ПОЛ), затем определялась скорость спонтанного (Сп. ПОЛ) и аскорбатзависимого (Аск. ПОЛ) (которая измерялась в нмоль) образованного малонового диальдегида (МДА) в пробе в течение 1 часа инкубации. Используя методику Е.Е. Дубининой, С.О. Бурмистрова с соавторами, мы определяли окислительную модификацию белков (ОМБ), основанную на качественной реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4- динитрофенилгидразином, в результате которой образуются окрашенные производные динитрофенилгидразона, зарегистрированные нами на спектрофотометре при уровне длины волны в 270 нм.

Статистическая математическая обработка данных ритмогенеза в ткани селезенки изучаемых групп животных проводилась с использованием компьютерных программ "Cosinor Ellipse 2006" и "Microsoft Excel 2007". Нами был зафиксирован основной показатель ритмического процесса - период колебаний, а также изучены амплитуда, акрофаза и мезор. Для определения достоверности различий двух средних и относительных величин использовали t-критерий Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение. Полученные в ходе исследования колебания уровней содержания альбумина, а также общего белка можно охарактеризовать как ультрадианные с периодами от 20-40 до 60 минут. Уровень амплитуды колебания общего белка и альбумина у неполовозрелых контрольных животных соответствует 47% и 34% от среднего значения (мезора). Угнетение синтетической активности в условиях интоксикации наблюдалось значительное у молодых крыс. В результате зарегистрировано снижение уровней содержания общего белка на 53%, а альбумина на 74% от мезора. Кроме того, зафиксировано снижение амплитуды колебаний общего белка на 9%, но наблюдалось увеличение амплитуды колебаний альбумина на 18%. Очевидно, что такие изменения в колебаниях этого белка связаны с его основной функцией - транспортного белка.

У интактных половозрелых крыс среднее содержание общего белка в ткани селезенки в 2 раза выше, чем у молодых, и в 1,3 раза выше, чем у старых животных. Уровень содержания альбумина у половозрелых крыс в контроле больше на 59%, чем у молодых, и на 10% выше, чем у старых животных. Но при этом амплитуда колебаний содержания белков в ткани селезенки у половозрелых крыс ниже, чем у молодых и старых животных, что, вероятно, связано с более высокой степенью синхронизации спленоцитов у этой группы крыс.

В ткани селезенки стрессированных половозрелых животных динамика уровней содержания общего белка и альбумина продолжает сохранять околочасовую периодичность, хотя в условиях гипоксии, вызванной воздействием природного газа, происходит угнетение синтеза изучаемых белков. Так, при сравнении с контролем у половозрелых крыс зарегистрировано резкое падение уровней общего белка на 11,6% и альбумина на 21,4% от мезора. Токсическое воздействие природного газа на ткань селезенки половозрелых животных вызывает уменьшение амплитуды колебаний общего белка на 20% и альбумина на 19,6%, что модифицирует кинетическую кривую.

В условиях интоксикации в ткани селезенки старых крыс наблюдается снижение амплитуды колебаний как общего белка, так и альбумина на 3% и 1,5% соответственно. В результате эксперимента также зарегистрировано снижение уровня общего белка на 4% и альбумина на 32% от среднего значения (мезора) в сравнении с контролем.

У молодых крыс при гипоксии, вызванной воздействием природного газа, на фоне введения антиоксидантов происходит модификация околочасовых осцилляций в ткани органа. Ответная реакция спленоцитов в условиях стресса характеризуется увеличением среднего содержания общего белка в 4 раза и альбумина в 6,5 раза от среднего значения.

Комплекс антиоксидантов, применяемый в эксперименте, способствовал увеличению амплитуды колебаний альбумина на 2%, но отмечалось снижение амплитуды общего белка на 7% в сравнении с подгруппой ССГ. Очевидно, этот факт свидетельствует о низкой степени синхронизации спленоцитов в ткани селезенки неполовозрелых животных, которая требуется для обеспечения их оптимального функционирования при токсическом стрессе.

У стрессированных половозрелых крыс в условиях гипоксии на фоне введения антиоксидантов ответная реакция ткани характеризуется увеличением общего белка на 10,5% и альбумина на 36%. Комплекс антиоксидантов (тималин и витамин Е), применяемый в эксперименте, способствовал повышению адаптации организма экспериментальных крыс, что в свою очередь проявилось увеличением амплитуды колебаний, и способствовал активизации ферментных систем, необходимых для синтеза общего белка и альбумина.

Введение антиоксидантов группе старых крыс при токсическом стрессе стабилизирует компенсаторные возможности ткани селезенки. Это характеризуется увеличением среднего уровня содержания как общего белка (на 30%), так и альбумина (на 63%) в сравнении с подгруппой стрессированных крыс. При сравнительном анализе на кинетической кривой наблюдалось увеличение амплитуды колебаний общего белка на 4,5%, а альбумина - на 4%.

При сравнении возрастных особенностей параметров оксидативного стресса, регистрируемых в ткани селезенки контрольных животных, отмечено, что у старых животных более высокий уровень содержания продуктов, которые реагируют с тиобарбитуровой кислотой, соответствуя уровню 3,99±0,502 нмоль/0,05 г в ткани (р<0,05), но в то же время он намного меньше, чем у молодых крыс, где зафиксировано 3,25±0,399 нмоль/0,05 г ткани (р<0,05). Ускорение аскорбатзависимого ПОЛ нами наблюдалось (р<0,05) у старых животных в сравнении с группой половозрелых: от 20,39±0,597 и до 40,27±0,719 нмоль/ч (табл. 2, 3). Кроме того, отмечается повышение уровня спонтанного ПОЛ у старых животных в сравнении с группой молодых крыс: от 23,62±0,204 и до 24,42±0,815 нмоль/ч (р<0,05) (табл. 1, 3).

Таблица 1

Уровень свободнорадикальных процессов в селезенке молодых крыс, подвергшихся хроническому стрессу на фоне введения комплекса антиоксидантов (М±т)

Примечание: К - интактные крысы, ССГ - крысы стрессированные в результате воздействия природным газом, ССГ + АО крысы стрессированные в результате воздействия природным газом в условиях применения антиоксидантов; *р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,001, сравнимое с контролем; °р<0,05, °° р<0,01 и шр<0,001 в сравнении с группой, которая получала ССГ, и с группой ССГ + АО; ^р<0,05, ^р<0,01 и дар<0,001 в сравнении К группы и подгруппы, которая получала ССГ + АО (обозначения здесь и далее те же).

Наиболее высоким уровень ОМБ оказался в ткани селезенки старых крыс - 0,69±0,029 мкмоль/мг белка (р<0,05), хотя у половозрелых контрольных животных уровень на 80% ниже (табл. 2) (р<0,001).

Таблица 2

Уровень свободнорадикальных процессов в селезенке половозрелых крыс, подвергшихся хроническому стрессу на фоне введения комплекса антиоксидантов (М±т)

Данные эксперимента показали, что хроническое воздействие серосодержащего газа Астраханского месторождения изменяет активность свободнорадикальных процессов в ткани селезенки, а также уровень антиоксидантной защиты.

Ответная реакция работы исследуемого органа при воздействии экзотоксиканта зависит от возраста изученных животных. Нами обнаружено, что при токсическом стрессе с возрастом увеличивается количество продуктов, которые реагируют с тиобарбитуровой кислотой, именно это и приводит к формированию окислительного стресса. Об этом также свидетельствует рост всех показателей исходного ПОЛ, аскорбатзависимого ПОЛ и спонтанного ПОЛ у старых крыс в сравнении как с неполовозрелыми, так и с половозрелыми животными (р<0,001) (табл. 1, 2, 3).

Таблица 3

Уровень свободнорадикальных процессов в селезенке старых крыс, подвергшихся хроническому стрессу на фоне введения комплекса антиоксидантов (М±т)

Зафиксированные показатели повышения исходного ПОЛ до уровня 17,18±0,931 нмоль/0,05 г ткани, усиление скорости спонтанного до уровня 118,32±0,295 нмоль/ч и индуцированного ПОЛ до уровня 125,34±0,755 нмоль/ч соответственно усугубляют токсический эффект сероводорода в ткани селезенки старых крыс (табл. 1-3).

Более низкий уровень исходного ПОЛ (р<0,001) в условиях гипоксии, вызванной воздействием природным газом, зарегистрирован у неполовозрелых животных - 8,14±0,660 нмоль/0,05 г ткани.

Анализируя результаты исследования у молодых и половозрелых крыс в условиях стресса, можно отметить рост скорости спонтанного ПОЛ (р<0,05) у половозрелых животных на 13%, но замедление индуцированного ПОЛ (р<0,05) на 15%. В ткани селезенки неполовозрелых крыс при хроническом стрессе в сравнении с интактной группой этого возраста зафиксировано наибольшее возрастание уровня исходного ПОЛ на 150,5% (р<0,001), наблюдалось увеличение в 3,7 раза скорости спонтанного ПОЛ (р<0,001) и в 3 раза - скорости аскорбатзависимого ПОЛ (р<0,001), также отмечено повышение на 35% уровня ОМБ (р<0,01). Полученные результаты свидетельствуют об усилении свободнорадикальных процессов, индуцированных действием токсиканта на ткань селезенки неполовозрелых крыс, и более выраженных компенсаторных возможностях органа половозрелых животных.

Уровень ОМБ (табл. 1, 2, 3) увеличивается во всех возрастных группах стрессированных животных (р<0,001), что свидетельствует не только об эффекте токсического действия сероводородсодержащего газа на ткань селезенки, но и о его способности развивать оксидативный стресс в органе независимо от возраста крыс.

Тималин в сочетании с а-токоферолом на фоне хронической ингаляции газа проявил выраженные антиоксидантные и иммуномодулирующие свойства, вызвав снижение уровня изучаемых показателей свободно-радикальных процессов в селезенке крыс трех возрастных групп. Наибольший корригирующий эффект комплексного введения препаратов был зафиксирован у половозрелых крыс в сравнении с контрольными данными (р<0,001) групп молодых и старых животных.

Скорость аскорбатзависимого ПОЛ снижается (р<0,001) как у молодых, так и у старых крыс, но не достигает контрольных значений (табл. 1, 3). Очевидно, это связано с истощением компенсаторных возможностей спленоцитов в этих возрастных группах. Однако комбинирование препаратов в эксперименте вызвало уменьшение уровня ОМБ в сравнении с контролем на 94% (р<0,001) у неполовозрелых крыс, на 43% (р<0,05) этот же показатель зарегистрирован ниже у половозрелых животных и на 90% (р<0,05) меньше у старых крыс. Это еще раз свидетельствует о наличии корригирующего эффекта применяемых препаратов на белковый обмен ткани селезенки.

Заключение