Состав тканевых цитокинов в аденокарциномах желудка различной распространенности и степени дифференцировки

Ключевые слова: рак желудка, цитокины, ткань опухоли и перитуморальной зоны, стадия, степень дифференцировки

COMPOSITION OF TISSUE CYTOKINES IN STOMACH ADENOCARCINOMAS OF VARIOUS METASTATIC SPREAD AND GRADES

Zlatnik E.Y., Sagakyants A.B., Samoylenko N.S., Zolotareva E.I., Shulgina O.G.,

Gevorkyan Y.A., Soldatkina N.V., Stateshniy O.N., Tolmakh R.E., Savchenko D.A. Rostov Research Institute of Oncology, Rostov-on-Don,

The article presents data on the local content of cytokines in tissues of tumors and their peritumoral areas in 31 patients with metastatic (M1) and non-metastatic (M0) G2-G3 stomach adenocarcinomas. Tumor levels of IL-6 and IL-8 cytokines prevailed over levels in peritumoral tissues in both M0 and M1. IL-18 levels were higher and IL-1RА and IL-10 were lower in M0 compared to M1. In G3 M1 tumors, specific levels of IL-10 and IL-1RА were 3 times higher than in M0. IL-2 and IL-6 in peritumoral tissues of M1 G3 tumors were higher as well, compared to M0. Taking into account the biological activity of cytokines associated with the stimulation of proliferation, migration, and neoangiogenesis, the studied parameters of their tissue levels characterize stomach adenocarcinomas with minimal differentiation and maximal prevalence (M1 G3) as the most unfavorable ones, paralleling clinical prognostic signs of gastric tumors. The data obtained can be of value for assessing the prognosis of the course of the disease and can be used to develop prognostic algorithms.

Keywords: stomach cancer, cytokines, tumor and peritumoral tissues, stage, grade

Рак желудка в течение последних 10 лет в мире и в России стабильно находится в пятерке самых распространенных злокачественных новообразований с высоким уровнем смертности [1]. Неутешительный прогноз данного заболевания обусловлен агрессивным течением патологического процесса с развитием отдаленных метастазов у 85% больных в течение 3 лет. Метастатическое поражение при раке желудка может развиваться лимфогенным, гематогенным и имплантационным путями. При этом метастатическое поражение брюшной полости, включая брюшину и большой сальник, происходит более чем у 55-60% пациентов [2]. Для совершенствования результатов лечения рака желудка предлагаются методы комбинированного и комплексного лечения [3], однако значимое улучшение возможно только при понимании патогенетических процессов биологического поведения опухоли [4, 5] и при разработке соответствующей направленной терапии. Такой подход требует проведения фундаментальных исследований, что и определило актуальность нашего исследования.

Важную роль в опухолевом росте и диссеминации играет состояние иммунной системы. По современным представлениям взаимодействие злокачественной опухоли и организма-опухоленосителя имеет ряд последовательных фаз: элиминация опухолевых клеток под действием факторов врожденного и адаптивного иммунитета, равновесие с формированием клонов дормантных опухолевых клеток и ускользание опухолевых клеток от действия клеток иммунной системы, сопровождающееся формированием ростостимулирующего и иммуносупрессивного микроокружения [6]. Неотъемлемой частью последнего являются цитокины и факторы роста.

Цитокины - молекулы, продуцируемые активированными иммунокомпетентными и некоторыми другими, в частности опухолевыми и эндотелиальными, клетками, являются регуляторами межклеточных взаимодействий по каскадному пути. Многие из них могут выступать как факторы усиления опухолевой прогрессии, активирующие ангиогинез (IL-1 Я, TNF-a), миграцию опухолевых клеток (IL-1 Я, IL-6, IL-8), метаплазию эпителиальных клеток (IL-6), некоторые являются стимуляторами и продуктами Т regs (IL-10) [7-9]. В то же время они способны проявлять и антионкогенные эффекты, например IL-1 Я, IL-6, IL-8 - путем вовлечения различных звеньев иммунной системы в противоопухолевый ответ, TNF-a - будучи индуктором апоптоза, а IL-10 - за счет антагонизма по отношению к провоспалительным интерлейкинам и повышения продукции в опухоли токсичных молекул (например, оксида азота NO), препятствующих росту новообразования [10].

В последние годы предметом пристального внимания онкоиммунологов является IL- 18. Как и у большинства цитокинов, у него выявлены двойственные эффекты на опухолевый рост. С одной стороны, он принадлежит к семейству IL-1Я и стимулирует продукцию интерферона-гамма [11], с другой - дисрегуляция его синтеза в микроокружении некоторых опухолей (таких как множественная миелома, рак предстательной железы) рассматривается как ключевой драйвер опухолевой прогрессии, в связи с чем он является кандидатной мишенью для дальнейшей таргетной терапии [12]. В недавней работе сообщается, что именно IL-18 внутриопухолевого происхождения связан с отрицательным прогнозом при тройном негативном раке молочной железы, что реализуется через стимулирование иммуносупрессивной (незрелой) фракции естественных киллеров и экспрессии на них PD-1 [13].

Для проявления перечисленных разнонаправленных эффектов представляются важными именно локальные концентрации цитокинов, поскольку характер их действия является короткодистантным. Взаимодействие «опухоль - организм» с участием цитокинов имеет место и является объектом исследования при различных опухолях, причем изучается возможность использования цитокиновых показателей в качестве прогностических. Ранее нами была показана прогностическая значимость локального цитокинового состава в опухоли и перитуморальной зоне при меланоме кожи и раке пищевода [14, 15], подобные исследования проводятся и в других странах при различных опухолях [16, 17].

В последние годы появились единичные исследования тканевых цитокинов и при раке желудка [18], в ходе которых авторами сделаны интересные находки; высказано мнение о несомненной, хотя и противоречивой роли цитокинов в процессах канцерогенеза в желудке [19].

Целью данной работы является изучение содержания цитокинов при различных аденокарциномах желудка в опухоли и перитуморальной зоне.

Материал и методы исследования

Проанализированы данные о 31 больном раком желудка в возрасте от 31 до 81 года. Среди них было 18 мужчин, 13 женщин. Гистологически у всех больных были определены аденокарциномы средней и низкой степени дифференцировки. Больные подвергались лечению в ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ в период с 2017 по 2019 гг. В группу М0 были включены 23 больных без отдаленного метастатического поражения T1-4N0-2M0; оперативные вмешательства у них проводились в полном объеме с выполнением лимфодиссекции D2 и носили радикальный характер. В группу М1 были включены 8 больных раком желудка T2- 4N0-3M1 с отдаленным метастатическим поражением брюшины, в том числе большого сальника, из них 4 больным были выполнены циторедуктивные операции, а у 4 больных оперативные вмешательства носили диагностический характер.

Для исследования цитокинового состава в тканях фрагменты удаленной опухолевой ткани и перитуморальной зоны (ПЗ) дезинтегрировали с помощью дезагрегирующего устройства BD Medimachine. Полученные клеточные суспензии центрифугировали; в супернатантах определяли уровни провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-1Я, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10) методом ИФА с тест-системами «Вектор-Бест» (Новосибирск) и IL-1RA (eBioscience, Austria) в соответствии с инструкциями фирмы- производителя. Результаты выражали в виде удельного содержания в пересчете на 1 г белка гомогената, оцениваемого биуретовым методом (пг/мл/г белка).

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ Statistika 6.0 по t-критерию Стьюдента для двух независимых выборок. Различия считали статистически значимыми при p<0,05, а при 0,1>p>0,05 - на уровне статистической тенденции к значимости. Предварительно проводили проверку выборок на соответствие нормальному распределению по W-критерию Шапиро-Уилка и критерию Колмогорова- Смирнова.

Результаты исследования

Результаты исследования представлены в таблицах 1, 2 и на рисунках 1-3. Как видно из таблицы 1, при сравнении показателей опухоли и ПЗ для М0 виден ряд различий: в опухолях статистически значимо выше, чем в ПЗ, были уровни IL-6, IL-8, IL-18 и ниже - уровни IL-1RA и IL-10.

Таблица 1. Удельные уровни цитокинов в образцах тканей опухолей и перитуморальных зон при разной распространенности рака желудка (пг/мл/г)

Примечание: * - статистически достоверные различия между показателями опухоли и ПЗ при опухолях М0 (t>2); ** - статистически достоверные различия между показателями опухоли и ПЗ при опухолях М1 (t>2)

При опухолях М1 отмечены статистически значимые различия между опухолью и ПЗ по удельным уровням двух цитокинов, а именно в опухоли по сравнению с ПЗ отмечается более высокое содержание IL-6 и IL-8. Уровни IL-1 Я и IL-18 при опухолях М1, хотя и не демонстрируют статистически достоверных различий между опухолью и ПЗ, имеют тенденцию к более высоким показателям в ткани опухоли. При анализе без разделения на G2 и G3 различий между тканевыми уровнями цитокинов в зависимости от распространенности процесса не наблюдалось ни в опухоли, ни в ПЗ.

В таблице 2 представлены данные по содержанию цитокинов в образцах тканей опухолей G2 при наличии и отсутствии метастазирования.

Таблица 2. Удельные уровни цитокинов в образцах тканей опухолей и перитуморальных зон пристепени дифференцировки G2 и разной распространенности рака желудка (пг/мл/г)

Примечание: * - статистически достоверные различия между показателями опухоли и ПЗ при опухолях М0 (t>2); ** - статистически достоверные различия между показателями опухоли и ПЗ при опухолях М1 (t>2); *** - статистически достоверные различия между показателями ПЗ при опухолях М0 и М1 (t>2).

Как видно из приведенных в таблице результатов, в опухолях М0 степени дифференцировки G2 выявлены статистически значимые различия по содержанию IL-1Я, IL- 6, IL-8, IL-18 и TNF-a, причем последний был выше в ПЗ, а остальные - в опухоли. Обнаружено единственное статистически значимое различие между М0 и М1 опухолями - в ПЗ последних содержание IL-2 оказалось в 2,5 раза ниже. По остальным показателям можно говорить только о тенденции, которая не нашла статистически значимого выражения в связи с немногочисленностью наблюдений в группе М1 G2 и существенной индивидуальной вариабельности, присущей цитокиновым показателям.

Сравнительная характеристика содержания некоторых цитокинов, содержащихся в опухоли и в ПЗ, метастазирующих и неметастазирующих опухолей с разной степенью дифференцировки представлена на рисунках 1-3. В ткани опухоли различия выявляются только при G3 и касаются удельных уровней IL-10 (рис. 1А) и IL-1RA (рис. 1Б), которых в опухолях М1 содержится в 3 раза больше, чем в опухолях М0.

Показатели для IL-10 составляют 5,1±2,4 и 14,3±3,3 пг/мл/г, для IL-1RA - 4996,4±2435,3 и 15756,7±1157,2 пг/мл/г соответственно; в обоих случаях t>2.

Рис. 1. Удельные уровни некоторых цитокинов в опухолях желудка G2 и G3 с разной распространенностью. Ось Y - пг/г/млА - IL-10; Б - IL-1RA

В ткани ПЗ выявляются разнонаправленные различия между М0 и М1 в зависимости от степени дифференцировки по удельному уровню IL-2 (рис. 2). Степень дифференцировки G2 сопровождается более высоким уровнем этого цитокина в ПЗ неметастазирующей опухоли, а G3 - в ПЗ метастазирующей опухоли, что может свидетельствовать о его возможном значении не только в индукции иммунного ответа, но и диссеминации опухоли. По крайней мере в ПЗ его количество оказалось наибольшим (11,9± 1,5 пг/мл/г) при наиболее агрессивных опухолях из исследованных нами - низкодифференцированных аденокарциномах стадии М1, хотя в опухолевой ткани подобных различий не наблюдается.

Рис. 2. Удельные уровни IL-2 в ПЗ опухолей желудка G2 и G3 с разнойраспространенностью. Ось Y - пг/г/мл

Рис. 3. Удельные уровни IL-6 в ПЗ опухолей желудка G3 разной распространенностью.

Ось Y - пг/г/мл

Как видно из рисунка 3, на котором представлены уровни IL-6 в ПЗ опухолей М0 и М1 со степенью дифференцировки G3, в метастазирующих опухолях данный показатель оказался статистически достоверно выше, чем в неметастазирующих (14,9±1,1 и 7,1±3,1 пг/мл/г соответственно, t>2), что представляется объяснимым с учетом известных видов его биологической активности, связанной с индукцией пролиферации, метапластических изменений и неоангиогенеза.

Обсуждение результатов исследования