Снижение калорийности питания изменяет активность ферментов антиоксидантной системы у мышей с меланомой В-16

2ФГАОУВО «Сибирский федеральный университет»

Ключевые слова: ограничение калорийности, меланома В-16, сиртуины, окислительный стресс, ферменты антиоксидантной системы.

FGBOU VO «Krasnoyarsk state medical university named after professor V.F. Voino-Yasenetsky Ministry of Health of Russia»

2FGAOU VO «Siberian federal university», Krasnoyarsk

Keywords: calory restriction, melanomaB-16, sirtuins, oxidative stress, antioxidant enzymes.

Существует определенное количество исследований, показывающих положительное влияние ограничения калорийности при злокачественных новообразованиях, в частности меланоме [4].

Тем не менее механизмы опухольсупрессивного эффекта ограничения калорийности до сих пор окончательно не исследованы.

Цель исследования

Изучение влияния низкокалорийной диеты на экспрессию гена sirtl и активность ферментов антиоксидантной системы в опухолевых клетках и клетках печени у мышей линии С57ВЕ6 с экспериментальной меланомой В-16.

Материалы и методы исследования

Объект исследования - самки мышей линии C57/BL6 массой 20-22 г. Мышей содержали при постоянной температуре 20-22°C со световым периодом 12 ч в индивидуальных клетках. Диета животных была строго сбалансирована, для чего использовался гранулированный полнорационный комбикорм «Чара» (ГОСТ ISO 9001- 2011(ISO 9001:2008).

Список экспериментальных процедур одобрен этическим комитетом ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (протокол № 57/2014).

Для исследований в качестве контрольных образцов использовали мышей, находящихся на базовой диете (adlibitum), - 1-я группа, и на диете, составляющей 70% от диеты, удовлетворяющей физиологические потребности животных, - 2-я группа. Опытным животным подкожно перевивали 5х10⁵ клеток меланомы B-16 в 0,5 мл раствора Хенкса. После трансплантации опухоли меланомы В-16 мыши случайным образом были разделены на две опытные группы: 3-я группа (7 мышей) получала диету 1-й группы; 4-я группа (8 мышей) получала диету 2-й группы. На 22-е сутки, после эвтаназии животных, опухоль иссекали в пределах непораженных тканей и извлекали печень.

Уровень экспрессии гена sirtl определяли в опухолевой ткани и оценивали с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени. Постановку метода осуществляли на приборе StepOne™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Сингапур). Очищенную РНК предварительно подвергали обратной транскрипции со случайными гексамерными праймерами. Реакционная смесь для обратной транскрипции содержалa 5 мкл ОТ-буфера, 1 мкл 25 мМ случайных праймеров, 2 мкл 20 мМ дитиотреитола, 1 мкл 25 мМ дНТФ, 5 е.а. фермента MMLV обратной транскриптазы, 4 мкл раствора РНК (около 2 мкг), воду без нуклеаз до конечного объема 25 мкл. 2 мкл полученной комплементарной ДНК добавляли в ПЦР-смесь следующего состава: 10 мкл ПЦР-смеси (Синтол, Москва, Россия), 1 мкл смеси праймеров и зонда, специфичных для участка гена sirt1 мыши, 12 мкл безнуклеазной воды. Реакцию проводили в соответствии с указаниями производителя праймеров. По окончании реакции относительный уровень экспрессии сиртуина 1 рассчитывали по методу AACt [5]. В качестве внутреннего контроля использовали экспрессию гена бета-актина.

Гомогенат печени использовали для определения содержания малонового диальдегида, активности антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КТ), глутатионпероксидазы (ГПО) и глутатион^-трансферазы (rST).

Содержание малонового диальдегида (МДА), продукта перекисного окисления липидов, оценивалось по уровню хромогена, образующегося при взаимодействии МДА с 2- тиобарбитуровой кислотой, интенсивность окраски которого регистрировалась при длине волны 532 нм. Уровень МДА рассчитывали, учитывая коэффициент молярной экстинкции образовавшегося хромогена, равный 1,56*10⁵М'¹*см'¹, и выражали в мкмоль/г белка [6].

В основу метода определения активности СОД положено ингибирование реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде в присутствии СОД вследствие дисмутации супероксидных анион-радикалов, которые являются продуктом одного из этапов. Об интенсивности аутоокисления адреналина судили по динамическому нарастанию поглощения при длине волны 347 нм, обусловленному накоплением продукта окисления, не описанного ранее в литературе, и опережающему по времени образование адренохрома, имеющего максимум поглощения при 480 нм [7].

Определение активности КТ основано на образовании окрашенного в желтый цвет комплекса не разрушенной в ходе каталазной реакции перекиси водорода с молибдатом аммония. Активность КТ рассчитывали, используя коэффициент экстинкции пероксида водорода, равный 22,2 * 10³ мкМ^-1 * см^-1 при длине волны 400 нм, и выражали в мкмоль/мин * г белка [8].

Активность ГПО оценивали по изменению содержания Г8Т в пробах до и после инкубации с модельным субстратом - гидропероксидом трет-бутила - в ходе цветной реакции с ДТНБК [8]. Активность Г8Т определяли по скорости образования конъюгатов между Г8Т и 1-хлор-2,4-динитробензолом. Увеличение концентрации конъюгатов в ходе реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 340 нм. Активность фермента рассчитывали с учетом коэффициента молярной экстинкции глутатион-S- конъюгатов, 9600 М'¹см'¹ [8].

По результатам исследования была сформирована база данных, на основе которой с помощью программы Statistica 8 осуществлялся статистический анализ при подсчете медианы и интерквартильного разброса (С25-С75 процентили). Проверку гипотезы о статистической значимости различий показателей двух выборок проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что ограничение калорийности питания у животных с экспериментальной меланомой не приводит к достоверному повышению содержания МДА в гомогенате печени. Активность СОД и КТ при низкокалорийной диете достоверно не изменяется. Ограничение калорийности у животных с меланомой вызывает снижение активности ГПО и 1УГ в гомогенате печени в 1,6 и 1,2 раза соответственно (табл. 1).

Таблица 1 Изменение активности показателей антиоксидантной системы и содержания МДА при ограничении калорийности у мышей с экспериментальной меланомой; группа 3 - базовая диета, группа 4 - диета с ограничением калорийности (70% от базовой диеты)

Выявлено усиление экспрессии гена sirtl в группе мышей, находящихся на диете с ограничением калорийности питания после перевивки клеток опухоли - «Опухоль + ОК», по сравнению с контрольной группой мышей без опухоли и с содержанием на рационе с ограничением калорийности - «ОК». При сравнении группы мышей, находящихся на базовой диете после перевивки клеток опухоли - «Опухоль + БД», с группой мышей без опухоли, находящихся на рационе питания без ограничения калорийности - базовая диета (БД), таких изменений экспрессии гена sirtl не выявляется. Это может указывать на положительное влияние ОК на экспрессию данного гена и способно опосредовать ряд механизмов, направленных на замедление темпов развития опухоли (табл. 2).

Таблица 2

Влияние диеты на изменение экспрессии гена sirtl у мышей с экспериментальной меланомой.

Примечание: ОК - ограничение калорийности; БД - базовая диета. Р1,2=0,00796; ?2,4=0,039

Ферментативная активность ЗІЯТІзависит от уровня NAD+, что во многом определяет его регулирующую роль в клеточном метаболизме. Ограничение калорийности питания можно рассматривать как стрессовый фактор, влияющий на активность белков семейства сиртуинов (и SIRT1 в том числе). Вмешательство в изменение активности SIRT1 с помощью ограничения калорийности питания может быть одним из направлений, влияющих на процессы меланогенеза.

Усиление экспрессии гена sirtl в тканях опухоли у мышей при ограничении калорийности питания по сравнению с группой мышей, находящейся на базовой диете, в наших экспериментах указывает на положительное влияние ОК на экспрессию данного гена и может опосредовать ряд механизмов, направленных на замедление темпов развития опухоли. Эти механизмы в существенной степени могут быть реализованы через изменение баланса клеточных про- и антиоксидантных систем.

СОД катализирует реакцию дисмутации супероксиданиона с образованием пероксида водорода. КТ обеспечивает удаление пероксида водорода. ГПО катализирует восстановление органических гидроперекисей и Н2О2. Одновременно в результате действия NADPH- зависимой глутатионредуктазы происходит восстановление глутатиона, rST использует глутатион для коньюгации с гидрофобными соединениями и восстановления органических пероксидов. rST осуществляет обезвреживание различных органических соединений, к числу которых относятся вещества, обладающие канцерогенным действием.

Таким образом, ограничение калорийности не приводит к усилению продукции свободных радикалов и увеличению степени окислительного стресса в клетках печени мышей с экспериментальной меланомой, а способствует повышению антиоксидантной активности клеток печени. Можно предположить, что данные изменения способны оказывать воздействие на развитие клеток меланомы В-16 в целом. Известно, что одной из особенностей метаболизма, присущих опухолевым клеткам, является повышение продукции активных форм кислорода. Возможно, снижение уровня свободных радикалов способно изменять активность ряда сигнальных путей, в том числе МАРК-сигнальных путей (ERK и JNK), и инициировать гибель клеток меланомы путем апоптоза. Кроме того, установлено, что изменение уровня свободных радикалов способно модулировать действие некоторых противоопухолевых препаратов, в частности, влияя на NF-kB сигнальный путь [9].

Однако получены данные, что sirtl способствует аутофагии, инициированной действием Н2О2 при окислительном стрессе. Предполагают, что в реализации этого эффекта принимают участие III РІЗК/беклин 1 и сигнальный путь mTOR [10]. Следовательно, повышение экспрессии sirtl может способствовать как гибели опухолевых клеток (аутофагия), так и снижению процесса апоптоза (рис.).

Механизм влияния ограничения калорийности на гибель опухолевых клеток

Заключение

Таким образом, эффекты, вызванные снижением калорийности рациона мышей с меланомой, имеют разнонаправленный характер, а их дальнейшее исследование играет важную роль в понимании фундаментальных механизмов процесса канцерогенеза.

Список литературы