Влияние ишемии на содержание пуринов в корковом веществе почек в эксперименте

Размещено на http://www.allbest.ru/

Влияние ишемии на содержание пуринов в корковом веществе почек в эксперименте

Дурицкий М.Н.¹, Франциянц Е.М.¹, Каплиева И.В.¹, Кит О.И.¹, Димитриади С.Н.¹, Непомнящая Е.М.¹

¹ФГБУ «Научный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России, Ростов-на-Дону

Пурины - это многофункциональные соединения, по уровню которых можно судить о степени гипоксического повреждения тканей и сохранности генетического материала клеток. Цель - изучить особенности пуринового метаболизма в корковом веществе почек у молодых самцов крыс в зависимости от продолжительности ишемии одной из них. На 60 самцах была исследована динамика аденина (А), гуанина (Г), ксантина (К), гипоксантина (ГК) и мочевой кислоты (МК) в корковом веществе почек: ишемизированной и контрлатеральной - после ишемии одной из них в течение 5, 10, 15, 20 и 25 мин, контроль - интактные крысы. Метод определения - прямая спектрофотометрия водного раствора термокоагулянта лизатов клеток почек. Установлено, что в ишемизированной почке через 5-10 мин ишемии количество пуринов, кроме МК, увеличивалось в среднем в 1,2 раза (р<0,05), а через 25 мин ишемии - уменьшалось: количество Г и ГК восстанавливалось до нормы, а уровни А и К становились в 1,5 раза (р<0,05) меньше значений в интактных почках. Концентрация пуринов в контрлатеральной почке возрастала через 15 мин ишемии в среднем в 1,4 раза (р<0,05). Содержание всех пуринов, кроме МК, максимально уменьшалось через 25 мин, при этом в ишемизированной почке содержалось меньше А и Г, чем в контрлатеральной. Таким образом, установлено, что у молодых самцов обе почки «отвечают» одинаковой динамикой пуриновых метаболитов в корковом веществе на ишемию одной из них, при этом в ишемизированном органе изменения возникают раньше и в большей степени, что надо учитывать при проведении оперативных вмешательств на почках у людей.

Ключевые слова: пурины, ишемия, почки, крысы, самцы.

ISCHEMIA EFFECT ON THE PURINE CONTENT IN THE CORTICAL SUBSTANCE DURING THE EXPERIMENT

Duritskiy M.N.¹, Frantsiyants E.M.¹, Kaplieva I.V.¹, Kit O.I.¹, Dimitriadi S.N.¹, Nepomnyashchaya E.M.¹

¹ Scientific Medical Research Centre for Oncology, Rostov-on-Don

Purines are multifunctional entities, the level of which can be used to determine the degree of hypoxic tissue damage and the safety of the cells genetic material. The aim of this paper is to study the features of purine metabolism in the cortical substance in young male rats, depending on the duration of ischemia of one of them. The dynamics of adenine (A), guanine (G), xanthine (X), hypoxanthine (HX), and uric acid (UA) was studied on 60 males in the cortical substance: ischemic and contralateral, after ischemia of one of them within 5, 10, 15, 20 and 25 minutes, the control was intact rats. The method of determination is direct spectrophotometry of aqueous solution of thermocoagulant of renal cell lysates. It was found that in the ischemic kidney after 5-10 minutes of ischemia, the amount of purines, except for UA, increased by an average of 1.2 times (p<0.05), and decreased after 25 minutes; the amount of G and HX was restored to normal, and the levels of A and X became 1.5 times (p<0.05) less than intact values. The concentration of purines in the contralateral kidney increased after 15 minutes of ischemia, by 1.4 times (p<0.05) on average. The content of all purines, except for UA, decreased as much as possible after 25 minutes, while the ischemic kidney contained less A and G than the contralateral one. Thus, it was found that both kidneys of the young males «respond» to ischemia of one of them with the same dynamics of purine metabolites in the cortical substance, while changes in the ischemic organ appear earlier and to a greater extent, which should be taken into account when performing surgical interventions on human kidneys.

Keywords: purines, ischemia, kidneys, rats, males.

Пуриновый обмен - совокупность процессов синтеза и катаболизма пуриновых нуклеотидов (АТФ и др.), нуклеозидов (аденозина, гуанозина и др.) и оснований (аденина, гуанина, ксантина). Конечным продуктом метаболизма пуринов является мочевая кислота (2,6,8-триоксипурин). Эти вещества участвуют в основных анаболических процессах, обеспечивающих жизнедеятельность организма, в том числе в передаче и хранении генетической информации, делении клеток. Пурины не только являются основными компонентами нуклеотидов, но и обеспечивают клетки необходимой энергией для пролиферации и выживания. Как следствие, пурины и их производные широко участвуют в различных биологических процессах, включая иммунные ответы и взаимодействие «хозяин - опухоль» [1], а нарушение их обмена связано с прогрессированием рака [2]. Известно, что под влиянием ишемии содержание пуринов в организме изменяется [3-6]. Следовательно, изучать пурины можно, с одной стороны, в качестве индикатора ишемии и окислительного стресса в тканях, с другой - в качестве индикатора повреждения генетического материала клеток и нарушения способности их к делению.

Почечно-клеточная карцинома - одно из наиболее распространенных злокачественных новообразований органов мочеполовой системы, диагностируемое, как правило, на ранней (локализованной) стадии развития опухолевого процесса. Оптимальным методом лечения локализованного почечно-клеточного рака является традиционная или роботизированная лапароскопическая частичная нефрэктомия, которая обеспечивает не только равные с радикальной нефрэктомией онкологические исходы, но и, в отличие от нее, лучшее сохранение функции почек [7-9]. Вместе с тем на фоне удовлетворительных онкологических результатов резекции почки по поводу локализованного рака ишемия-реперфузия, которая сопровождает выполнение таких операций, провоцирует риск развития острой почечной недостаточности, особенно у пациентов с хронической болезнью почек [10].

Когда доставка кислорода нарушается или снижается, в организме развиваются многочисленные адаптивные механизмы, способствующие выживанию клеток в гипоксическом состоянии. Обычно такая гипоксическая реакция прекращается, когда уровень кислорода восстанавливается. Ситуация осложняется, если сохраняется стресс, связанный с ишемией [11].

Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей пуринового метаболизма в корковом веществе почек у молодых самцов крыс в зависимости от продолжительности ишемии одной из них.

пуриновый метаболизм почка ишемия

Материал и методы исследования

Была изучена динамика пуринов в корковом веществе обеих почек у молодых самцов (п=50): ишемизированной (правой) и контрлатеральной (левой) - после ишемии одной из них в течение 5, 10, 15, 20 и 25 мин. Исследование проводилось на модели «две почки, один зажим». Наркотизированные животные размещались в положении «на спине». Шерсть на животе удаляли, операционное поле обрабатывали антисептиком. Разрез проводили вдоль белой линии живота от мечевидного отростка грудины до лобка, рассекали кожу и соединительную ткань. Выделяли сосудистую ножку правой почки, которую затем клипировали зажимом Холстеда. Рану на протяжении периода ишемии прикрывали салфеткой, смоченной стерильным физраствором. Через определенные промежутки времени (5, 10, 15, 20 и 25 мин) крыс декапитировали на гильотине, не выводя из наркоза и не снимая зажима с почечной ножки. В качестве контроля исследовали молодых самцов без ишемии (n=10).

Работа с животными осуществлялась в соответствии с правилами «Европейской конвенции о защите животных, используемых в экспериментах» (Директива 86/609/ЕЕС) и приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Исследование было одобрено биоэтическим комитетом по работе с животными ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, протокол № 3/11 от 26.11.2014 г.

У животных исследовали обе почки, которые разделяли послойно на корковую и мозговую составляющие, и определяли их вес. 100 мг ткани коркового вещества промывали 1хфосфатно-солевым буфером (PBS), гомогенизировали в 1 мл ^PBSи оставляли на ночь при -20°C. Для полного разрушения клеточных мембран проводили два цикла замораживания- оттаивания. Полученную суспензию центрифугировали 5 мин при 5000 g (2-8°C). Супернатант отбирали, делили на аликвоты и хранили при -20°C. Перед измерением размороженные образцы центрифугировали. В тканях определяли пурины: аденин, гуанин, ксантин, гипоксантин и мочевую кислоту - методом прямой спектрофотометрии в водном растворе термокоагулянта лизатов клеток почек по методике Е.В. Орешникова и др. (2008).

Ксантиноксидаза является ключевым ферментом окисления пуринов. Из данных литературы известно, что у млекопитающих фермент ксантиноксидоредуктаза в нормальных условиях находится преимущественно в ксантидегидрогеназной форме. При ишемии органов наблюдается быстрая (в течение нескольких минут) трансформация ксантандегидрогеназы в ксантиноксидазу. Такой же быстрый переход фермента в оксидазную форму наблюдается при гомогенизации тканей, что существенно затрудняет определение истинного соотношения разных изоформ фермента invivo[12]. Все вышесказанное обусловило наш подход к анализу эффективности работы ксантиноксидазы - по вычислению соотношения конечного продукта фермента к его исходному субстрату. На 1-м этапе своей работы ксантиноксидаза превращает гипоксантин в ксантин (субстрат - гипоксантин, продукт - ксантин), на 2-м этапе ксантиноксидаза превращает ксантин в мочевую кислоту (субстрат - ксантин, продукт - мочевая кислота), и, когда мы в целом характеризуем работу фермента, в качестве субстрата выступает гипоксантин, в качестве конечного продукта - мочевая кислота.

Об интенсивности пуринового обмена судили, рассчитывая величину, представляющую собой отношение концентрации гипоксантина к количеству образующихся из него продуктов: ксантина и мочевой кислоты, и определяющую уровень необратимого катаболизма пуринов. Интенсивность пуринового обмена (ИПО) = гипоксантин/(ксантин + мочевая кислота). Также вычисляли показатель тяжести гипоксии - отношение концентраций (экстинций) ксантина к гуанину. Показатель тяжести гипоксии (ПТГ) = ксантин/гуанин [3].

Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи программы Statistica 10.0. Все результаты были проверены на соответствие закону о нормальном распределении (критерий Шапиро-Уилка). Для показателей с нормальным распределением использовали критерий Стьюдента, для показателей, распределение которых не соответствовало нормальному, - критерий Манна-Уитни. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартная ошибка среднего (М±т). Значимыми считали отличия при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В ишемизированной почке у молодых самцов через 5 мин ишемии содержание гипоксантина и аденина увеличивалось в 1,2 раза (р<0,05) (табл. 1). Через 10 мин во столько же раз увеличивалась концентрация гуанина и ксантина. На 15-й и 20-й минуте содержание всех пуринов становилось нормальным, а к 25-й минуте - уменьшалось: гуанина и гипоксантина - в 1,6 раза (р<0,05) относительно 5 мин ишемии; аденина и ксантина - в 1,5 раза (р<0,05) относительно интактной ткани (табл. 1). В контрлатеральной почке концентрация всех пуринов, кроме мочевой кислоты, возрастала через 15 мин ишемии: гуанина, гипоксантина, аденина - в 1,4 раза (р<0,05), ксантина - в 1,3 раза (р<0,05) (табл. 1). К 20-й минуте ишемии содержание гипоксантина, аденина и ксантина возвращалось к нормальным значениям. Через 25 мин ишемии концентрация всех пуринов уменьшалась: гуанина - в 1,6 раза (р<0,05) относительно 15-минутной ишемии, гипоксантина и аденина - в 1,7 раза (р<0,05) относительно 15-минутной ишемии и в 1,4 раза (р<0,05) относительно 5минутной ишемии; уровень ксантина становился в 1,3 раза (р<0,05) ниже, чем в интактной почке; в 1,5 раза (р<0,05) уменьшалась концентрация мочевой кислоты (табл. 1).

Таблица 1Динамика содержания пуринов (ед. экст./г ткани) в корковом веществе почек молодых самцов под влиянием ишемии