Влияние отвара можжевельника туркменского (Juniperus turcomanica) и лизата его каллусных клеток на функциональную активность лейкоцитов крови кардиохирургических больных in vitro

The authors consider that the obtained data specify anti-inflammatory and cardio protected properties of Turkmen' juniper and its callus cells lysates.

Keywords: cardio-surgical patients, turkmen' juniper (Juniperus turcomanica - JT), JT' callus cells lysates, spontaneous and soluble cardiac antigens induced peripheral blood leukocytes' migration.

Аннотация

Ключевые слова: кардиохирургические больные, можжевельник туркменский (Juniperus turcomanica), лизат каллусных клеток можжевельника туркменского, спонтанная и индуцированная растворимым кардиальным антигеном миграция лейкоцитов крови.

Хирургическое лечение самой различной патологии сердца позволяет сохранить жизни огромного числа пациентов [1]. Тем не менее консервативная медикаментозная терапия болезней сердца и сосудов (в том числе с использованием фитопрепаратов) остается актуальной не только при лечении патологии миокарда, но и для профилактики послеоперационных осложнений у кардиохирургических больных [2; 3].

Можжевельник (Juniperus) - растение из семейства кипарисовых (Cupressaceae), издревле используется в народной и официальной медицине. Флавоноиды, содержащиеся в можжевельниках, широко используются в кардиопатологии, поскольку обладают способностью понижать уровень холестерина в крови [4], повышать активность ферментов антиоксидантной защиты в тканях миокарда [5]. Однако в списке используемых в фитотерапии можжевельников не значится можжевельник туркменский (Juniperus turcomanica).

Juniperus turcomanica B. Fedtsch. (МТ) - одна из разновидностей можжевельников, произрастает в предгорьях Юго-Западного и Центрального Копетдага (Туркменистан). Целебные свойства можжевельника туркменского изучаются со времен Авиценны и продолжают привлекать внимание большого числа современных исследователей. Плоды МТ, так же как европейских представителей этого вида, богаты сахаристыми веществами, гликозидами, кумаринами, флавоноидами, что позволяет допустить его высокую биологическую активность и эффективность при лечении заболеваний сердца и сосудов [6].

Внимание исследователей во всем мире все более привлекают не только и не столько лекарственные растения, сколько культуры их каллусных клеток. Каллусные клетки (КК) - по сути, стволовые, тотипотентные клетки, культуры которых рассматривают как источник получения нового поколения фитопрепаратов [7]. В настоящее время из биомассы каллусных клеток культуры ткани живучки мохнатой (Ajuga reptans'), раувольфии змеиной (Rauwolfia serpentina Benth.) налажено производство антиаритмического лекарственного средства «Аймалин» [8]. Однако в списке культур каллусных клеток, используемых в медицине, МТ (Juniperus turcomanica) не значится.

Целью настоящего исследования являлось определение характера влияния 5% отвара можжевельника туркменского (Juniperus turcomanica) и лизата его каллусных клеток (ЛКК) на миграционную активность лейкоцитов периферической крови (ЛПК) кардиохирургических больных (КХБ) in vitro.

Материалы и методы исследования. В исследовании использованы ЛПК 35 кардиохирургических больных обоего пола, в том числе - 20 больных с декомпенсированным пороком митрального клапана (ДКПМК), 3 - миксомой сердца (МКС), 12 - с ИБС. Средний возраст больных составил 39,7±1,9 года. В контрольную группу вошли 30 практически здоровых лиц (ПЗЛ) - волонтеров обоего пола в возрасте от 18 до 45 лет (средний возраст составил 33,7±1,3 года). Кровь для исследования забирали из вены обследуемых лиц. Кардиохирургических больных обследовали до и после соответствующего хирургического лечения.

Миграционная активность ЛИК изучена в модифицированной реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) [9]. Результаты выражены в виде индекса миграции лейкоцитов (ИМЛ). Растворимый кардиальный антиген (РКА) приготовлен методом водно солевой экстракции из кусочков ткани сердца пяти молодых здоровых человек в возрасте от 18 до 30 лет, погибших от случайной причины. Полученный антиген дозирован по содержанию белка - не менее 20 мкг/мл [10].

5% отвар МТ можжевельника туркменского (Juniperus turcomanica) приготовлен в соответствии с требованиями Фармакопеи [11].

Каллусные клетки МТ выращены на среде Мурасиге - Скуга [12] из экспланта хвои растения. Лизат готовили из цельной ткани каллуса следующим образом: 50 мг ткани каллуса гомогенизировали в 10 мл физиологического раствора хлорида натрия при помощи гомогенизатора Поттера. Гомогенат замораживали при -20 °С. Процедуру замораживания- оттаивания повторяли трижды. Затем гомогенат сутки выдерживали при температуре + 4 °С, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 60 минут. После центрифугирования супернатант отбирали в стерильную пробирку и хранили до использования при -20 °С. Все манипуляции проведены в стерильных условиях бокса с соблюдением правил асептики.

При постанове РТМЛ в камеры вносили среду культивирования и погружали капилляры с кровью обследуемых лиц. До погружения капилляров и через 5 минут после предварительного внесения РКА в лунки вводили по 1,0 мкл 5% отвара МТ или лизата его КК (ЛКК). По истечении времени инкубации капилляры удаляли и подсчитывали индекс миграции лейкоцитов.

Полученные данные обработаны при помощи программы SPSS statistic.

Результаты исследования и их обсуждение. Характеристика обследованных лиц представлена в таблице 1.

Таблица 1/ Группы обследованных лиц

Примечание: * - соответствует p<0,05 по отношению к группе контроля.

Из таблицы 1 следует, что было обследовано 23 кардиохирургических больных (КХБ) женского пола и 30 - мужского. Группа больных с миксомой сердца (МКС) представлена больными исключительно женского пола, в остальных группах преобладали больные мужского пола. Возраст больных с ишемической болезнью сердца (ИБС) выше по сравнению с другими группами КХБ, но достоверно отличается только от возраста лиц контрольной группы (p<0,05).

Исследования показали, что индекс миграции лейкоцитов (ИМЛ) в присутствии РКА в целом по группе КХБ достоверно повышен по отношению к группе практически здоровых лиц (ПЗЛ) и составляет 127,5±21 против 57,3±1,5 (p<0,05). Величина индекса в определенной степени зависит от диагноза. Так, при поступлении в клинику максимальная величина ИМЛ наблюдается у больных с ДКПМК (p<0,01 по отношению к группе здоровых лиц), минимальная - с МКС (p<0,05 по отношению к группе здоровых лиц) (таблица 2).

Таблица 2. Значение индекса миграции лейкоцитов у кардиохирургических больных (КХБ) в зависимости от диагноза и времени обследования

Достоверного различия величины ИМЛ в зависимости от диагноза нами не выявлено (p>0,05 во всех случаях). В течение первых трех суток после операции величина ИМЛ нарастает во всех группах больных, с 5-7 суток прогрессивно снижается как по отношению к исходному уровню, так и по отношению к 3-м суткам после операции (p<0,05 во всех случаях).

Рис. 1. Структура модуляций величины ИМЛ в присутствии отвара можжевельника (А, В) и лизата его каллусных клеток (C, D) в зависимости от группы обследованных лиц

Как отвар можжевельника, так и лизат его каллусных клеток in vitro в значительно большем числе случаев и в большей степени тормозят миграцию лейкоцитов крови КХБ, индуцированную кардиальным антигеном (рисунок 2).

Рис. 2. Значения ИМЛ в зависимости от индуктора миграции лейкоцитов и группы обследованных лиц

На диаграмме видно, что присутствие кардиального антигена (КАГ) тормозит миграцию лейкоцитов практически здоровых лиц, в то время как у КХБ резко стимулирует ее (p<0,01). Отвар можжевельника и лизат его каллусных клеток модулируют как спонтанную, так и индуцированную КАГ миграцию лейкоцитов, но в различной степени. Так, в присутствии лизата каллусных клеток ИМЛ у практически здоровых лиц (ПЗЛ) снижается в 1,2 раза (то есть практически не изменяется), но у кардиохирургических больных (КХБ) он снижается в 1,9 (p<0,01). Кроме того, они существенно тормозят миграцию лейкоцитов крови КХБ, индуцированную кардиальным антигеном (КАГ). При этом ИМЛ в присутствии лизата каллусных клеток снижается в 1,57 раза (p<0,5), в присутствии отвара МТ - в 1,79 раза (p<0,5). То есть лейкоциты крови КХБ значительно более чувствительны к препаратам можжевельника in vitro по сравнению с лейкоцитами практически здоровых лиц.

Известно, что миграция лейкоцитов (нейтрофилов, лимфоцитов, макрофагов) является ключевым событием в реализации иммунного ответа организма на чужеродные антигены [13]. Направленная миграция лейкоцитов in vivo характерна для воспалительных процессов самой различной этиологии, и от этого в значительной мере зависит исход воспаления. Направление миграции лейкоцитов и ее скорость определяются большим числом внешних факторов (их называют хемоаттрактантами) и их градиентом. Примерами хемоаттрактантов являются 5-й компонент комплемента (С5), интерлейкин 8 (IL-8), N-формил-метил-лейцил- фенилаланин (fMLP) и другие гликопротеиновые молекулы [14]. Способность препаратов можжевельника туркменского модулировать миграцию лейкоцитов крови из стеклянного капилляра in vitro соответствует свойствам хемоаттрактанов. Знак модуляции миграции, скорее всего, зависит от экспрессии соответствующих рецепторов на поверхности клеток- мишеней (например, кардиомиоцитов). В результате чего препараты способны как тормозить, так и стимулировать атаку тканей миокарда аутологичными, сенсибилизированными к кардиальному антигену лейкоцитами. Другими словами, препараты можжевельника, и особенно его каллусных клеток, обладают цитокиноподобными свойствами и могут влиять на функциональную активность рас познающих Т-лимфоцитов (TLR) и, следовательно, на характер их взаимодействия с мишенью - в данном случае с мембранными антигенами кардиомиоцитов.

Вполне возможно, что на сенсибилизированных к кардиальному антигену лейкоцитах имеется рецептор к определенным молекулам отвара можжевельника туркменского и/или его каллусных клеток. Во всяком случае каллусные клетки, как любые стволовые клетки, содержат огромный набор биологически активных молекул, участвующих в процессах активации и пролиферации клеток [15], часть из которых может играть роль хемоаттрактантов или, напротив, блокаторов интегринов и/или молекул адгезии.

На наш взгляд, совокупность полученных данных позволяет считать, что использование отвара можжевельника (и в том числе Juniperus turcomanica) опосредовано не только его антиоксидантными свойствами [4; 5], но и способностью как самого отвара, так и лизата его каллусных клеток модулировать иммунный ответ лейкоцитов крови человека на кардиальные антигены. Высокая чувствительность лейкоцитов крови кардиохирургических больных к отвару можжевельника туркменского и лизату его каллусных клеток in vitro может быть вполне реализована in vivo.

Выводы