Хроматографическое определение витаминного состава расторопши пятнистой (Silybum marianum l.)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Хроматографическое определение витаминного состава расторопши пятнистой (Silybum marianum l.)

Пестова Наталия Юрьевна

кандидат химических наук, доцент кафедры биологии и химии Ульяновский государственный педагогический университет

Опарина Светлана Николаевна

кандидат биологических наук, доцент кафедры биологии и химии Ульяновский государственный педагогический университет

Summary

CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION of VITAMIN COMPOSITION of milk THISTLE (SILYBUM MARIANUM L.)

Pestova N.Yu.

PhD in chemistry, associate Professor of biology and chemistry Ulyanovsk state pedagogical University

Oparin S.N.

PhD in biology, associate Professor of biology and chemistry Ulyanovsk state pedagogical University

Chromatographic methods are widely used to study organic and inorganic mixtures. This method simultaneously divides the sample into separate components and quantifies each of them. As a result of researches the qualitative and quantitative composition of water - and fat-soluble vitamins in biologically active additive (BAA) of Thistle was determined.

Key words: biologically active additive, vitamins, paper chromatography, milk Thistle, solvent. Аннотация: Для изучения органических и неорганических смесей широко используются хроматографические методы. В этом методе одновременно происходит разделение пробы на отдельные компоненты и количественное определение каждого из них. В результате исследований был определен качественный и количественный состав водо- и жирорастворимых витаминов в биологически активной добавке (БАД) расторопши пятнистой.

Ключевые слова: биологически активная добавка, витамины, бумажная хроматография, расторопша, растворитель.

Постановка проблемы

Витамины - это биологически активные органические соединения, необходимые для протекания обменных процессов в организме. Биохимическая роль витаминов состоит в том, что они являются коферментами или их составной частью. Большинство витаминов не синтезируется в организме человека и поступает с пищей. При недостаточном содержании витаминов в пище развивается гиповитаминоз или авитаминоз. Появление на фармацевтическом рынке многокомпонентных витаминных препаратов ставит задачу определения их состава и содержания различных витаминов, количество которых может сильно варьировать. Определение витаминов проводят различными методами. Наиболее известны из них титриметрические, колориметрические, флуориметрические. Данные методики являются, как правило, трудоемкими, требуют больших затрат времени и реактивов.

Такие понятия как "биологически активные добавки к пище", "нутрицевтики", "парафармацевтики" вошли и в нашу повседневную жизнь, и в современную медицину сравнительно недавно [1]. В то же время, эмпирический, культовый, интуитивный поиск и применение с лечебно-профилактическими целями различных биологически активных природных компонентов растительного, животного и минерального происхождения известны с древнейших времен. В последние десятилетия количество экспериментальных и клинических исследований в области питания настолько стремительно растет, что многие специалисты говорят буквально о формировании новой, пограничной между наукой о питании и фармакологией области знаний - фармаконутрициологии [2].

Сейчас уже все знают, и никто не сомневается, что здоровье человечества ухудшается с каждым днем. На это есть ряд весьма существенных причин [3]. Это ухудшающаяся с каждым днем экологическая обстановка, неправильное питание, постоянная нехватка нашему организму необходимых для его существования микро и макроэлементов (кальция, селена, йода, цинка, магния и др.), дефицит витаминов (витамины подгруппы В, ретинола (А) и бета-каротина, токоферола (Е), витамина С, D и др.), малоподвижный образ жизни.

Анализ последних исследований и публикаций

Известны способы идентификации, разделения и количественного определения ЖРВ в субстанциях одно- и многокомпонентных лекарственных форм, премиксах, биологически активных добавках. Недостатком имеющихся методик является нехватка квалифицированных кадров, дорогостоящего оборудования, реактивов и материалов.

Многие ведущие отечественные и зарубежные нутриционисты считают, что наиболее быстрым, экономически приемлемым и научно обоснованным путем решения обсуждаемой проблемы (в том числе и для экономически развитых стран) является широкое применение в повседневной практике питания биологически активных добавок к пище. В условиях экономической нестабильности структура питания населения претерпевает существенные изменения в сторону усугубления дисбаланса основных компонентов рациона.

Систематические эпидемиологические исследования, проводимые Институтом питания РАМН в различных регионах России в последние несколько лет, свидетельствуют о том, что витаминный статус населения России (по результатам изучения фактического питания более 100 тысяч человек - обобщенные данные 2005 - 2015 гг.) составляет: 70-100% - дефицит аскорбиновой кислоты (витамин С), 40-80% - дефицит витаминов В1, В2, В6 и фолиевой кислоты, 40-60% - дефицит бета- каротина [4, 5].

Выделение нерешенных ранее частей общей проблемы

В противоположность готовым лекарственным формам, которые содержат относительно хорошо изученные наполнители, биологические пробы содержат целый ряд неизвестных белков, солей и т.п., которые могут серьезно препятствовать правильному определению анализируемых компонентов. В последние десятилетия для изучения органических и неорганических смесей широко используются хроматографические методы. Однако, низкие концентрации анализируемых компонентов создают дополнительные затруднения [4, 5].

Сорбенты с химически связанными слоями плохо смачиваются некоторыми растворителями, что препятствует проникновению пробы в слой. Это проявляется при работе с обращено-фазовыми слоями и пробами, растворенными в смесях органических растворителейс водой. В этом случае в качестве растворителя при нанесении пробы и для сведения к минимуму размывание пятна, а также при повторном нанесении малых объемов пробы на слой сорбента приходится использовать ацетон.

В случае силикагеля вследствие того, что он смачивается почти всеми растворителями, для выбора растворителя первостепенное значение имеет то, насколько сильно он размывает пятно пробы при нанесении.

Цель статьи

Целью нашей работы была разработка экспрессного метода определения витаминов в комплексном поливитаминном препарате. При исследовании биодобавки расторопши пятнистой (8ПуЪиш шапапиш Ь.) необходимо решить ряд сложных задач по подбору условий разделения, подготовки пробы, которые влияют на правильность и производимость анализа. Первой и самой главной целью является достижение желаемого разделения; вторая цель - оптимизация коэффициента разделения; третья - сведение к минимуму цены и трудностей работы.

Изложение основного материала

В настоящее время тонкослойная хроматография занимает одно из ведущих мест в качественном и полуколичественном анализе фармацевтических объектов. Классическая, наиболее простая и широко используемая методика тонкослойной хроматографии включает проведение следующих основных операций:

- нанесение анализируемой пробы на слой сорбента;

- разделение компонентов пробы на отдельные зоны в потоке подвижной фазы;

- обнаружение зон на слое сорбента (часто с помощью реагента, образующего с разделенными веществами окрашенные соединения);

- количественная оценка полученного разделения.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) - распространенный метод хроматографического анализа небольших количеств веществ самой разнообразной природы. К достоинствам метода следует отнести простоту, наглядность и быстроту.

В ТСХ разделение компонентов осуществляется в тонком слое сорбента, нанесенного на твердую плоскую подложку. Пластины для ТСХ можно изготавливать самостоятельно, либо использовать пластины заводского изготовления, имеющие достаточно широкий ассортимент как по типу сорбента и размерам его зерен, так и по материалу под- ложки(стекло, алюминиевая фольга или полимерная пленка). Для закрепления сорбента применяют гипс, крахмал, силиказоль и др. вещества, которые способны удерживать зерна сорбента на подложке. Слой сорбента должен быть равномерным по толщине в любом месте хроматографической пластинки [7].

В основе разделения веществ методом ТСХ лежит различие в степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на неподвижной фазе (сорбенте). Адсорбция компонентов осуществляется за счет «Ван-дер-ваальсовых» сил (физическая сорбция) или химического взаимодействия адсорбента и адсорбата (хемосорбция, ионный обмен). Разделение веществ в ТСХ может осуществляться и по распределительному механизму, когда подвижная и неподвижная фазы - несмешивающиеся друг с другом жидкости. Различие в коэффициентах распределения компонентов между фазами приводит к разделению веществ.

Качественной характеристикой вещества является величина И, которая равна отношению расстояния от стартовой линии до центра зоны вещества к расстоянию от стартовой линии до линии фронта. Значение И - величина постоянная для данного соединения в данной системе. Она зависит от ряда условий: способа элюирования, качества и активности сорбента, толщины слоя, качества растворителей, количества нанесенного вещества, длины пробега растворителей, положения стартовой линии - и почти не зависит от температуры. По этой величине проводят идентификацию компонентов в смеси. витаминный состав расторопша добавка

Популярность хроматографического анализа объясняется тем, что в этом методе одновременно происходит разделение пробы на отдельные компоненты и количественное определение каждого из них. В большинстве случаев лучшие растворители для приготовления смесей, используемых в качестве подвижной фазы в хроматографии, должны иметь определенные свойства. Растворитель должен смачивать слой сорбента и обладать слабой элюирующей силой для данной пробы при анализе на выбранном сорбенте [6]. Наиболее распространенным сорбентом является силикагель - гидратированная кремневая кислота, образующаяся при действии минеральных кислот на силикат натрия с последующей сушкой полученного золя. После размалывания золя используют фракцию определенной зернистости (обычно 5-20 мкм). Силикагель является полярным сорбентом, у которого в качестве активных центров выступают ОН-группы. Он легко сорбирует на поверхности воду и образует водородные связи [8].

Основываясь на результатах эксперимента можно сделать вывод о том, что оптимальное разделение смеси витаминов БАД осуществляется при использовании пластинок марки '^огЬйГ и обычной хроматографической бумаги. Силикагель смачивается почти любой возможной подвижной фазой и инертен по отношению к большинству соединений. Наиболее важно, что силикагель может быть использован для разделения большого многообразия химических соединений, а его хроматографические свойства в общем предсказуемы и воспроизводимы. Для расчета значений Яг и обнаружения витаминов пользовались стандартными методиками [7].Хроматографирование проводят методом восходящей хроматографии в насыщенной камере, время насыщение камеры 45 мин при 200 С. В качестве ПФ применяют смесь растворителей. Время разделения составляет 45 мин, фронт элюента 8.0 см. В качестве неподвижной фазы используются пластины марки ''8огЪШ'',промытыенепосредствен- нопереданализомсмесью хлороформ - этанол (1:1), высушенные при 200С в течение 15 минут и активированные при 1100С в течение 30 мин.

Исследование показало, что наиболее полное и надежное разделение водо- и жирорастворимых витаминов БАД из расторопши пятнистой при использовании хроматографической бумаги и пластин марки "ЗогЪШ" осуществляется на фоне смесей растворителей, указанных в таблицах 1и 2.

Таблица 1. Значение Яі- водорастворимых витаминов

Таблица 2. Значение Яй водорастворимых витаминов

Ш= Ъ / Ъ

И - расстояние пройденное образцом Иі- расстояние пройденное растворителем

При использовании хроматографической бумаги и '^огЬИГ, пропитанных льняным маслом в 10%-ном растворе толуола, разделение смеси не наблюдалось (табл. 1, 2). Для определения местоположения компонентов и идентификации конкретных соединений в ТСХ используется также проявление хроматограмм (обработка серной кислотой, парами иода и т. п.). Детекцию и идентификацию хроматографических «откликов» на поверхности неподвижного носителя производили следующии методами:

- Витамин В1 (тиамин) обнаруживали либо по его фиолетовой флуоресценции в УФ-свете, либо после опрыскивания хроматограммы свежеприготовленным раствором желтой кровяной соли К4(Ре(СМ)б);

- Витамин В2 (рибофлавин) идентифицировали при дневном свете по желтому окрашиванию и по зеленому свечению в УФ-свете;

- Витамин В5 (никотиновая кислота) - по синевато-белой флюоресценции в ультрафиолетовом свете;

- Витамин В6 (пиридоксин) обнаруживали по белой флюоресценции в ультрафиолетовом свете;

- Витамин В12 (цианкобаламин) идентифицировали при дневном свете по красному окрашиванию, в УФ по темным пятнам на ярком фоне, а также по фиолетовому окрашиванию после опрыскивания раствором иодида калия;

- Витамин Е (токоферол) обнаруживали по темным пятнам на флюоресцирующем фоне при обработке раствором хлорида железа (III);

- Витамин А (ретинол) обнаруживали в ультрафиолетовом свете, при этом пятна витамина А были темными на светлом флюоресцирующем фоне (флюоресцирует золотисто-коричневым цветом);

- Витамин Д (кальциферол) обнаруживали хлоридом сурьмы (III) или хлоридом сурьмы (V).

Необходимо помнить, что значения ЯР являются качественной характеристикой компонентов для строго определенных условий хроматографирования. Поэтому при проведении исследований веществ с предполагаемым составом применяют метод хроматографирования со свидетелем - известным веществом.

Достоинство ТСХ состоит и в том, что после хроматографирования каждое разделенное вещество можно в дальнейшем исследовать другими методами. Для этого необходимо снять соответствующий компоненту слой сорбента, элюировать из него вещество и исследовать его с помощью ИК- и УФ- спектроскопии, ЯМР и т. д. Метод ТСХ можно использовать и как препаративный, т.е. для наработки небольшого количества вещества, в том числе и для свидетеля.

Один из недостатков метода ТСХ - использование в составе подвижных фаз токсичных органических растворителей (метанол, ацетонитрил, четыреххлористый углерод и др.). В качестве элюен- тов можно применять водные растворы поверхностно-активных веществ (ПАВ), не обладающих токсичными свойствами.

Выводы и предложения

В результате исследований было установлено, что биологически активная добавка из расторопши пятнистой (8ИуЪит тапапит Ь.) содержит следующие водорастворимые витамины группы В: В1 (тиамин), В2 (рибофлавин), В5 (никотиновая кислота), Вб (пиридоксин). С ростом содержания органического компонента в подвижной фазе увеличивается значение фактора удерживания витамина В12 (циа- нокобаламин) (табл. 1). Таким образом, в нормально-фазовом режиме ТСХ возможно осуществить разделение водорастворимых витаминов группы В.

При определении жирорастворимых витаминов варьировали состав элюента, используя различные органические растворители. В таблице 2 представлены факторы удерживания витаминов А, Е и Б в зависимости от состава подвижной фазы. Из жирорастворимых витаминов БАД содержит витамин А (ретинол), Е (токоферол), Д (кальциферол).

Список литературы:

1. Беликов В.Г. Синтетические и природные лекарственные средства. - М.: Высшая школа, 1993.

2. Ботанико-фармакогностический словарь. / Под ред. К.Ф. Блиновой, Г.П. Яковлева. - М.: Высшая школа, 1990.

3. Справочник биохимика. / Пер. с англ. До- сон Р., Эллиот Д. - М.: Мир, 1991.

4. Опарина С.Н., Пестова Н.Ю. Гетерокарпия у Galinsoga рагуоНога Сау. (Asteraceae) // XX Меж-дународная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы науки XXI века. М., «Cognitio», 2017. С.11-17.

5. ОпаринаС.Н. Гетерокарпия у Galinsoga quadroradiata L. (Asteraceae) // Естественно-гуманитарные исследования, 2016. № 6. С. 25-27.

6. Пестова Н.Ю. Физико-химические методы исследования. // Учебно-методические рекомендации. - Ульяновск: ФГБОУ ВО «УлГПУ им. И.Н. Ульянова», 2017 - 21 стр.

7. Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ч. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. Т. 1,2. - М.: Мир, 1980.

Размещено на Allbest.ru