Особенности эстеразного спектра семенной плазмы мужчин, страдающих идиопатическим мужским бесплодием

Подтвержден факт гетерогенности карбоксилэстеразы семенной плазмы, минимум по двум субстратам. Впервые установлен факт появления термостабильности карбоксилэстеразы семенной плазмы у мужчин с идиопатическим бесплодием. При сравнительной оценке возможных вариантов определения активности карбоксилэстеразы показано, что лучшие результаты по специфичности и чувствительности определения термостабильного изофермента карбоксилэстеразы семенной плазмы показывает метод латекс агглютинации. В ходе разработки способа прогноза идиопатического мужского бесплодия разработан способ латекс агглютинации термостабильной карбоксилэстеразы на основе моноспецифических антител к этому ферменту. Методом ЛА в семенной плазме мужчин, страдающих идиопатическим бесплодием, термостабильная КЭ (ТКЭ) определена в 46,6% случаев, со средней концентрацией 25,8±0,8 нг/мл. В контрольной группе у фертильных мужчин ТКЭ выявлена в 1,7% случаев со средней концентрацией 5,2±0,5 нг/мл.

Ключевые слова: идиопатическое мужское бесплодие, семенная плазма, карбоксилэстераза, термостабильность, антитела, латекс агглютинация.

мужсеой бесплодие карбоксилэстераза

Keywords: idiopathic male infertility, seminal plasma, carboxylesterase, thermal stability, antibodies, latex agglutination.

Мужское бесплодие играет важную роль в 50% бесплодных браков. По данным ВОЗ [1], тщательное и полное диагностическое обследование позволяет распознавать наиболее важные причины мужского бесплодия. В таблице 1 мы привели наиболее распространенные причины мужского бесплодия по мере их встречаемости. Как видно, более чем в 30% случаев механизм развития остается нераспознанным и попадает в категорию «мужского идиопатического бесплодия».

Таблица 1 Факторы, вызывающие мужское бесплодие, и их процентное распределение у пациентов [2]

Об идиопатическом (необъяснимом, без явно установленной причины) мужском бесплодии говорят в тех случаях, когда с помощью всех существующих современных методов исследования причину бесплодия врачу-специалисту установить не удается. Идиопатическое бесплодие у мужчин (бесплодие без выявленных причин) характеризуется необъяснимым снижением качества спермы (эякулята) и/или клиническим бесплодием без снижения качества спермы [2].

Считается, что на развитие нарушений, которые приводят к ухудшению качества спермы, без изменения спермограммы влияет комбинация внутренних и внешних факторов (образ жизни мужчины, характер питание, факторы окружающей среды) - все эти факторы могут быть ответственны за мужской фактор бесплодия.

Термин «идиопатический» используется, только если проведено комплексное обследование мужчины и при этом не установлены никакие явные причинные факторы снижения качества спермы.

На образование и созревание сперматозоидов влияет образ жизни и профессия, а также факторы окружающей среды. Неблагоприятные внешние факторы способны усиливать патологические изменения мужского полового аппарата в результате прямого токсического воздействия, гормональных нарушений и избытка активных форм кислорода. Анализ спермы является первым шагом для выявления мужского фактора бесплодия.

Цель нашей работы - оценка особенностей эстеразного спектра семенной плазмы мужчин, страдающих идиопатическим бесплодием.

Материалы методы исследования. Предпринятое исследование представляет собой лабораторное изучение белков у фертильных мужчин и мужчин, страдавших бесплодием. В работе использовано 39 образцов семенной плазмы заведомо фертильных мужчин (имеют 1 2 детей) и 332 образца семенной плазмы мужчин, обратившихся в центр планирования семьи (г. Астрахань) с января 2014 по сентябрь 2018 по поводу мужского бесплодия. Все исследованные образцы классифицировались по результатам анализа амбулаторных карт и спермограмм. В результате было сформировано 3 группы исследования:

1. Фертильные. Концентрация сперматозоидов более 20 млн. Доля подвижных более 40%. Доля морфологически нормальных сперматозоидов более 5%. Группа включает 38 образцов и служит контролем.

2. Идиопатическое бесплодие. Концентрация сперматозоидов более 20 млн. Доля подвижных более 40%. Доля морфологически нормальных сперматозоидов более 5%. Группа включает 224 образца спермы мужчин без явной объективной причины бесплодия.

3. Экскреторное бесплодие. Группа включает 218 образцов спермы мужчин с установленным диагнозом и различными нарушениями спермограммы (олигоспермия, тератоспермия, астеноспермия).

После проведения анализа спермограммы образцы спермы центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 20 минут, надосадочная жидкость (семенная плазма) собиралась, маркировалась и хранилась для дальнейшего исследования при -24 °С. Общая эстеразная активность измерялась по гидролизу 1,0 мМ раствора альфа-нафтилацетата на 0,05М трис- глициновом буфере рН=7,8 за 30 мин при 37 °С. Хромогеном служил раствор прочного синего РР. Оптическая плотность измерялась при 500 нм. За единицу активности принимали количество фермента, которое отщепляет 1.0 мкмоль альфа-нафтола в минуту при 37 °С. Известно [3], что активность эстеразы в семенной плазме проявляется в слабощелочной и щелочной области рН. Мы провели определение активности эстеразы при различных рН в препаратах семенной плазмы фертильных мужчин для определения оптимума рН. Во всех случаях использовали трис-солянокислый буфер, рН которого доводили до искомого добавлением соляной кислоты в лабораторном pH-метре HI 2210. Каждое исследование проводили на трех образцах семенной плазмы с определением среднего значения. Данные этого исследования приведены в таблице 2. Как следует из таблицы 2, оптимум рН эстеразы семенной плазмы соответствует значению 7,8.

Результаты исследования и их обсуждение. Во всех последующих определениях эстеразной активности мы использовали трис-солянокислый буфер с рН=7,8, как оптимальный для определения данного фермента.

Далее мы изучали влияние ингибиторов на эстеразу семенной плазмы, так как эстеразы - большая группа ферментов, катализирующих расщепление сложноэфирных связей.

Таблица 2 Определение оптимума рН эстеразы семенной плазмы

Обычно эстеразы разделяют на четыре типа: холинэстеразы - предпочитают заряженные субстраты (эфиры холина и др.); ацетилэстеразы - предпочитают в качестве субстратов алифатические углеводороды, в частности уксусную кислоту; арилэстеразы - предпочитают в качестве субстратов ароматические углеводороды; карбоксилэстеразы - в качестве субстратов предпочитают эфиры алифатических (достаточно «длинных») соединений [4].

Все эти группы ферментов можно идентифицировать по отношению к ингибиторам. Для этого пробу семенной плазмы делили на 6 аликвот, к 5 из них добавляли различные ингибиторы до конечной концентрации, как указано в таблице 3. Анализ действий ингибиторов на эстеразу семенной плазмы показывает, что наибольшую долю в эстеразной активности семенной плазмы составляет карбоксилэстераза. Полностью отсутствует активность арилэстеразы и металлосодержащей алиэстеразы. По данным ингибиторного анализа, доля холинэстеразы в семенной плазме составляет около 10%.

Семенная плазма здоровых мужчин содержит очень высокий уровень эстеразной активности. По нашим данным, в тесте расщепления альфа-нафтилацетата она составляет в среднем 1617,5±59,0 ЕД. Мужчины, страдающие идиопатическим бесплодием, также показали высокую активность эстеразы. Она составляет в среднем 1503,5±76,5 ЕД. Это отличие недостоверно по сравнению с контролем.

На следующей стадии мы исследовали термолабильность эстеразной активности семенной плазмы. Исследование термолабильности проводили путем прогрева аликвот (0,4 мл) семенной плазмы человека в термостатируемой водяной бане от 40 до 80 °С в течение 20 мин. при каждой температуре. Семенная плазма инфертильных мужчин сохраняет 75% своей эстеразной активности при температуре 80 °С, тогда как у здоровых мужчин эта активность снижается втрое при температуре 65 °С, а при 75 °С полностью подавляется. Этот факт обнаружен нами впервые и ранее не описывался.

Образцы семенной плазмы инфертильных мужчин, обладавшие наиболее высокой эстеразной активностью, собирались нами и хранились в замороженном виде до накопления достаточного количества, необходимого для иммунизации лабораторных животных. Далее исследование проводили по определению термоустойчивости карбоксилэстеразы, т.е. в присутствии ингибитора карбоксилэстеразы 0,1М фтористого натрия в составе трис- ацетатного буфера рН=7,8, применявшегося для приготовления субстратной смеси для определения эстеразной активности. Эти эксперименты проводили с образцами спермы из 3 описанных выше групп. Из каждой группы брали по 20 образцов семенной плазмы для определения ферментативной активности. При сравнительном анализе активности КЭ в различных группах показано, что в группе идиопатического бесплодия без нарушений спермограммы достоверно (Р<0,001) выше активность термостабильной карбоксилэстеразы, выдерживающей нагревание до 70 и 80 °С. При сравнении остальных групп между собой достоверных различий не обнаружено (Р>0,05). Этот факт позволяет прогнозировать идиопатическое бесплодие у мужчин с нормальными показателями спермограммы. При использовании субстрата n-нитрофенилацетат в семенной плазме у 38 фертильных мужчин возрастной группы 20-40 лет содержание суммарной эстеразной активности (СЭА) равно 119,8±8,2 ЕД/л, интервал 84,6-156,3 ЕД/л (табл. 3). В исследуемой группе идиопатического бесплодия активность КЭ определяется в интервале 101-216 ЕД/л, среднее количество равно 188,5±6,6 ЕД/л, что на 52% ниже уровня КЭ в группе фертильных мужчин (табл. 3).

Таблица 3 Определение КЭ в семенной плазме кинетическим методом по расщеплению n- нитрофенилацетата

В результате энзимоэлектрофореза в семенной плазме 38 фертильных мужчин после инкубации электрофореграмм в смеси реагентов (субстрат нафтол-AS-ацетат, диазореактив прочный синий ББ) отмечается окрашивание фракции КЭ в зоне бета - гамма глобулинов (титр 1 - 1/2). Это не противоречит литературным данным о количестве нафтол- ацетатспецифической КЭ, равном 2-4 ЕД Боданского [4]. Мы не можем считать КЭ, выявляемую методом энзимоэлектрофореза, полностью идентичной n- нитрофенилацетатспецифической КЭ, поскольку для их идентификации используются разные субстраты и методики. Неидентичность указанных изоформ подтверждается несоответствием количественных параметров в различных группах наблюдений.

Но если мы примем за точку отсчета (за 100%) активность КЭ по расщеплению n- нафтилфацетата семенной плазмы фертильных мужчин, то выявляется другая тенденция (рис. 1).

В норме нафтол-AS-специфичная КЭ составляет по активности чуть более 8% от активности нафтилспецифической КЭ (табл. 3), а при идиопатическом бесплодии это соотношение в среднем составляет 19,5%, а в случае экскреторного бесплодия достигает 25%.

Из графика на рисунке 1 следует увеличение относительной доли нафтол-AS- специфической КЭ при идиопатическом бесплодии. Этот факт подтверждает мнение о гетерогенности [5] КЭ семенной плазмы, минимум по двум субстратам, но не представляет диагностического интереса, т.к. не позволяет выявить существенные различия.

Рисунок 1

Ранее [6] показано существование термостабильной изоформы КЭ семенной плазмы самцов крыс, которая была выделена и очищена сочетанием методов преципитации и хроматографии, и к ней были получены поликлональные антитела. По аналогичной схеме нами выделен термостабильный изофермент КЭ семенной плазмы мужчин. На основе выделенной термостабильной изоформы КЭ и антител к ней разработан латекс- агглютинационный тест.

Особенностью латекс-агглютинационного теста на КЭ является выявление эстеразной активности, связанной антителами, фиксированными на твердой фазе. В работе использовали антитела к термостабильной КЭ, полученные из моноспецифических кроличьих антисывороток к этому белку.

Антитела выделяли на аффинном сорбенте, полученном на основе цианбромированной сефарозы CL-4B и чистого препарата термостабильной КЭ (ТКЭ), полученной в первый год работы. При постановке метода в качестве твердой фазы использовали полимерные микросферы (ПМС), предварительно активированные 2% глютаровым альдегидом. 10,0 мкг антител к ТКЭ растворяли в 2,0 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,8, который содержал 12,5 г/л глутаральдегида. Сенсибилизированные ПМС центрифугировали и сохраняли при 4 °С. Далее взвесь полимерных сфер промывали. К 1 г осевшей взвеси добавляли 1 мл 2М раствора 1,6-диаминогексана и перемешивали смесь в течение 2 ч при температуре 50 °С. Концентрация адсорбированного на полимерной поверхности иммуноглобулина составляла 25,5-32,8 мкг/см³, что почти в 7 раз выше, чем при физической сорбции.

При подборе оптимальной концентрации посадочных антител использовали концентрации 5,0, 15,0, 25,0, 30,0, 40,0 мкг/мл. Концентрация антител существенно влияла наклон и рабочий диапазон калибровочной кривой при анализе на ТКЭ.

Активированные частицы ПМС промывали путем трехкратного центрифугирования, используя забуференный физиологический раствор рН=7,2, содержащий 0,5% Твин-20.

Предел чувствительности латексагглютинационного анализа на термостабильную КЭ в данном варианте метода составил 0,80 нг/мл. В отличие от ИФА наш тест втрое дешевле, не требует дополнительного оборудования и по затратам времени в 8-10 раз быстрее ИФА.

Методом ЛА в семенной плазме мужчин, страдающих идиопатическим бесплодием, термостабильная КЭ (ТКЭ) определена в 46,6% случаев со средней концентрацией 25,8±0,8 нг/мл. В контрольной группе у фертильных мужчин ТКЭ выявлена в 1,7% случаев со средней концентрацией 5,2±0,5 нг/мл.

В литературе мы не встретили аналогичных исследований изоферментов термостабильной карбоксилэстеразы в семенной плазме мужчин и считаем, что полученные результаты имеют не только научную новизну, но и практическое значение для диагностики и оценки патогенетических механизмов мужского бесплодия.

Заключение

Таким образом, в ходе выполнения работы установлены следующие характеристики эстеразы семенной плазмы мужчин: установлен средний уровень ее активности 1624,0±24,0 ЕД/мл, установлен оптимум рН, который равен 7,8. С помощью ингибиторного анализа выяснено, что около 90% активности эстеразы семенной плазмы мужчин приходится на группу карбоксилэстераз, а 10% на холинэстеразы. При анализе температурной устойчивости образцов семенной плазмы здоровых, фертильных мужчин и мужчин с идиопатическим бесплодием впервые установлен факт появления термостабильности карбоксилэстеразы семенной плазмы у мужчин с идиопатическим бесплодием. Как известно [7], изменение температурной устойчивости белков без потери их функциональных характеристик является признаком локальных изменений третичной структуры белковой молекулы. В случае бесплодия это могут быть неизвестные продукты метаболизма, не свойственные репродуктивной системе в норме. По этой причине исследование термостабильной карбоксилэстеразы является перспективным тестом прогноза идиопатического мужского бесплодия.

Список литературы