Аберантне метилювання LINE1 у хворих з парантитом на фоні цукрового діабету 2 типу та метаболічного синдрому
Метилювання LINE1 як перспективний діагностичний біомаркер і терапевтична мішень для діагностики, прогнозування і терапії багатофакторних захворювань. Застосування аберантного метилювання LINE1 у пацієнтів з хронічним генералізованим пародонтитом.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | статья |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 19.09.2021 |
| Размер файла | 232,0 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Аберантне метилювання LINE1 у хворих з парантитом на фоні цукрового діабету 2 типу та метаболічного синдрому
1Рожко П.Д., 2Дєньга О.В., 2Вербицька Т.Г., 2Дєньга А.Е., 3Бубнов В.В.
1Одеський національний медичний університет 2Державна установа «Інститут стоматології та щелепно-лицевої хірургії Національної академії медичних наук України»
3Одеський міжнародний медичний університет
Summary
ABERRANT METHYLATION OF LINE 1 IN PATIENTS WITH TYPE 2 DIABETES PERIODONTITIS AND METABOLIC SYNDROME
1Rozhko P.D., 2Denga O.V., 2Verbitskaya T.G., 2Denga A.E.,
3Bubnov V.V.
1Odessa National Medical University 2State Establishment «The Institute of Stomatology and Maxillo-Facial Surgery National Academy of Medical Science of Ukraine»
3Odessa International Medical University
The methylation state of LINE1 is of interest as a promising diagnostic biomarker and therapeutic target for the diagnosis, prognosis and therapy of multifactorial diseases. Aberrant methylation of LINE1 to assess the progression of metabolic syndrome, type 2 diabetes mellitus in the presence of chronic generalized periodontitis showed a significant decrease in the level of methylated LINE1 DNA in the gums and blood of such patients, which correlates with a decrease in the content of methylated IL6 gene DNA However, there was no significant difference between methylation of LINE1 DNA in patients with chronic generalized periodontitis of varying severity.
Key words: DNA methylation, LINE1 gene, chronic generalized periodontitis, diabetes mellitus, metabolic syndrome.
Резюме
Аберрантное метилирование line1 у больных с парондотитом на фоне сахарного диабета 2 типа и метаболического синдрома
1Рожко П.Д., 2Деньга О.В., 2Вербицкая Т.Г., 2Деньга А.Э., 3Бубнов В.В.
1Одесский национальный медицинский университет 2Государственное учреждение «Институт стоматологии и челюстно- лицевой хирургии Национальной академии медицинских наук Украины» 3Одесский международный медицинский университет
Состояние метилирования LINE1 представляет интерес в качестве перспективного диагностического биомаркера и терапевтической мишени для диагностики, прогнозирования и терапии многофакторных заболеваний. Аберрантное метилирование LINE1 для оценки прогрессирования метаболического синдрома, сахарного диабета 2 типа на фоне хронического генерализованного пародонтита показало достоверное снижение при этом уровня метилированной ДНК LINE1 в тканях десны и крови таких пациентов, которое коррелирует со снижением содержания метилированной ДНК гена IL6. При этом не выявлено достоверной разницы между метилированием ДНК LINE1 у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом различной степени тяжести.
Ключевые слова: метилирование ДНК, ген LINE1, хронический генерализованный пародонтит, сахарный диабет, метаболический синдром.
Стан метилювання LINE1 представляє інтерес в якості перспективного діагностичного біомаркера і терапевтичної мішені для діагностики, прогнозування і терапії багатофакторних захворювань. Аберантне метилювання LINE1 для оцінки прогресування метаболічного синдрому, цукрового діабету 2 типу на фоні хронічного генералізованого пародонтиту показало достовірне зниження при цьому рівня метильованої ДНК LINE1 в тканинах ясен і крові таких пацієнтів, яке корелює зі зниженням вмісту метильованої ДНК гена IL6. При цьому не виявлено достовірної різниці між метилюванням ДНК LINE1 у пацієнтів з хронічним генералізованим пародонтитом різного ступеня тяжкості. Ключові слова: метилювання ДНК, ген LINE1, хронічний генералізований пародонтит, цукровий діабет, метаболічний синдром.
Введение
Состояния с высоким риском развития сахарного диабета (СД) и метаболического синдрома (МС) создаютпредпосылки к формированию воспалительно-деструктивных поражений пародонта, что необходимо учитывать при ортопедическом и ортодонтическомлечении таких пациентов [1].
У пациентов с МС и при СД 2 типа эпигенетические механизмы могут быть вовлечены в регуляцию генов, которые дифференцированно экспрессируются. Нарушение механизмов эпигенетической регуляции напрямую или косвенно связано с множеством заболеваний. Это относится и к длинным вкрапленным последовательностям ядерного элемента 1 (LINE1), который является маркером глобального метилирования ДНК генома [2]. Элементы LINE1 представляют собой семейство полученных из транспозонов последовательностей повторов, диспергированных в геноме [3]. Длинные чередующиеся ядерные элементы LINE1 или ретротранспозоны, составляют около 17 % ДНК человека. Они используют «механизм» копирования и «вставки» для распространения себя по всему геному через промежуточные РНК (ретротранспозиция) [4]. LINE1 начинаются с нетранслируемой области (UTR), которая включает в себя промотор РНК - полимеразы II, две непе- рекрывающиеся открытые рамки считывания (ORF1 и ORF2), и заканчивается с другим UTR. Встраиваясь в геном, L1 элементы могут изменять уровень транскрипции гена. Одним из основных механизмов регуляции экс-
прессии ретротранспозона LINE1 является метилирование ДНК. В соматических клетках метилирование ДНК ответственно за поддержание и реализацию таких фундаментальных биологических процессов, как инактивация Х-хромосомы, геномный импринтинг, регуляция тканеспецифичной экспрессии генов, репрессия ретрот- ранспозонов в геноме [5]. Однако изменение уровня метилирования ДНК происходит и при патологических процессах, которые проявляются с увеличением возраста, в том числе при атеросклерозе, артериальной гипертензии, МС, СД 2 типа [6-8]. Про- моторные регионы ретротранспозона содержат большое число CpG-сайтов, которые обычно характеризуются высоким уровнем метилирования. Повышенный уровень экспрессии мобильного элемента сопровождается частичным деметилированием промоторов LINE1 в 5'-UTRрегионе [9]. Таким образом, состояние метилирования LINE1 представляет интерес как перспективный диагностический биомаркер и терапевтическая мишень для диагностики, прогнозирования и терапии многофакторных заболеваний.
Таблица 1Нуклеотидная последовательность праймеров
|
Ген |
Праймеры (5'-3') |
|
|
LINE1-F |
Biotin-TTTTGGATTTGATTAGTTTGATATAAGAA |
|
|
LINE1-R |
CATTTTCAAC CACAAACAAATAC TATTAA |
|
|
LINE1-S |
AGTTAGGTGTGGGATATAGT |
Примечание:F-прямой, R-обратный, S-секвенирующий, Biotin-модификация биотином
Цель исследования: изучить возможность использования анализа аберрантного метилирования LINE1 для оценки прогрессии метаболического синдрома, диабета 2 типа на фоне хронического генерализованного пародонтита (ХГП) при дентальной имплантации.
Таблица 2Содержание метилированной ДНК в промоторе гена LINE1 у пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта, метаболическим синдромом, сахарным диабетом
|
Группы пациентов (n = 14) |
Содержание метилированной ДНК в промоторе гена LINE1, % |
||
|
Ткань десны |
Кровь |
||
|
ХГП, (n = 5) |
81,5 ± 1,8 |
81 ± 2,0 |
|
|
ХГП + MC, (n = 5) |
77,4 ± 1,7 р = 0,01 |
75,5 ± 2,1 р = 0,04 |
|
|
ХГП + СД 2 типа, (n = 4) |
68,3 ± 2,3 р = 0,005 |
69,1 ± 2,7 р = 0,01 |
Примечание: р -- показатель достоверности отличий от группы! «ХГП».
Материалы и методы
Кровь и ткань десны были взяты от 14 пациентов с ХГП, у 5 из них был метаболический синдром, 4 пациента имели диабет 2 типа. 5 пациентов без сопутствующих заболеваний имели ХГП разной степени.
ДНК выделяли с помощью набора «QIAampDNAMiniKit» (Qiagen) в соответствии с рекомендациями производителя. Чистоту выделенных препаратов ДНК и концентрацию определяли спектрофотометрически. Би- сульфитную обработку выделенной ДНК с концентрацией 1 мкг/мл проводили с помощью набора «EpiTectBisulfiteKit» (Qiagen). ДНК амплифи- цировали методом ПЦР cиспользованием HotStarTaqDNAPolymerase (QIAGEN), ПЦР- буфера, смеси dNTP (Fermentas) и специфичных праймеров по программе: начальная денатурация 950С-15 мин.; денатурация 950С - 30 сек., отжиг праймеров 520С - 30 сек, элонгация 720С - 30 сек, 39 циклов; финальная элонгация 720С - 10 мин. Последовательности праймеров представлены в таблице 1.
Пиросекве- нирование проводили с использованием наборов PyroMarkGoldQ24 в соответствии с протоколом изготовителя на приборе PyroMarkQ24 (Швеция). Содержание метилированной ДНК в пробе оценивали с помощью программы PyroMark СрGsoftware2.01. Для статистической обработки данных использовали программу Statisticsversia10.
Результаты исследования и их обсуждение
Было проведено изучение метилирования длинных повторяющихся последовательностей LINE1 у больных, направленных на дентальную имплантацию, с ХГП (5 человек), с ХГП, протекающим на фоне СД 2 типа (4 человека), и с ХГП, протекающим на фоне МС (5 человек). Анализ метилирования проводили в тканях десны и в крови пациентов.
В результате проведенного анализа было показано, что в тканях десны метилирование ДНК LINE1 у больных с ХГП и МС было достоверно ниже (77,4±1,7), чем у пациентов с ХГП (81,5±1,8) (табл. 2).
Аберрантное метилирование LINE1 в тканях пародонта у пациентов с ХГП на фоне СД 2 типа было достоверно ниже (68,3±2,3), чем у больных с МС (77,4±3,0). Изучение содержания метилированной ДНК LINE1 в крови у пациентов с ХГП и сопутствующим сахарным диабетом и метаболическим синдромом показало достоверное отличие в содержании метилированной ДНК LINE1 в крови у пациентов с сахарным диабетом по сравнению с пациентами с пародонтитом и пациентами с метаболическим синдромом.
В крови пациентов с метаболическим синдромом содержание метилированной ДНК LINE1 было ниже (75,5±2,1) чем у пациентов с ХГП (81 ±2,2), но выше чем у пациентов с сахарным диабетом 69,1±2,7. Те. закономерность изменения степени метилирования ДНК LINE1 в тканях пародонта и крови одинакова, что предполагает возможность в дальнейшем использование крови, как более удобного биологического образца, для клинических и эпидемиологических целей (табл. 2).
Достоверное снижение уровня метилированной ДНК LINE1 в крови больных с диабетом и метаболическим синдромом по сравнению с пациентами без этой патологии говорит о заинтересованности эпигенетического контроля функции ретротранспазо- нов в развитии сахарного диабета и метаболического синдрома.
На рисунке 1 представлены данные количественного секвенирования последовательности LINE1 в тканях пародонта у больных с парадонтитом, СД 2 типа и МС.
В работе [8] были проанализированы уровни метилирования ДНК LINE1 в связи с риском развития метаболического синдрома. Показано, что уровень метилирования ДНК LINE1 от 67 до 73,8 % ассоциирован с высоким риском развития тяжелого метаболического синдрома (OR4,4; p=0,004). При степени метилировании в диапазоне 75-77,3% риск был ниже (OR1,8; p=0,2).
По нашим данным у группы пациентов с ХГП и с диабетом 2 типа уровень метилированной ДНК LINE1 также соответствует высокому риску развития МС. Оценка уровня метилирования ДНК у пациентов с ХГП различной степени выраженности (без диабета и МС) не выявила достоверной разницы.
Снижение содержания метилированной ДНК LINE1 в тканях десны у пациентов с ХГП в нашем случае прямо пропорционально коррелирует со снижением содержания метилированной ДНК гена IL6, r= 0,61 (рис. 2). Ген IL6 играет важную роль в развитии сахарного диабета и резистентности к инсулину [10]. Обычно, снижение содержания метилированной ДНК гена IL6 приводит к повышению экспрессии цитокина и развитию про- воспалительных реакций [11].
Рис. 1 Пирограмма секвенирования CpGсайтов метилирования LINE1 в тканях десны у больных сахарным диабетом (а) и метаболическим синдромом (б) на фоне хронического генерализованного пародонтита
Бисульфитное секвенирование повторяющихся элементов, выполняемое для LINE1, является быстрым и простым методом оценки глобального метилирования ДНК, который можно использовать для разработки таргетной терапии и оценки её эффективности при ортопедическом и ортодонтическом лечении.
Выводы
Выявлено у пациентов с ХГП достоверное дополнительное снижение уровня метилированной ДНК LINE1 в тканях десны и крови с СД 2 типа и МС по сравнению с пациентами без метаболических нарушений.
Содержание метилированной ДНК LINE1 в тканях десны у пациентов с ХГП коррелирует с содержанием метилированной ДНК гена IL6.
Не выявлено достоверной разницы между метилированием ДНК LINE1 у больных с ХГП различной степени тяжести (без СД 2 типа и МС).
Литература
аберантне метилювання генералізований пародонтит
1. Романенко И.Г. Генерализованный пародонтит и метаболический синдром. Единство патогенетических механизмов развития / И.Г. Романенко, Д.Ю. Крючков // Кримський терапевтичний журнал. - 2011. - №1. - С. 6067.
2. Nelson H.H. Global methylation in exposure biology and translational medical science / H.H. Nelson, C.J. Marsit, K.T. Kelsey // Environ Health Perspect. - 2011. - №119. - Р. 1528-1 533.
3. Lander E.S. Initial sequencing and analysis of the human genome / Lander E.S., Linton L.M., Birren B // Nature. - 2001. - №409. - Р. 860-921.
4. Дейчман А.М. Повторы, нестабильность генома и онкогенез. Возможный биосинтез олигонуклеотидов вне генома / Дейчман А.М. Монография - М.: Мир науки, 2015. - 169 с. ISBN 978-5-9906296-7-7
5. Лебедев И. Н. Эпимутации импринти- рованных генов в геноме человека: классификация, причины возникновения, связь с наследственной патологией / И. Н. Лебедев, Е. А. Саженова // Генетика. - 2008. - Т. 44. - С. 13561373.
6. Cash, H. L. Cardiovascular disease risk factors and DNA methylation at the LINE1 repeat region in peripheral blood from Samoan Islanders / H. L. Cash, S. T. McGarvey, E. A. Houseman // Epigenetics. - 2011. - №6(10). - Р. 1257-1264.
7. The shortening of leukocyte telomere length relates to DNA hypermethylation of LINE1 in type 2 diabetes mellitus / Y. Wu, W. Cui, D. Zhang[et al.] // Oncotarget. - 2017. - №8. - Р. 7396473.
8. Turcot V. LINE1 methylation in visceral adipose tissue of severely obese individuals is associated with metabolic syndrome status and related phenotypes / V. Turcot, A Tchernof, Y Deshaies // Clinical epigenetics. - 2012. - №4(1). - Р. 10.
9. Васильев С.А. Эпигенетическая регуляция ретротранспозона LINE1 и его роль в эмбриогенезе / С.А. Васильев, Е.Н. Толмачёва, И.Н. Лебедев // Генетика. - 2016. - Т.52. - № 12. - С. 1349-1357.
10. Литвинова Л.С. Патогенез инсулино- резистентности при метаболическом ожирении / Л.С. Литвинова, Е.В. Ки- риенкова, И.О. Мазунин // Биомедицинская химия. - 2015. - Т. 61. - №1. - С. 70-82.
11. Methylation status of a single CpG site in the IL6 promoter is related to IL6 messenger RNA levels and rheumatoid arthritis / C.J. Nile, R.C. Read, M. Akil, [et al.]// Arthritis Rheum. - 2008. - 58(9). - Р. 2686-93.
Refernces
1. Romanenko I.G., Kryuchkov D.Yu.. Generalized periodontitis and metabolic syndrome. The unity of pathogenetic mechanisms of development. Kryms'kyj terapevtychnyj zhurnal. 2011;1:60-67.
2. Nelson HH, Marsit CJ, Kelsey KT.
Global methylation in exposure biology and translationalmedical
science. Environ Health Perspect. 2011;119:1528-1533.
3. Lander ES, Linton LM, Birren B. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001;409:860-921.
4. Deichman A.M. Repetitions, genome
instability and oncogenesis. Possible biosynthesis of oligonucleotides outside the genome. Monograph - Moscow: World of Science, 2015: 169. ISBN 978-5-9906296-7-7
5. Lebedev I.N. Sazhenova E. A Epimutations of imprinted genes in the human genome: classification, causes, connection with hereditary pathology. Genetics. 2008;44:1356-1373.
6. Cash H.L., McGarvey S.T., Houseman E.A Cardiovascular disease risk factors and DNA methylation at the LINE1 repeat region in peripheral blood from Samoan Islanders. Epigenetics. 2011 ;6(10): 1257-1264.
7. Wu Y, Cui W, Zhang D, Wu W, Yang Z. The shortening of leukocyte telomere length relates to DNA hypermethylation of LINE1 in type 2 diabetes mellitus. Oncotarget. 2017;8:73964-73. doi: 10.18632/oncotarget. 18167
8. Turcot V., Tchernof A, Deshaies Y LINE1 methylation in visceral adipose tissue of severely obese individuals is associated with metabolic syndrome status and related phenotypes. Clinical epigenetics. 2012;4( 1): 10.
9. Vasiliev S. A., Tolmacheva E. N.,
Lebedev I. N. Epigenetic regulation of LINE1 retrotransposon and its role in embryogenesis.Genetics.
2016;52(12):1349-1357.
10. Litvinova L.S., Kirienkova E.V., Mazunin I.O., Vasilenko M.A., Fattakhov N.S. Pathogenesis of Insulin Resistance in Metabolic Obesity. Biomedical Chemistry. 2015;61(1):70-82.
11. Nile CJ, Read RC, Akil M, Duff GW, Wilson AG. Methylation status of a single CpG site in the IL6 promoter is related to IL6 messenger RNA levels and rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2008;58(9):2686-93.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Патофізіологічні особливості та причини розвитку ішемічної хвороби серця при наявному цукрового діабету 2 типу. Доцільність застосування кардіоліну як допоміжного фітотерапевтичного препарату у хворих. Поліпшення мозкового та коронарного кровотоку.
статья [22,4 K], добавлен 06.09.2017Етіологія та патогенез цукрового діабету; клінічна характеристика хворих. Дослідження ефективності застосування програми реабілітації хворих. Вплив лікувальної гімнастики, масажу та методів фізіотерапії на функціональний стан нижніх кінцівок людини.
дипломная работа [103,9 K], добавлен 22.01.2014Питання лікування пацієнтів з поєднаним перебігом артеріальної гіпертензії та цукрового діабету. Оцінка впливу підвищення артеріального тиску на розвиток гіпертрофічних типів ремоделювання серця. Особливості аритмій при цукровому діабеті 2 типу.
статья [25,9 K], добавлен 24.11.2017Клінічні параметри показників функції зовнішнього дихання та варіабельності серцевого ритму у пацієнтів із хронічним обструктивним захворюванням легень на фоні базисної терапії залежно від статі, віку пацієнтів, тривалості захворювання, стажу паління.
автореферат [46,9 K], добавлен 18.03.2009Вплив ступеня компенсації діабету та способу корекції вуглеводного обміну на виразність і частоту ДД міокарда у хворих із цукровим діабетом 2 типу в поєднанні з ішемічною хворобою серця. Вплив метаболічних препаратів на діастолічну функцію серця.
автореферат [32,9 K], добавлен 12.03.2009Мікроциркуляторні порушення у яснах хворих на хронічний генералізований пародонтит на тлі цукрового діабету. Патогенетичне лікування хронічного генералізованого пародонтиту у даної категорії хворих, використання лікувальної композиції "Діоцинкохім".
автореферат [44,4 K], добавлен 21.03.2009Гормонально-метаболічний гомеостаз, клінічні прояви симптоматичних психічних розладів та методи оптимізації терапії хворих на цукровий діабет. Частота антропометричних показників, стан ліпідного метаболізму, порушення вуглеводного обміну при шизофренії.
автореферат [36,7 K], добавлен 09.04.2009Медико-соціальне значення, традиційні принципи терапії цукрового діабету, рання діагностика, первинна та вторинна профілактика серцево-судинних ускладнень. Комплексна оцінка клініко-біохімічних та інструментальних методів досліджень хворих на діабет.
автореферат [65,6 K], добавлен 05.02.2009Вивчення фармакодинамічних ефектів препаратів сорбілакт і реосорбилакт у пацієнтів із легеневою недостатністю та хронічним легеневим серцем та дослідження ефективності й безпеки їхнього застосування у комплексному лікуванні хворих. Інфузійна терапія.
автореферат [192,5 K], добавлен 06.04.2009Скринінговий діагностичний критерій метаболічного синдрому. Пероральний тест на толерантність до глюкози з одночасним дослідженням вмісту імунореактивного інсуліну. Лікування хворих на артеріальну гіпертензію, ускладену хронічною серцевою недостатністю.
автореферат [50,8 K], добавлен 26.01.2009Зміни функціонального стану ЦНС пацієнтів, які перенесли критичні стани, використовуючи омегаметрію. Розробка способів прогнозування несприятливого перебігу критичних станів і післяреанімативного періоду, використання методики нейропротекторної терапії.
автореферат [37,9 K], добавлен 10.04.2009Гемодилюційний ефект сорбіланту та реосорбіланту у хворих з хронічним легеневим серцем. Безпечність застосування сорбіланту у хворих із некомпенсованим хронічним легеневим серцем на основі показників ехокардії. Застосування реосорбіланту в лікуванні.
автореферат [129,9 K], добавлен 03.04.2009Цукровий діабет як медико-соціальна проблема, розповсюдження патологїї. Лікування цукрового діабету, декомпенсованого до кетоацидотичного кризу. Кисневий бюджет, мозковий метаболізм, гемодинаміка, стан когнітивних функцій - варіанти інтенсивної терапії.
автореферат [37,4 K], добавлен 14.03.2009Дослідження методів досягнення ефективної компенсації цукрового діабету. Сутність захворювання на цукровий діабет. Фактори, які негативно впливають на досягнення компенсації цукрового діабету, на ремісію та унеможливлюють нормалізацію стану пацієнта.
статья [27,9 K], добавлен 07.02.2018Основні порушення мікроциркуляції, утилізації і транспорту кисню, регіональні вазомоторні порушення у хворих з діабетичною стопою. Порушення процесів апоптозу при гнійно–запальних процесах при синдромі діабетичної стопи на фоні цукрового діабету.
автореферат [86,2 K], добавлен 05.04.2009Значення методів попереднього дослідження хворого для діагностики терапевтичних внутрішніх захворювань. Порядок обстеження хворих та основні скарги пацієнтів. Перкусія, пальпація та аускультація у визначенні діагнозу захворювання органів кровообігу.
научная работа [2,0 M], добавлен 26.07.2009Незалежні предиктори довгострокового прогнозу у пацієнтів другої та третьої стадії артеріальної гіпертензії на основі багатофакторного аналізу. Вплив антигіпертензивних препаратів на частоту виникнення серцево-судинних ускладнень та цукрового діабету.
автореферат [109,9 K], добавлен 21.03.2009Поняття та головні причини метаболічного синдрому як зниження чутливості периферичних тканин до інсуліну й гиперінсулінемія, які порушують вуглеводний, ліпідний, пуриновий обмін, а також артеріальна гіпертензія. Групи ризику, діагностування та лікування.
реферат [53,8 K], добавлен 02.03.2014Вплив величини систолічного артеріального тиску на смертність від ішемічної хвороби. Принципи та обґрунтування вибору антигіпертензивних препаратів, показання та протипоказання до застосування деяких із них. Прогнозування виникнення діабету у пацієнтів.
презентация [2,0 M], добавлен 27.01.2015Характеристика методів підбору продуктивної програми відновлювальної терапії. Визначення синдромів захворювань нирок, складність діагностики та клінічні прояви гломерулонефриту, пієлонефриту, сечокам’яної хвороби. Застосування та приклади фізичних вправ.
реферат [27,0 K], добавлен 09.11.2009
