Особливості експресії MIR-146a та MIR-155 у пацієнтів з алергічними хворобами на тлі хронічної Епштейна-Барр вірусної інфекції

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Особливості експресії MIR-146a та MIR-155 у пацієнтів з алергічними хворобами на тлі хронічної Епштейна-Барр вірусної інфекції

Зубченко С.О.

Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького

вірусний імунокомпетентний епштейн

Вірус Епштейна-Барра (веб) відноситься до імунотропних вірусів з довічною персистенцією в організмі господаря. Заражаючи імунокомпетентні клітини, Веб може впливати на молекулярні регуляторні механізми в плані протизапальної реакції з формуванням алергічного запального процесу. Особливості експресії mir-146a таміг-155 були вивчені у 46 пацієнтів з алергічними захворюваннями (АТ) у поєднанні з активною (27 осіб, 1-а група) і латентною (19 осіб, 2-а група) фазами хронічної ВЕБ-інфекції. Виявлено, що рівні експресії протизапального miR-146a були достовірно вищими у пацієнтів 1-ї та 2-ї груп, у 2,9 рази (р = 8, 0E-04) та у 2,25 рази (р = 0,011) порівняно з EBV-серонегативними пацієнтами з алергічними захворюваннями. Рівень експресії miR-155 був достовірно вище у пацієнтів з активною фазою ВЕБ - інфекції в порівнянні з пацієнтами з латентною фазою веб (р = 1,0 E-07) і в 1,5 рази в порівнянні з веб-серонегативними (р = 2,5 E-03). Зниження експресії miR-155 в 55,8 рази спостерігалося у пацієнтів з латентною веб-інфекцією в порівнянні з веб-серонегативними особами. Таким чином, хронічна веб-інфекція у пацієнтів з алергічними захворюваннями по-різному впливає на рівні експресії miR-155 і miR-146a в залежності від фази персистенції вірусу, що може потенціювати алергічний запальний процес.

Ключові слова: вірус Епштейна-Барра, miR-155, miR-146, алергічні захворювання.

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ MIR-146AИ MIR-155 У ПАЦИЕНТОВ С АЛЛЕРГИЧЕСКИМИ БОЛЕЗНЯМИ НА ФОНЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ЭПШТЕЙНА-БАРР ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ Зубченко С.А.

Львовский национальный медицинский университет имени Данила Галицкого

Вирус Эпштейна-Барра (ВЭБ) относится к иммунотропным вирусам с пожизненной персистенцией в организме хозяина. Заражая иммунокомпетентные клетки, ВЭБ может влиять на молекулярные регуляторные механизмы в плане противовоспалительной реакции с формированием аллергического воспалительного процесса. Особенности экспрессии mir-146a таmir-155 были изучены у 46 пациентов с аллергическими заболеваниями (АД) в сочетании с активной (27 человек, 1-я группа) и латентной (19 человек, 2-я группа) фазами хронической ВЭБ-инфекции. Выявлено, что уровни экспрессии противовоспалительного miR-146a были достоверно выше у пациентов 1-й и 2-й групп, в 2,9 раза (р = 8, 0E-04) и в 2,25 раза (р = 0,011) по сравнению с EBV-серонегативными пациентами с аллергическими заболеваниями.

Уровень экспрессии miR-155 был достоверно выше у пациентов с активной фазой ВЭБ-инфекции по сравнению с пациентами с латентной фазой ВЭБ (р = 1,0 E - 07) и в 1,5 раза по сравнению с ВЭБ-серонегативными (р = 2,5 E-03).

Снижение экспрессии miR-155 в 55,8 раза наблюдалось у пациентов с латентной ВЭБ-инфекцией по сравнению с ВЭБ-серонегативными лицами.

Таким образом, хроническая ВЭБ-инфекция у пациентов с аллергическими заболеваниями по-разному влияет на уровни экспрессии miR-155 и miR-146a в зависимости от фазы персистенции вируса, что может потенцировать аллергический воспалительный процесс.

Ключевые слова: вирус Эпштейна-Барра, miR-155, miR-146, аллергические заболевания.

PECULIARITIES OF MIR-146A AND MIR-155 EXPRESSION IN PATIENTS WITH ALLERGIC DISEASES COMBINED WITH CHRONIC EPSTEIN-BARR VIRAL INFECTION

Zubchenko S.O. Danylo Halytsky Lviv National Medical University

Epstein-Barr virus (EBV) is referred to immunotropic viruses with lifelong persistence in a host's body. Infecting immunocompetent cells, EBV can affect molecular regulatory mechanisms in terms of anti-inflammatory response with the formation of allergic inflammatory process. Peculiarities of mir-146a таmir-155 expression have been studied in 46 patients with allergic diseases (AD) in combination with active (27 individuals, 1st group) and latent (19 individuals, 2nd group) phases of chronic EBV infection. It has been revealed that expression levels of anti-inflammatory miR-146a were reliably higher in patients of the 1st and the 2nd groups, by 2.9 times (p = 8, 0E-04) and by 2.25 times (p = 0.011) compared with EBV-seronegative patients with allergic diseases. The level of miR-155 expression was reliably higher in patients with active phase of EBV-in- fection compared with patients with latent phase of EBV (p = 1,0E-07) and by 1.5 times compared with EBV-seronegative ones (p = 2.5 E-03). Reduction of miR-155 expression by 55.8 times was observed in patients with latent EBV infection compared with EBV-seronegative individuals. Thus, chronic EBV infection in patients with allergic diseases differently affects the levels of miR-155 and miR-146a expression depending on the phase of virus persistence, which can potentiate allergic inflammatory process.

Keywords: Epstein-Barr virus, miR-155, miR-146, allergic diseases.

Вступ

Відомо, що віруси і людина спільно еволюціонували впродовж усього періоду існування людства. За цей великий часовий проміжок імунна система людини сформувала цілу низку противірусних механізмів зі сторони як клітинної, так і гуморальної ланок [2]. Незважаючи на це, існує низка вірусів, які у різний спосіб «навчились уникати імунних пасток», а їх тригерна роль у запуску алергічних хвороб (АХ) є предметом наукових дискусій [5, 8]. До таких вірусів відноситься представник родини Herpesviridae-- вірус Епштейна-Барра (ЕБВ). Інфікованість ЕБВ серед дорослого населення складає за різними даними від 85,7 % до 98,2 % [1]. Вірус у більшості інфікованих організмів знаходиться в латентній фазі, коли кількість вірусних копій незначна і клітини не руйнуються [9]. Будь-які причини, що призводять до зниження загального та місцевого імунітету, можуть потенціювати реплікативну активність ЕБВ в організмі. Основними механізмами контролю над реплікацією вірусу є фактори клітинного й гуморального імунітету [6, 8]. Однак, при неякісній чи зниженій відповіді з боку, в першу чергу, клітинної ланки імунітету, хронічна EБВ-інфекція стає тригером патологічних порушень, в т.ч. алергопатології [1, 8]. Сьогодні активно вивчаються молекулярні механізми патогенезу різних захворювань і регуляторна роль miRNAsу цих процесах [7]. Зокрема, miR-146а беруть участь у природженому імунітеті, регулюючи сигналізацію Toll-рецепторів і впливаючи на цитокінову відповідь, а зміна їх експресії виявлена при хронічних запальних захворюваннях [10]. Натомість, miR-155 з про- запальними властивостями бере участь у регуляції центральних елементів адаптивної імунної відповіді [3]. Відтак, можна припустити, що персистуючи в імунокомпетентних клітинах організму господаря EБВ може впливати на молекулярні регуляторні механізми в напрямку анти- запальної відповіді з формуванням алергічного запального процесу.

Метою нашої роботи було вивчити особливості експресії mir-146а та mir- 155 у пацієнтів з АХ на тлі хронічної EБВ- інфекції.

Матеріали і методи дослідження

Дослідження проводилось відповідно до 7-го перегляду принципів Гельсінської декларації прав людини (2013), Конвенції Ради Європи про права людини і біомедицину та відповідних законів України. Робота виконувалась на кафедрі клінічної імунології та алергології ЛНМУ ім. Данила Галицького впродовж 2016-2019 років. За результатами анамнестичних, клінічних, лабораторних, специфічних алергологічних та інструментальних досліджень обстежено 365 хворих з них 205 (56,2 %) жінок і 160 (43,8 %) чоловіків, вік яких складав 32,4 ± 7,5 років (від 18 до 52 років). Клінічний діагноз алергічний риніт (АР), бронхіальна астма (БА) визначені за критеріями Allergic Rhinitisandits Impact on Asthma RIA 2016), Globalinitiative for asthma (GINA, 2016-2017), уніфікованим клінічним протоколом «Атопічний дерматит» (2016). Після діагностики ЕБВ- інфекції за результатами молекулярно-генетичних аналізів виокремили 46 хворих і розділили на групи: 1 -а група -- 27 осіб з АХ на тлі активної фази хронічної EБВ-інфекції (ДНК ЕБВ «+»), 2-а група -- 19 осіб з АХ і латентною фазою EБВ-інфекції (ДНК ЕБВ «-»). Контрольну групу склали 20 ЕБВ-серонегативних осіб з АХ.

Визначення ДНК ЕБВ у крові, слині та слизовій задньої стінки глотки виконували методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) на діагностикумах«Ampli Sens» (РФ) з використанням «Rotor-Genе 6000» (Corbett Recearch, Австралія).

Для визначення загального IgEі специфічних антитіл класу Gдо антигенів EБВ (EBNA-IgG, VCA-IgG, VCA- М)) застосовували метод імуноферментного аналізу з використанням тест-систем «Euroimmun» (Німеччина), згідно з інструкцією фірми виробника. Шкірні прик-тести виконували екстрактами алергенів (Inmunotek, Іспанія), постановка і оцінка результатів проводилась відповідно до європейських вимог [4]. Оцінка функції зовнішнього дихання проводилась на підставі результатів спірометрії (Vitalograf ALPHA № AL011734, Німеччина).

Визначення експресії miR-146aта miR-155 у зразках сироватки визначали методом зворотної транскрипції і ПЛР у реальному часі. Зворотну транскрипцію проводили з використанням набору High Capacityc DNA Reve Transcription Kit (Applied Byosystems, США), специфічних праймерів для кожної miRNAsі 10 нг тотальної РНК. Кількісну ПЛР у реальному часі проводили з використанням Taq Man Micro RNA Assays (Applied Biosystems, США): U6 snRNA(як ендогенний контроль). Отримані дані були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення 7500 FastReal_timePCR. Дослідження проводились у відділі загальної та молекулярної патофізіології інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України на підставі угоди про співпрацю.

Результати досліджень аналізували з використанням методу варіаційної статистики за допомогою програми STATISTICA6 (Statsoft, USA) із застосуванням t-критерію Стьюдента.

Результати досліджень

Загалом за критеріями відповідних позиційних документів пацієнтам були виставлені наступні діагнози:

АР -- персистуючий (цілорічний) -- 106 (29,0 %) та інтермітуючий (сезонний) -- 94 (25,8 %) осіб;

БА інтермітуюча або легка персистуюча, контрольована -- 48 (13,2 %) осіб;

АД дорослого типу, локалізована еритематозно-сквамозна форма, легкого ступеня тяжкості (SCORAD від 14,0 % до 22,0 %), неповна або повна ремісія -- 27 (7,4 %) осіб;

спонтанна/індукована кропив'янка, гостра стадія -- 46 (12,6 %) осіб;

коморбіднаалергопатологія -- 44 (12,0 %) осіб.

Усім 365 пацієнтам також визначили рівень загального сироваткового IgE. Виявили, що у 241 (66,0 %) осіб його показники були вище вікової норми (IgE> 100 kU/l), середні показник 387,3 ± 155,4 kU/Lі коливався у межах (від 110 до 1254,4 kU/L).

За результатами досліджень у 327 (89,6 %) пацієнтів виявлені антитіла IgG до ядерного антигену (EBNA-IgG), це свідчило про велику поширеність ЕБВ серед дорослих пацієнтів з АХ. Натомість 38 (10,4 %) пацієнтів виявились неінфікованими. Серед пацієнтів з виявленими серологічними маркерами ЕБВ (327 осіб) -- у 160 (48,9 %) пацієнтів виявлена ДНК ЕБВ ( «+»), з них: 21 (13,1 %) -- у слизовій задньої стінки глотки, 18 (11,3 %) -- у слині, 113 (70,6 %) осіб одночасно у двох середовищах слина+слизова, 8 (5,0 %) -- у крові+інші біологічні середовища (кількість копій ДНК EBVскладала від < 500 до 107), що вказувало на наявність хронічної ЕБВ- інфекції в активній фазі. У 167 (51,1 %) пацієнтів виявлена латентна фаза хронічної ЕБВ-інфекції, для якої характерна відсутність ДНК ЕБВ ( «-») у біологічних середовищах.

На підставі аналізу клінічних даних і лабораторних досліджень встановлено, що на тлі хронічної ЕБВ-інфекції в активній фазі частіше спостерігалася БА інтермітуюча / легка персистуюча або АР з бронхоообструктивним синдром в анамнезі, еозинофілія в крові та назоцитограмі, зміни функції зовнішнього дихання. У хворих з латентною фазою хронічної ЕБВ-інфекції частіше спостерігалися симптоми АД в стадії загострення і персистуючого АР. Натомість, у ЕБВ- серонегативних пацієнтів були різні симптоми алергопатології, однак, звертає на себе увагу більша поширеність кропив'янки порівняно з попередніми групами.

Окрім цього, детальний аналіз анамнестичних даних показав, що у хворих з АХ на тлі хронічної ЕБВ-інфекції в активній фазі були ознаки імунних порушень, зокрема ГРВІ (6 і більше разів/рік) у 96 (60,0 %) осіб, тривалий субфеб- рилітет- у 61 (38,1 %), періодична лихоманка -- 50 (31,2 %), у біль у суглобах і м'язах -- у 94 (58,7 %), скарги на загальну слабкість -- у 136 (85,0 %), швидку втомлюваність -- у 152 (95,0 %), болі в голові та запаморочення -- у 125 (78,1 %), порушення когнітивних функцій -- в 11 (6,9 %), біль і першіння в горлі -- у 46 (28,8 %) та інші, що було частіше порівняно з пацієнтами з АХ і латентною фазою хронічної ЕБВ-інфекції.

Для проведення порівняльного аналізу рівнів експресії miR-146aта miR-155 виокремили описані вище дві групи дослідження і контрольну групу. Результати порівняльного аналізу наведені в табл.1.

Таблиця 1. Рівні експресії miR-146aта miR-155 у пацієнтів досліджуваних груп

Як видно з таблиці 1, у пацієнтів обох груп з АХ на тлі хронічної ЕВУ- інфекції як в активній, так і в латентній фазах спостерігалися достовірно вищі рівні експресії антизапальноїmiR-146a, відповідно 2,9 рази (р = 8,0E-04) та в 2,25 рази (р = 0,011) порівняно з контрольною групою. Хоча рівень miR-146aу пацієнтів 1 -ї групи був у 1,3 рази вищим, ніж у 2-й групі хворих, однак достовірної різниці не виявлено (р > 0,91).

Щодо рівня експресії miR-155, то у пацієнтів з АХ і активною фазою EBV- інфекції експресія даної miRNAвиявилась достовірно вищою в 1,5 рази порівняно з контрольною групою (р = 2,5E-03). Цікавим виявився факт значного зниження у 55,8 разів вказаної miRNA(р = 1,0E-07) у пацієнтів 2-ї групи при латентному перебігу ЕБВ-інфекції порівняно з ЕБВ-серонегативними особами. Відповідно до отриманих результатів були встановлені достовірно більші рівні miR-155 у пацієнтів з ЕБВ-інфек- цією в активній фазі порівняно з пацієнтами з латентною фазою персистенції вірусу (р = 1,0E-07).

За даними нашого дослідження, підвищення рівнів miRNAs у пацієнтів 1-ї групи характеризувались наявністю БА чи/або АР з бронхообструктивним синдромом в анамнезі, еозинофілією в крові та назоцитограмі; пацієнти 2-ї групи з низькими рівнями miR-155 на тлі підвищеної експресії miR146а асоціювались з частішими проявами АД, АР з1полісенсибілізацією. Більше половини пацієнтів обох груп мали гіпер-IgE- синдром. На нашу думку, дисбаланс між miR-155 і miR-Мба, яку ЕБВ «створював» для забезпечення фази латенції, сприяв хронізації алергічного запального процесу.

Підсумовуючи результати нашої роботи можна зробити висновки, що хронічна ЕБВ-інфекція у пацієнтів з АХ має різний вплив на рівень miR-155 і miR-146aзалежно від фази вірусної персистенції. У латентній фазі ЕБВ використовує власні механізми латенції для уникнення імунної відповіді, що характеризуються підвищеним синтезом антизапальноїmiR-146aна тлі різкого гальмування синтезу прозапальноїmiR-155 порівняно з контрольною групою. Фактично протилежний вектор змін цих miRNAs з антагоністичними властивостями виявлено у пацієнтів з активною фазою. В активній фазі EBV-інфекції даний напрямок змін лише посилювався, особливо на прикладі miR-155 і асоціювався з гострими проявами респіраторної алергопатології. Збільшення експресії miR-155 в активній фазі ініціювало недостатньо ефективну противірусну відповідь зі сторони як гуморального, так і клітинного імунітету, посилювало клітинно-опосередковане запалення, працюючи в унісон з miR-146a.

Література

1. Виговська О.В. Герпесвірусні інфекції у дітей: класифікація, клінічні форми, прояви, соціально-медичні аспекти. Дитячий лікар. 2016; 4 (49): 41-51

2. Геппе Н.А. Бронхиальная астма и инфекции у детей: есть ли связь? Аллергология и иммунология. 2013; 1: 9-10.

3. Bijaya Malla, Kathrin Zaugg, Erik Vassella, Daniel M. Aebersold, Alan Dal PraExosomes and Exosomal MicroRNAs in Prostate Cancer Radiation Therapy. International Journal of Radiation Oncology. Biology. Physics. 2017 Aug; 98.

4. Bousquet J., Heinzerling L., Bachert C. Practical Guide To Skin Prick Tests In Allergy To Aeroallergens. Allergy. 2012; 67 (1): 1824.

5. Mareri A, Stuart P Herpesvirus-associated acuteurticaria: anagematched Case-Control Study. J. Allergy Clinical Immunol. 2013; 8: 203-09.

6. Motsch N, Pfuhl T, Mrazek J, Barth S, Grasser FA Epstein-Barrvirus-encoded latent membraneprotein 1 (LMP1) induces the expression of the cellular microRNAmiR-146a. RNA Biol. 2007 Nov; 4 (3): 131-7.

7. Shivangi Mishra, Tanuja Yadav, Vibha Rani. Exploring miRNA based approaches in cancer diagnostics and therapeutics. Critical Reviews in Oncology/Hematology.2016 Feb; 98: 12-23.

8. Reiko Okudaira, Tokuko Mukoyama et al. Epstein-Barrvirus infection in childhood may precipitate a topic diseases. Allergology International.

9. Riley K. J., Rabinowitz G. S., Yario T A, Darnell J. M., Steitz R. B. etal. EBV and human microRNAs co-target on cogenic and a poptotic viral and human genesduring latency. The EMBO journal, 2012; 31 (9): 2207-21.

10. WeigeTan, BoduLiu, Shaohua Qu, Gehao Liang, Wei Luo, Chang Gong. MicroRNAs and cancer: Key paradigms in molecular therapy. Oncol Lett. 2018 Mar; 15 (3): 2735-2742.

Размещено на Allbest.ru