Природные и синтетические лиганды к С-квадруплексам

Размещено на http://www.allbest.ru/

С.А. Лизунова, Т.С. Ведехина, А.М. Варижук

Природные и синтетические лиганды к С-квадруплексам

gквадруплек терапия противоопухолевый

S.A. Lizunova, T.S. Vedekhina, A.M. Varizhuk

Native and synthetic ligands for G-quadruplexes

В настоящий момент активно развивается направление фармакологии, связанное с разработкой лекарственных средств, нацеленных на новый тип мишеней -- неканонические структуры ДНК и РНК (ncNA). К таким структурам относят G-квадруплексы (G4) -- фрагменты нуклеиновых кислот, обогащенные гуанином (G4), способные формировать четырехцепочечные спирали. Последовательности, образующие G-квадруплексы, в изобилии присутствуют в функционально значимых областях человеческого генома и транскриптома: теломерные области хромосом, промоторные участки генов, в том числе онкогенов, сайты инициации репликации и трансляции. При этом более 55 % генов несут, по крайней мере, один потенциальный G4-мотив вблизи сайта начала транскрипции [Genome-wide computational..., 2008]. Также G4-формирующие последовательности обнаружены в регуляторных участках геномов вирусов и других патогенов, что дает возможность рассматривать ncNA-сайты в качестве биологических мишеней для терапии вирусных, бактериальных и грибковых заболеваний.

G4-лиганды -- низкомолекулярные соединения, связывающиеся с G4 и влияющие таким образом на их термическую стабильность. Это может приводить к нарушению действий различных белковых факторов и ферментов, функционально связанных с ДНК или РНК. Несмотря на то что все G4 схожи по своей структуре (состоят из квартетов, образованных четырьмя остатками гуанина), они разнообразны по нуклеотидному составу петель, бороздок, фланкирующих последовательностей, а также по ориентации цепей. Поэтому могут реализовываться различные способы взаимодействия низкомолекулярных соединений с G4-мишенями: стекинг с тетрадами, связывание в бороздке или петле и др. С одной стороны, широкое структурное разнообразие может обеспечить высокую селективность распознавания ncNA лигандами. С другой стороны, в настоящий момент методы драг-дизайна недостаточно эффективны, что затрудняет создание избирательных G4-направленных терапевтических агентов. Поэтому поиск эффективных G4-аффинных соединений требует большого числа экспериментальных исследований in vitro и in vivo в сочетании с методами моделирования in silico.

Несмотря на то что механизмы многих ncNA-опосредованных путей регуляции остаются неизвестными, усилиями различных научных групп найдены высокоаффинные G4-лиганды (пиридостатин, BRACO19 и др.). Некоторые из них обладают антибактериальными, противоопухолевыми и противовирусными свойствами [Design of modular G-quadruplex..., 2018; O'Hagan et al., 2019; Ruggiero et al., 2018].

Целью работы стало обсуждение структуры и функций квадруплексов и роли G4-лигандов в качестве терапевтических агентов.

Методы и методология исследования

Для изучения вопроса исследования авторы использовали общенаучные методологические исследования, классификацию G4-лигандов и сравнительный анализ по механизму их взаимодействия с G-квадруплексами.

Результаты исследования

О-квадруплексы (04) -- класс неканонических вторичных структур нуклеиновых кислот, образованных О-богатыми участками ДНК или РНК за счет п - п-стекинг -- взаимодействия двух и более О-тетрад. Каждая тетрада состоит из четырех гуаниновых остатков, связанных сахарно-фосфатным остовом и хугстиновскими водородными связями (рис. 1). 04-структуры разделяют на внутримолекулярные, сформированные одной цепью ДНК или РНК, и межмолекулярные, сформированные двумя и более цепями.

Рис. 1. Структура О-квадруплекса: слева: О-квартет с координированным одновалентным катионом М+; справа: О-квадруплекс из трех квартетов

О4-структуры обладают большим конформационным разнообразием за счет различий в длине О-трактов, нуклеотидном составе и длине петель, количестве формирующих молекул, фланкирующих фрагментах, среде и др. ^оНппауа et а1., 2016]. Топологию О4-структуры определяет ориентация цепей и соответствующее ей конформационное состояние (син- или анти-) гликозидной связи между сахарным остатком и гуаниновым основанием. Выделяют три основные топологии: параллельная (антиориентация гуа- нозина), антипараллельная (син- и антиориентации гуанозина) и смешанная. Антипараллельные квадруплексы разделяют в зависимости от направления петли на два вида: «кресло» и «корзина» (рис. 2). РНК О4 преимущественно принимают параллельную конформацию из-за 2'-гидроксильной группы сахарного остатка, которая допускает исключительно антиориентацию.

антипараллельный антипараллельный смешанный параллельный

(«кресло») («корзина») («3 + 1»)

Рис. 2. Схематическое изображение основных топологий внутримолекулярных G4

В настоящий момент активно изучаются имперфектные G4 (ImG4), формирующиеся из прерывающихся или неполных G-трактов. Такие ImG4 могут иметь в своей структуре различные дефекты: мисматчи, выпуклости, вакантные места (рис. 3). Было показано, что, подобно обычным G4, ImG4 можно рассматривать в качестве потенциальных регуляторных элементов, биомаркеров и терапевтических мишеней [Synthesis of oligonucleotides containing..., 2017].

Рис. 3. Схематическое изображение ImG4 с мисматчами, выпуклостями и вакансиями

Вычислительные биоинформатические анализы показали, что в геноме человека могут образовываться от 300 000 до 3 000 000 потенциальных G4- формирующих последовательностей (PQS). Эти данные были подтверждены высокопроизводительным полногеномным секвенированием G4-seq, который выявил порядка 700 000 G4 (High-throughput sequencing..., 2015). Однако картирование G4 методом ChIP-seq выявило не более 10 000 04-мотивов в высок транскрибируемых регуляторных областях хроматина, обедненных нуклеосо- мами [Permanganate/s1 nuclease..., 2017]. Эти данные указывают на то, что G4 в основном находятся в несложенном состоянии в хроматине и могут влиять на динамику и локализацию нуклеосом.

04-образующие последовательности распределены неравномерно и неслучайно. PQS преимущественно локализуются в центральных неметилированных и не вовлеченных в образование нуклеосом областях генома [Dolinnaya et al., 2016]. G4 высоко представлены в теломерных районах хромосом, микро- и минисателлитных повторах, в генах рибосомных РНК, в регуляторных участках генома, таких как промоторы, энхансеры, инсуляторы, точки начала репликации, последовательности, ответственные за перегруппировку генов иммуноглобулинов, участки повышенной ломкости хромосом, точки рекомбинации, интроны генов, CpG островки, а также в различных участках транскриптома: регуляторные сайты альтернативного процессинга мРНК, длинные некодирующие РНК, 5'- и 3'-нетранслируемые области мРНК, теломерные РНК [Dolinnaya et al., 2016]. Вычислительными методами было показано, что G4-мотивы высоко консервативны в эукариотических организмах [QGRS-conserve..., 2014]. При этом PQS преимущественно локализуются в регуляторных участках геномов теплокровных животных, в наибольшей степени -- человека. Плотность G4-образующих последовательностей значительно выше в некодирующих районах по сравнению с кодирующими, причем PQS присутствуют в регуляторных участках ранних и поздних генов в равной степени. G4-мотивы в основном связаны с генами, кодирующими белки, ответственными за регуляторные функции, а не с генами «домашнего хозяйства» [Dolinnaya et al., 2016]. Помимо человека, G4-мотивы обнаружены в геномах других млекопитающих, вирусах, бактериях, дрожжах и простейших [Spiegel et al., 2020], поэтому G4-структуры участвуют во многих инфекционных заболеваниях.

Важно отметить, что PQS распределены в геномах млекопитающих, бактерий и дрожжей аналогичным образом и представлены в таких же функциональных областях, что и в геноме человека. Такая консервативность дополнительно свидетельствует о том, что G4-структуры участвуют в регуляции важнейших клеточных процессов, таких как репликация, транскрипция, трансляция и геномная нестабильность [Ruggiero et al., 2018].

В течение последних 30 лет множество работ было посвящено поиску селективно связывающих G-квадруплексы низкомолекулярных соединений из библиотеки как природных, так и синтетических молекул. Для рационального дизайна G4-лигандов необходимо знать точную структуру G-квадруплекса и способ связывания лиганда с ним. Основные модели взаимодействия лиганд-квадруплекс: интеркаляция лиганда между G-квартетами, стекинг с верхней или нижней тетрадой, взаимодействие с петлями и бороздками. Разные способы связывания и их комбинации имеют различные степени специфичности. Взаимодействия большинства лигандов с G4 обычно следуют нескольким принципам:

1. Расширенная планарная ароматическая система лиганда подобна G-квартету по размеру и форме (облегчает п - п-стекинг). Этот остов может быть сшит с другими жесткими планарными структурами или сопряжен с гибкими фрагментами посредством вращающихся связей.

2. Боковые цепи лигандов взаимодействуют с петлями и бороздками. Катионные заместители обычно увеличивают аффинность связывания с анионной фосфатной основной цепью.

3. Катионный центр ароматического ядра электростатически взаимодействует с отрицательно заряженным центром G-квадруплекса. Электронодефицитная природа лиганда усиливает его катион - п-взаимодействие с G-квартетом.

4. Паттерны водородных связей, определяющие молекулярную структуру лиганда, позволяют распознавать области бороздок G-квадруплекса.

Однако прямое сравнение эффектов лигандов на G4 в зависимости от хемотипов может быть проблематичным. Результаты сильно зависят от точной последовательности ДНК, условий эксперимента (например, различных концентраций калия) и используемых методов. На данный момент в PDB (Protein Data Bank) доступно лишь небольшое количество комплексов G4 с лигандами, определенных кристаллографией или ЯМР. При этом важно отметить, что конденсированные ароматические полициклические или макроциклические системы во всех случаях взаимодействуют с гуанинами внешних G-квартетов, а положительно заряженные группы боковых цепей взаимодействуют, прямо или косвенно, через молекулы воды с бороздками или петлями [Duarte et al., 2018].

G4-лиганды разделяют на четыре класса: макроциклы, конденсированные гетероциклы, модульные лиганды и комплексы с металлами. Учитывая полиморфизм и структурную изменчивость различных G4, разумно в первую очередь рассматривать в качестве потенциальных G4-лигандов соединения натурального происхождения. Природные соединения характеризуются высоким уровнем сложности и молекулярным разнообразием, избирательностью и специфической биологической активностью. Действительно, многие исследовательские группы показали, что природные молекулы способны специфически распознавать G4-структуры и проявлять высокую G4-опосредованную биологическую активность: регулировать функциональность теломер, влиять на репликацию, транскрипцию и трансляцию [An overview of quadruplex ligands..., 2020].

Рис. 4. Химическая структура теломестатина

Теломестатин -- природный макроцикл, выделенный из актиномице- та Streptomyces anulatus 3533-SV4. Он считается эталонным соединением с точки зрения распознавания G-квадруплексов из-за его способности ингибировать теломеразу in vitro (IC = 5 нМ) и высокой селективности в отношении G4 по сравнению с дуплексной ДНК (> 70 раз). Его высокое сродство и селективность предположительно связаны с необычной структурой с уникальными характеристиками: нейтральное полициклическое соединение, состоящее из пяти оксазолов, двух метилоксазолов и одного тиазолинового кольца (рис. 4), характеризующееся высокой гидрофобностью, планарностью и идеальным размером для стекинга с G-тетрадой. Помимо высокой аффинности к теломерным одноцепочечным 3'-последовательностям, теломестатин может вызывать диссоциацию теломер-специфических связывающих белков (TRF2 и POT1) [The G-quadruplex ligand telomestatin..., 2006], участвующих в кэппировании теломер, в результате чего апоптоз протекает быстрее, чем в случае простого ингибирования теломеразы. Теломестатин является эффективным антипролиферативным агентом со значениями IC₅₀ от 0,1 до 5 мкМ [G-quadruplex binding ligands..., 2012] без значительного воздействия на здоровые клетки (5 мкМ на фибробласты MRC-5). Поэтому его использовали для изучения роли 04-структур в промоторной области онкогенов, таких как c-MYC, BCL2 и VEGF [^n overview of quadruplex ligands..., 2020]. Тем не менее, теломестатин имеет несколько недостатков: он плохо растворяется в воде, что затрудняет доставку, и его экстракция и синтез достаточно сложные для получения большого количества чистого вещества.

Класс синтетических макроциклических G4-лигандов можно разделить на три основные группы: производные теломестатина, макроциклы на основе амидов и аналоги порфирина.

Поиск соединений, подобных теломестатину, начался в 2006 году с гекса- оксазольных макроциклов (рис. 5), состоящих из двух симметричных трис- оксазолов, связанных аминокислотами для дополнительной гибкости [Synthesis and G-quadruplex stabilizing..., 2006]. Варьируя аминокислотные линкеры, можно значительно изменять свойства лигандов. Например, замена валина на лизин (HXDV ^ L2H2-6OTD) усиливает сродство этих производных к G4 и делает их более водорастворимыми. Гекса-оксазол с аргининовым линкером (L2G2-6OTD) имеет схожие свойства с теломестатином [Synthesis of a potent

Рис. 5. Наиболее перспективные макроциклические G4^m"aH4bi

G-quadruplex..., 2008].

L1H1-7OTD оказался более эффективным с точки зрения ингибирования теломеразы (IC₅₀ = 0,8 нМ), чем теломестатин (IC₅₀ = 5 нМ), цитотоксичность по отношению к клеткам HeLa составила 0,03 мкМ (для тело- местатина по отношению к клеткам рака поджелудочной железы человека MiaPaCa IC₅₀ = 0,5 мкМ [Liu et al., 2005]).

Производные теломестатина и макроциклы на основе амидов

Для стабилизации G4-димеров были исследованы мультимерные макроциклы. 6OTD-димер (см. рис. 5) одновременно может взаимодействовать с обеими терминальными G-тетрадами (см. рис. 6a). Он не обладает большим сродством к G4, чем мономерный 6OTD, но проявляет избирательность в отношении длинных теломерных ДНК и эффективно стабилизирует длинный теломерный фрагмент за счет связывания с каждым G4 telo24 с образованием сэндвичевых комплексов (рис. 6б) [Evaluation of the interaction..., 2013].

Чтобы отличить полимерные G-квадруплексы от мономерных, было разработано тетрамерное производное теломестатина 6OTD-тетрамер (см. рис. 5).

6OTD-тетрамер связывает сразу несколько G4 одноцепочечного 3'-конца теломер значительно эффективнее (в > 40 раз), чем отдельные G4 (рис. 7) [Adaptive and specific..., 2017]. Также в качестве G4-лигандов были исследованы макроциклы, состоящие из трех-четырех оксазолов или фуранов (Три- соксазол на рисунке 5), но обычно они имеют более низкое сродство к G4, чем теломестатин. Однако замена пятичленных колец на хинолины (Трисок- сазол ^ Трисхинолин на рисунке 5) приводит к значительному повышению G4-стабилизирующего эффекта за счет увеличения площади ароматической поверхности [G-quadruplexDNA bound..., 2009].

Рис. 6. (а) Схематическая модель взаимодействия теломестатина, L2H2-6OTD и L2H2-6OTD-димера с теломерным G4 telo24;

(б) Схематическая модель взаимодействия L2H2-6OTD с длинной теломерной ДНК [Evaluation of the interaction..., 2013]

Порфирины характеризуются высокой растворимостью в воде и способностью к п - п-стекингу за счет ионной природы и пониженной электронной плотности ароматического ядра. Первым G4-лигандом этого ряда является TMPyP4 (рис. 8), способный взаимодействовать с квадруплексами из теломерной ДНК и ингибировать теломеразу с IC₅₀ = 6 мкМ. Кроме того, TMPyP4 подавляет экспрессию некоторых онкогенов, таких как c-MYC, KRAS, RET и c-KIT [An overview of quadruplex ligands..., 2020]. Тем не менее он слабо селективен к G4 по сравнению с дуплексной ДНК (G4 : дуплекс = 2 : 1), что, вероятно, объясняет его сильную неспецифическую цитотоксичность (IC для фибробластов человека ~13 мкМ) [Effects of cationic..., 1999]. Способ связывания TMPyP4 с квадруплексом считается стандартной молекулярной моделью взаимодействий между низкомолекулярными соединениями и G4. В ходе поиска более селективных 04-лигандов этого класса макроциклов было исследовано множество модифицированных порфиринов. Одним из лидеров оказался N-метилмезопорфирин (NMM) (рис. 8), демонстрирующий высокую селективность к G4, но низкое сродство, вероятно, из-за наличия анионных боковых цепей. Эта особенность, вместе с его фотофизическими свойствами, сделала его одним из наиболее часто используемых 04-сенсоров.

Рис. 7. Мономерные и полимерные взаимодействия между G-квадруплексами (G4) и лигандами. Связывание между полимерным лигандом и полимерным G4 наиболее эффективное [Adaptive and Specific..., 2017]

Рис. 8. Химические структуры порфиринов ТМРуР4 и NMM

Алкалоиды представляют собой важный класс низкомолекулярных природных соединений, характеризующихся ароматическими и гетероциклическими конденсированными кольцами, известные своей широкой биологической активностью, в частности они эффективны в терапии некоторых типов рака и малярии [An overview of quadruplex ligands..., 2020]. Благодаря своей высокой эффективности и низкой системной токсичности алкалоиды обладают значительным терапевтическим потенциалом. На данный момент известно несколько представителей данного класса, которые избирательно и сильно стабилизируют G4-структуры -- это протоберберины, криптолепин, индолы, флавоноиды, индолизины и феноксазины.

Протоберберины -- это класс природных алкалоидов-антибиотиков, выделенных из корней и коры китайских лекарственных растений, таких как Coptis chinensis и Hydrastis canadensis. Было показано, что берберин (рис. 9) и его производные, стабилизируя теломерные G4, ингибируют теломеразу [Pyridine derivative..., 2020]. Также берберин демонстрирует противоопухолевую активность, ингибируя пролиферацию клеток нескольких типов опухолей [Berberine, an epiphany..., 2014]. Протоберберины имеют в своих полициклических структурах четвертичные соли аммония, которые обеспечивают лучшую растворимость и повышенное сродство к G-тетрадам за счет снижения электронной плотности в ароматической системе. В 2018 году было обнаружено, что эпиберберин (рис. 9) может специфически распознавать и стабилизировать гибридные G4 в теломерных областях человека, а также переводить G4 других топологий в гибридную конформацию, вызывая обширные теломерные перестройки [Molecular recognition..., 2018].

Криптолепин (см. рис. 9) -- производное хинолина, обладающее противомалярийными и цитотоксическими свойствами. Его тетрациклическая поверхность обеспечивает преимущественное распознавание GC-богатых дуплексных последовательностей по сравнению с AT-богатыми, а также стабилизирует триплексные и квадруплексные структуры [Interactions of cryptolepine..., 2003].

Индол-3-карбинол (I3C на рисунке 10) -- биологически активное вещество, содержащееся в овощах семейства крестоцветных, таких как белокочанная и брюссельская капуста, брокколи и пр. Дииндолилметан (DIM на рисунке 10) -- стабильный хорошо абсорбируемый in vivo метаболит индол-3- карбинола. Для I3C показаны протективные свойства для сердечно-сосудистой [Licznerska et al., 2016] и желудочно-кишечной систем [Indole-3-carbinol induces..., 2016].

Рис. 10. Химические структуры нндол-3-карбинола (I3C) и 3,3'-дииндолилметана (DIM)

Важно отметить, что индол и его производные вырабатываются микробиотой кишечника и, как считается, защищают кишечник от воспалений. I3C препятствует образованию активных форм кислорода, образованию тромбов и проницаемости кровеносных сосудов. Регулируя апоптотические сигнальные белки, I3C и DIM могут проявлять противоопухолевую активность в отношении различных видов рака, таких как рак печени, легких, молочной железы, толстой кишки и простаты [Indole-3-carbinol induces..., 2016].

Известны производные индола, эффективно и селективно стабилизирующие G4-структуры в промоторах онкогенов и проявляющие противоопухолевые и противовоспалительные свойства in vitro [Study of the interaction..., 2017; A dihydroindolizino indole..., 2015]. Эффекты препаратов на основе I3C могут быть усилены добавками природных нутриентов (рис. 11) -- кверцетина, генистеина и эпигаллокатехин галлата (EGCG), которые также обладают G4-стабилизирующими свойствами [Structural insights into..., 2020].

Рис. 11. Химические структуры кверцетина, EGCG и генистеина

EGCG (рис. 11) -- катехин, содержащийся в больших количествах в зеленом чае. Это соединение известно своими многочисленными свойствами: антиоксидантными, антиканцерогенными, антимикробными и нейропротек- торными. Более того, в настоящий момент активно ведутся исследования EGCG для терапии и профилактики коронавирусной инфекции COVID-19 и уже были получены первые положительные результаты [Potential protective mechanisms..., 2021].

Кверцетин (см. рис. 11) -- это природный флавоноид, содержащийся в растениях преимущественно красного цвета: в гречневой крупе, луке, яблоках, перце, чае, красном винограде, цитрусовых, вишне, чесноке, бруснике, томатах, малине, чернике, клюкве и многих других продуктах. Кверцетин обладает ярко выраженными антиоксидантными свойствами. Защищает клетки от повреждений, вызванных свободными радикалами, снижая риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, нарушений обмена веществ и некоторых видов рака [David et al., 2016].

Генистеин (см. рис. 11) -- соединение, относящееся к классу изофлавонов, содержащееся во многих продуктах, таких как соя, картофель и бобы. Генистеин уменьшает жировую ткань, подавляет дифференцировку адипоцитов, снижает уровень холестерина и триглицеридов; обладает миопротекторным действием, предотвращает атрофию и повреждение мышц, а также влияет на рост мышечной массы [Genistein -- a supplement..., 2021]. Более того, генистеин является эффективным химиотерапевтическим средством против различных типов рака: регулирует апоптоз, клеточный цикл и ангиогенез, а также подавляет метастазирование [Genistein and cancer..., 2015].

В структуру большого числа алкалоидов, лекарственных средств и других физиологически активных веществ (в том числе G4-лигандов) входят гетероциклические системы индолизина и его полностью восстановленной формы индолизидина (рис. 12). Индолизин в чистом виде в природе встречается редко, а его производные (включая индолизидин и производные индолизидина) выделяются из растений, насекомых, животных, морских обитателей и микробов. Природные и синтетические индолизины обладают противоопухолевой, антибактериальной, антагонистической и антипролиферативной активностью [Review on chemistry..., 2017].

Рис. 12. Структурные формулы индолизина и индолизидина

Феноксазин (дибензо-1,4-оксазин) -- гетероциклическое соединение, представляющее собой оксазин, слитый с двумя бензольными кольцами (рис. 13а). Феноксазин является центральным ядром ряда природных химических соединений, таких как лакмус, красители нильский синий и нильский красный, а также известных антибиотиков и противоопухолевых агентов, таких как ак- тиномицин D (ActD) (рис. 136). Известно, что ActD может влиять на транскрипцию путем связывания с G4-образующими последовательностями, однако он не проявлял селективности к G4-фрагменту промотора c-Myc [Kang et al., 2009]. В нашей лаборатории ранее было показано, что производные феноксазина G^8AE-clamp (С8-аминоэтил) и i-clamp (С8-аминопропил) (рис. 13в) повышают термостабильность вторичных структур ДНК (дуплекс и /-мотивы) [i-Clampphenoxazine..., 2018].

Рис. 13. Структурные формулы (а) феноксазина, (б) актиномицина D и (в) нуклеозидных производных феноксазина G^8AE-clamp и i-clamp

На основе вышеописанных природных лигандов в течение последних 5 лет было синтезировано еще несколько классов соединений с расширенными планарными ароматическими системами, многие из которых оказались перспективными для терапевтического применения. В основном эти лиганды представляют собой ароматический гетероцикл с различными алкильными боковыми цепями для улучшения клеточного поглощения, растворимости и повышения сродства к G-квадруплексам. К основным классам таких G4-лигандов относят акридины, хиназолоны и хинолины, фенантролины, антрахиноны, хиндолины, нафталендиимиды и перилендиимиды.

Акридины представляют собой класс гетероциклических соединений, характеризующихся тремя конденсированными шестичленными кольцами с плоской ароматической поверхностью. Было показано, что акридины с заместителями в 3,6,9-положениях демонстрируют повышенную аффинность к G4, а также селективность по сравнению с дуплексной ДНК, особенно если в положение 9 вводится ароматический фрагмент [An overview of quadruplex..., 2020]. Главным представителем этого ряда является BRACO-19 (см. рис. 14а), который связывается с G4 из теломерных повторов человека с K_a = 1,6 х 10⁷ M^-1 и ингибирует теломеразу с IC₅₀ = 0,06 мкМ. Его противоопухолевый эффект основан на способности снижать активность теломеразы, препятствуя ее взаимодействию с теломерами.

Биофизическими методами был показан значительный вклад ароматического ядра во взаимодействии с мишенью. Также было установлено, что удаление заместителя в положении 9 (см. рис. 14б) приводит к повышению селективности к G4 по сравнению с дуплексной ДНК [Synthesis and evaluation..., 2009].

Рис. 14. Структурные формулы (a) BRACO-19 и (б) его производного

Другой класс эффективных 04-лигандов был синтезирован на основе природного алкалоида изаиндиготона, выделенного из Вайды красильной семейства крестоцветных. В 2009 году было обнаружено, что 4,6-дизаме- щенные изаиндиготоны (соединение 1 на рисунке 15) обладают высоким сродством к теломерному G4 F21T человека (K_a = 9,8 х 10⁶ M^-1) [Isaindigotone derivatives..., 2009]. В 2017 году в ходе дизайна новых лигандов к G4 из промотора c-MYC те же авторы разработали две новые серии молекул, которые различаются длиной боковой цепи, размером неароматического кольца и концевым третичным амином. Наиболее эффективным оказалось соединение 2 (рис. 15), стабилизирующее G4 c-MYC на AT_m = 12 °C и способное разрушать комплекс между этим квадруплексом и фактором транскрипции NM23-H2, вызывая апоптоз в раковых клетках [Design, synthesis, and evaluation..., 2017].

Изаиндиготоны проявляют сродство также к квадруплексам РНК. Конденсированный димер RGB-1 (рис. 15) стабилизирует различные РНК G4 (K_d = 5,9 мкМ), не проявляя сродства к ДНК G4; активирует 04-опосредованное ингибирование трансляции в клетках млекопитающих и снижает экспрессию протоонкогена NRAS в клетках рака молочной железы человека [A small molecule that..., 2016]. Производное хинолона CX-3543 (рис. 15), известное как кварфлоксин, является перспективным противоопухолевым препаратом, прошедшим две фазы клинических испытаний для пациентов с BRCA1/2-дефицитными опухолями [NCT00780663]. Кварфлоксин связывается с 04-последовательностью рибосомной ДНК, предотвращая ее комплексообразование с нуклеолином, блокирует транскрипцию рРНК и приводит к апоптозу [Small molecules targeting..., 2014]. Показано, что кварфлоксин эффективно связывается с G4 из промотора с-Мус и подавляет его экспрессию [Brooks et al., 2010]. Несколько лет назад было идентифицировано производное хиназолина CX-5461 (рис. 15), или пиднарулекс, которое стабилизирует квадруплексы с-MYC, c-KIT и hTELO (AT_m > 15 °C при концентрации 1 мкМ); нарушая взаимодействие рДНК с нуклеолином, блокирует транскрипцию полимеразы I и запускает таким образом путь p53, приводящий к апоптозу BRCA1/2-дефицитных раковых клеток [CX-5461 is a DNA..., 2017]. В данный момент пиднарулекс проходит первую фазу клинических испытаний против рака молочной железы, рака яичников и гематологических злокачественных новообразований [NCT02719977].

Рис. 15. Структурные формулы синтетических производных изаиндиготона: 1, 2, RGB-1, CX-3543 (кварфлоксин) и CX-5461 (пиднарулекс)

В 2007 году группой французских ученых был описан лиганд на основе фенантролина PhenDC3 (см. рис. 16). За счет внутримолекулярных водородных связей жесткая система лиганда эффективно стабилизирует теломерный G4 F21T человека (AT_m = 29,7 °C) даже в присутствии дуплексной ДНК [Highly efficient G-quadruplex..., 2007]. PhenDC3 аффинен не только к квадруплексам ДНК, но и РНК [RNA synthesis is..., 2018]. Впоследствии различные 1,10-фенантролины были синтезированы для создания лиганда, способного отличать G4, присутствующих в промоторной области онкогенов, от теломерных. Хороший стабилизирующий эффект среди таких соединений показал Phen-Pr (AT_m ~ 20 °C для c-MYC G4) (см. рис. 16) [Topology specific..., 2015].

Рис. 16. Структурные формулы синтетических G4-лигандов на основе фенантролина: PhenDC3 и Phen-Pr

Антрахиноны (9,10-антрацендионы) давно были известны своей способностью взаимодействовать с ДНК и проявлять противоопухолевые свойства. Однако клиническое применение антрациклинов выявило ряд недостатков, основными из которых являются высокая кардиотоксичность и развитие множественной лекарственной устойчивости в опухолевых клетках. Поиск более доступных и эффективных противоопухолевых препаратов с пониженной кардиотоксичностью привел к открытию 1,4-бис-(2-аминоэтиламино) антрацендионов, таких как митоксантрон и аметантрон (см. рис. 17) [Zee- Cheng et al., 1983]. В 2016 году было показано, что митоксантрон связывается c G4-мишенью и стабилизирует ее структуру с AT_m ~ 26 °С [Pradeep et al., 2016]. Сегодня митоксантрон используется при лечении нескольких типов опухолей [Dunn et al., 1996; Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies..., 1992] и рассеянного склероза [Wawrzyniak et al., 2020], а также является контрольным G4-лигандом, широко использующимся в исследованиях и скринингах новых G4-лигандов в качестве light-up пробы (обладает 86 %-ным вытеснением тиазолоранжа) [Identification of new DNA..., 2017].

Рис. 17. Химические структуры антрахиноновых синтетических G4-лигандов

В ходе оптимизации полициклического ядра и варьирования боковых цепей были найдены препараты с улучшенными терапевтическими свойствами -- оксантразол, пиксантрон и нортопиксантрон (BRD-3438) (см. рис. 17). Эти новые производные обладают мультитаргетным действием, то есть способны ингибировать активность разных внутриклеточных мишеней, включая G-квадруплексы, теломеразу, топоизомеразы I, II.

Один из первых G4-лигандов этого ряда, который проявлял высокую аффинность к теломерному G-квадруплексу и ингибировал теломеразу с IC₅₀ = 23 мкМ, был синтезирован в 1992 году [Anthracene 9,10-diones..., 1992]. Позже этой же группой ученых были синтезированы 1,4, 1,5, 1,8, 2,6- и 2,7-дизамещенные антрахиноны с различными аминокислотами в качестве концевых групп боковых цепей для улучшения взаимодействия с бороздками квадруплекса (соединения 1-4 на рисунке 18). Полученные соединения оказались активными ингибиторами теломеразы [1,4- and 2,6-Disubstituted..., 1998]. В 2013 году другая группа исследователей решила использовать в качестве концевых групп вместо аминокислот сахара и разработала антрахинон, конъюгированный с аминосахаром неомицином (соединение 5 на рисунке 18). Полученный лиганд демонстрировал еще более высокое сродство к теломерному квадруплексу (K_a = 1,25 х 10⁷ M^-1) [DualRecognition of Human..., 2013].

Рис. 18. Химические структуры антрахиноновых синтетических 04-лигандов

Далее, поскольку гуанидиновая группа способствует связыванию с нуклеиновыми кислотами, Ксодо Луиджи и его коллеги разработали 4,11-дизамещенные гуанидин-антратиофендионы. Из пула синтезированных соединений максимальное сродство к G4 было замечено в случае двух- и трехуглеродных алкильных цепей в качестве боковых заместителей (соединение 6 на рисунке 18), с K_d по отношению к G4 из теломерных повторов человека hTELO и онкогена KRAS ниже 0,2 мкМ.

Ярким представителем модульных G4-лигандов является природный противоопухолевый антибиотик дистамицин A (Dist-A), способный связываться с малыми бороздками ДНК, с A/T-богатыми участками дуплексной ДНК, а также проявляющий высокую селективность в отношении параллельных G4 [Structural and Thermodynamic..., 2007]. ЯМР-спектроскопия комплекса Dist-A/ [d(TGGGGT)]₄ демонстрирует необычный способ связывания: два димера Dist-A/Dist-A одновременно связываются с противоположными бороздками квадруплекса. За счет гибкости пептидных связей лиганд приобретает серповидную форму (рис. 19), которая идеально соответствует кривизне бороздок G4. Кроме того, присутствие аммониевой группы увеличивает электростатические взаимодействия лиганд-квадруплекс [Structural and conformational..., 2010].

Рис. 19. Химические структуры модульных G4^m"aHaoB.

Дистамицин А (Dist-A) и пиридостатин (PDS)

Синтетические модульные G4^^aHAbi имеют самую слабую связь с природными молекулами. К ним относят соединения с двумя и более ароматическими модулями, состоящими из двух конденсированных колец. Наиболее часто используемым модульным G4-лигaндом синтетического происхождения является производное аминопиридина пиридостатин (PDS, см. рис. 19). Известно о его взаимодействии с теломерным G4 [Synthesis of oligonucleotides containing..., 2017], РНК G4 [Data on secondary structures..., 2017], подавлении транскрипции гена BRCA1 в нейронах, отвечающего за репарацию двуцепочечных разрывов ДНК за счет связывания с G4 в его промоторе [The G-quadruplex DNA stabilizing..., 2017]. Связываясь с квадруплексными структурами, пиридостатин инициирует остановку клеточного цикла. Методом иммунопреципитации хроматина c антителами к белкам-маркерам разрывов ДНК yH2AX с последующим секвенированием (ChIP-Seq) было получено полногеномное распределение PDS-индуцированных участков повреждения. Согласно результатам, пиридостатин практически не влияет на уровни экспрессии yH2AX- негативных контрольных генов и значительно подавляет экспрессию yH2AX- позитивных мишеней. Наибольшее влияние было оказано на протоонкоген SRC, его уровни РНК снижались более чем на 95 % спустя 8 часов после обработки. Таким образом, была продемонстрирована сильная корреляция между PDS-опосредованным повреждением ДНК и подавлением транскрипции определенных генов [Rodriguez et al., 2012].

Fe(Ш)-протопорфирин IX (гем В) представляет собой природный комплекс железа (рис. 20а), входящий в состав гемоглобинов, миоглобинов и цитохромов, способный связываться с G-квадруплексами и стабилизировать их структуру [Golub et al., 2015]. Первоначально гем В практически не использовали из-за его склонности к окислению. В настоящее же время это свойство применяется многими искусственными ДНКзимами. ДНКзим, или дезоксирибозим, -- молекула ДНК, обладающая каталитический активностью расщепления, лигирования и фосфорилирования молекулы ДНК, метилирования порфиринов и осуществления гидролиза РНК; также известны дезоксирибозимы с РНКазной активностью. Каталитическая активность комплексов гемин^4 определяется структурными и пространственными особенностями фолдинга, а также количеством G-тетрад квадруплекса. Гемин является эффективным препаратом для лечения синдрома ATR-X (альфа-таласемии и умственной отсталости). Он связывается с G4 в области CpG-островков в мышиной модели ATR-X, уменьшая рекрутирование РНК-полимеразы II и подавляя экспрессию гена xlr3b, что приводит к восстановлению когнитивных функций [Targeting G-quadruplexDNA..., 2018].

В последние несколько лет металлокомплексам уделялось значительное внимание в связи с их высокой аффинностью к G4-мишеням и низкой цитотоксичностью. Первыми синтетически модифицированными металлокомплексами стали порфирины. В ядро TMPyP4 вводили катионы различных металлов, включая переходные металлы, металлы основных групп и лантаноиды (см. рис. 20б).

Все такие металлопорфирины демонстрировали умеренные значения константы связывания в диапазоне 10⁶-10⁷ М^-1 [G-quadruplex DNA targeted..., 2017]. В частности, комплекс Zn(II)-TMPyP4 был единственным металлопорфирином, способным индуцировать и ускорять фолдинг гибридной G4-структуры (AT_m = 13,8 °C) даже при низкой концентрации K+. Замена Zn(II) на Cu(II) или Pt(II) приводит к плоскому квадратному комплексу с пониженной стабилизирующей и даже возможной дестабилизирующей способностями [Induction of G-quadruplex DNA..., 2011]. Тем не менее Pt(II)-TMPyP4 является умеренным ингибитором теломеразы и фотосенсибилизатором, что делает его потенциальным препаратом для фотодинамической терапии рака [Investigation of the interactions..., 2016].

Рис. 20. Химические структуры металлокомплексов, используемых в качестве G4-лигандов: (а) природный комплекс Fe(Ш)-протопорфирин IX (гем В) и (б) синтезированный на основе порфирина TMPyP4

Заключение

gквадруплек терапия противоопухолевый

Список источников / References

1. 1,4- and 2,6-Disubstituted amidoanthracene-9,10-dione derivatives as inhibitors of human telomerase / P. J. Perry [et al.] // Journal of Medicinal Chemistry. 1998. Vol. 41 (17). P. 3253-3260. DOI: https://doi.org/10.1021/jm980n05

2. A dihydroindolizino indole derivative selectively stabilizes G-quadruplex DNA and down-regulates c-MYC expression in human cancer cells / N. Nagesh [et al.] // Bio- chimica et Biophysica Acta (BBA) -- General Subjects. 2015. Vol. 1850 (1). P. 129-140. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2014.10.004

3. A small molecule that represses translation of G-quadruplex-containing mRNA / Y. Katsuda [et al.] // Journal of the American Chemical Society. 2016. Vol. 138 (29). P. 9037-9040. DOI: https://doi.org/10.1021/jacs.6b04506

4. Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units / J. Abraham Punnoose [et al.] // Journal of the American Chemical Society. 2017. Vol. 139 (22). P. 7476-7484. DOI: https://doi.org/10.1021/jacs.7b00607

5. An overview of quadruplex ligands: their common features and chemotype diversity / V. Pirota [et al.] // Annual Reports in Medicinal Chemistry. 2020. Vol. 54. P. 163-169. DOI: https://doi.org/10.1016/bs.armc.2020.04.008

6. Anthracene 9,10-diones as potential anticancer agents. Synthesis, DNA-binding, and biological studies on a series of 2,6-disubstituted derivatives / M. Agbandje [et al.] // Journal of Medicinal Chemistry. 1992. Vol. 35 (8). P. 1418-1429. DOI: https://doi.org/10.1021/jm00086a010

7. Anticancer activity of novel pyrido[2,3-b]indolizine derivatives: the relevance of phenolic substituents / A. Boot [et al.] // Anticancer Research. 2014. Vol. 34 (4). P. 1673-1677. URL: https://ar.iiarjournals.org/content/34/4/1673

8. Berberine, an epiphany against cancer / L. M. Guamвn Ortiz [et al.] // Molecules. 2014. Vol. 19. P. 12349-12367. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules190812349

9. Brooks T. A., Hurley L. H. Targeting MYC expression through G-quadruplexes // Genes & Cancer. 2010. Vol. 1 (6). P. 641-649. DOI: https://doi.org/10.1177/1947601910377493

10. CX-5461 is a DNA G-quadruplex stabilizer with selective lethality in BRCA1/2 deficient tumours / H. Xu [et al.] // Nature Communications. 2017. Vol. 8. Art. 14432. DOI: https://doi.org/10.1038/ncomms14432

11. Data on secondary structures and ligand interactions of G-rich oligonucleotides that defy the classical formula for G4 motifs / M. Vlasenok [et al.] // Data in Brief. 2017. Vol. 11. P. 258-265. DOI: https://doi.org/10.10167j.dib.2017.02.023

12. David A. V. A., Arulmoli R., Parasuraman S. Overviews of biological importance of quercetin: a bioactive flavonoid // Pharmacognosy Reviews. 2016. Vol. 10 (20). P. 84-89. DOI: http://dx.doi.org/10.4103/0973-7847.194044

13. Design of Modular G-quadruplex Ligands / A. R. Duarte [et al.] // ChemMedChem. 2018. Vol. 13 (9). P. 869-893. DOI: https://doi.org/10.1002/cmdc.201700747

14. Design, synthesis, and evaluation of isaindigotone derivatives to downregulate c-MYC transcription via disrupting the interaction of NM23-H2 with G-quadruplex / C.Shan [et al.] // Journal of Medicinal Chemistry. 2017. Vol. 60 (4). P. 1292-1308. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6b01218

15. Dolinnaya N.G., Ogloblina A.M., Yakubovskaya M.G. Structure, properties, and biological relevance of the DNA and RNA G-quadruplexes: Overview 50 years after their discovery // Biochemistry (Moscow). 2016. Vol. 81 (13). P. 1602-1649. DOI: http:// dx.doi.org/10.1134/S0006297916130034

16. Dual recognition of human telomeric G-quadruplex by neomycin-anthraquinone conjugate / N. Ranjan [et al.] // Chemical Communications. 2013. Vol. 49 (51). P. 5796-5798. DOI: https://doi.org/10.1039/C3CC42721H

17. Dunn C. J., Goa K. L. Mitoxantrone: a review of its pharmacological properties and use in acutenonlymphoblastic leukaemia // Drugs & Aging. 1996. Vol. 9 (2). P. 122-147. DOI: https://doi.org/10.2165/00002512-199609020-00007