L-цистеїн стимулює ендогенний синтез сірководню, пригнічує окисний стрес і відкривання мітохондріальної пори у серці старих щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

L-цистеїн стимулює ендогенний синтез сірководню, пригнічує окисний стрес і відкривання мітохондріальної пори у серці старих щурів

Н.А. Струтинська, Ю.П. Коркач, Л.А. Мись, А.Ю. Лучкова, В.Ф. Сагач

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ

Досліджували вплив амінокислоти L-цистеїну на вміст сірководню, показники окисного стресу та кінетичні характеристики Са2+-індукованого набухання мітохондрій у серці старих щурів. Показано, що одноразове введення їм L-цистеїну (121 мг/кг) пригнічувало спонтанне і Са+2-індуковане набухання мітохондрій, що проявлялось у зниженні амплітуди цих процесів і свідчило про запобігання пороутворенню у серці. При старінні знижувалися мітохондріальні пули сірководню на тлі порушення конститувного, суттєвого підвищення індуцибельного та реутилізаційного синтезу NO. Застосування L-цистеїну призводило до зростання у 2,56 раза вмісту сірководню у мітохондріях серця старих тварин (6,015 ± 0,74 нмоль/мг білка) порівняно з такими без введення амінокислоти (2,35 ± 0,25 нмоль/мг білка). Отже, за цих умов відновлювався синтез сірководню в мітохондріях, імовірно, внаслідок активації H^S-синтизувальних ферментів їх субстратом, що сприяло достовірному пригніченню індуцибельного синтезу NO у 1,73 раза та зниженню вдвічі активності нітратредуктази і аргінази. При введенні амінокислоти старим тваринам знижувалися у 1,5 раза пули сечової кислоти, що може свідчити про пригнічення утворення супероксидного радикала, а також суттєво зменшувався вміст дієнових кон'югатів (у 7 разів), що вказує на пригнічення окисного стресу на ранніх етапах перекисного окиснення ліпідів. Таким чином, результати досліджень свідчать про участь L-цистеїну у стимуляції ендогенного синтезу сірководню в мітохондріях, що сприяє зниженню оксидативного стресу в органелах і модуляції змін проникності мітохондріальних мембран. Цей факт говорить про важливість газового трансмітера сірководню як регуляторного фактора у серцево-судинній системі, що здійснює модуляторний контроль над функціями клітини та їх органелами.

Ключові слова: L-цистеїн; сірководень; окисний стрес; неспецифічна мітохондріальна пора; старіння.

L-ЦИСТЕИН СТИМУЛИРУЕТ ЭНДОГЕННЫЙ СИНТЕЗ СЕРОВОДОРОДА, ПОДАВЛЯЕТ ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС И ОТКРЫВАНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ПОРЫ В СЕРДЦЕ СТАРЫХ КРЫС

H.А. Струтинская, Ю.П. Коркач, Л.А. Мысь, А.Ю. Лучковая, В.Ф. Сагач

Исследовали влияние аминокислоты L-цистеина на содержание сероводорода, показатели окислительного стресса и кинетические характеристики Са2+-индукованого набухания митохондрий в сердце старых крыс. Показано, что однократное введение L-цистеина (121 мг/кг) подавляло спонтанное и Са2+-индуцированное набухание митохондрий, проявляющееся в снижении амплитуды этих процессов и свидетельствующее о предотвращении порообразования в сердце. При старении снижались митохондриалные пулы сероводорода на фоне нарушения конститутивного синтеза NO, существенного повышения индуцибельного, а также реутилизационного синтеза NO. Применение L-цистеина приводило к увеличению в 2,56 раза содержания сероводорода в митохондриях сердца старых животных (6,015 ± 0,74 нмоль/мг белка) по сравнению с таковыми без введения аминокислоты (2,35 ± 0,25 нмоль/мг белка). Итак, в этих условиях восстанавливался синтез сероводорода в митохондриях, вероятно, вследствие активации H-синтезирующих ферментов их субстратом, способствовало достоверному угнетению индуцибельного синтеза NO в I, 73 раза и снижению вдвое активности нитратредуктазы и аргиназы. В условиях введения L-цистеина старым животным достоверно (в 1,5 раза) снижались пулы мочевой кислоты, тем самым подавляя образование супероксидного радикала, а также существенно уменьшались пулы диеновых конъюгатов (в 7 раз), что указывает на угнетение окислительного стресса при старении именно на ранних этапах перекисного окисления липидов. Таким образом, результаты исследований свидетельствуют об участии L-цистеина в стимуляции эндогенного синтеза сероводорода в митохондриях, что способствует снижению оксидативного стресса в органеллах и модуляции изменений проницаемости митохондриальных мембран. Этот факт говорит о важности газового трансмиттера сероводорода как регуляторного фактора в сердечно-сосудистой системе, который осуществляет модуляторный контроль функций клеток и их органелл.

Ключевые слова: L-цистеин; сероводород; окислительный стресс; неспецифическая митохондриальная пора; старение.

L-CYSTEINE STIMULATES ENDOGENOUS HYDROGEN SULFIDE SYNTHESIS, SUPPRESSES OXIDATIVE STRESS AND MITOCHONDRIAL PERMEABILITY TRANSITION PORE OPENING IN THE HEART OF OLD RATS

N.A. Strutynska, Yu.P. Korkach, LA. Mys, AYu. Luchkova, V.F. Sagach

O. O. Bogomoletz Institute of Physiology of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv

The effect of the amino acid L-cysteine on the hydrogen sulfide content, oxidative stress indicators and kinetic characteristics of Ca2+-induced mitochondrial swelling in the heart of aged rats were investigated. Single administration to old rats of L-cysteine (121 mg/kg) was shown to suppress spontaneous and Ca2+-induced swelling of mitochondria, which manifested in a decrease in the amplitude of these processes and indicated prevention of mPTP formation in the heart. During aging, the mitochondrial pools of hydrogen sulfide decreased against the background of violation of constitutive NO synthesis, and also a significant increase of inducible and salvage NO synthesis. The use of L-cysteine resulted in an increase of 2.56-fold the content of hydrogen sulfide in the mitochondria of the heart of old rats (6.015 ± 0,74 nmol/mg protein) compared to animals without the introduction of the amino acid (2.35 ± 0,25 nmol/ mg protein). Hence, under these conditions, the synthesis of hydrogen sulfide in the mitochondria was restored, probably due to the activation of HjS-synthesizing enzymes by their substrate, which contributed to significant inhibition of inducible NO synthesis by 1.73 times and a decrease by 2 times of nitrate reductase and arginase activity. The introduction of L-cysteine to old animals significantly (1.5 times) reduced uric acid pools, which may indicate suppression of superoxide radicals formation, and significantly decreased pools of diene conjugates (7 times), which indicates the suppression of oxidative stress in the early stages of lipid peroxidation. Thus, the results of studies indicate the participation of L-cysteine in the stimulation of endogenous hydrogen sulphide synthesis in mitochondria, which contributes to the reduction of oxidative stress in organelles and modulation of changes in the permeability of mitochondrial membranes. This fact speaks to the importance of such a gas transmitter as hydrogen sulphide, as a regulatory factor in the cardiovascular system, which modulates the functions of cells and their organelles.

Key words: L-cysteine; hydrogen sulphide; oxidative stress; nonspecific mitochondrial pore; aging.

ВСТУП

Основним субстратом для синтезу сірководню в організмі ссавців є L-цистеїн. Це замінна амінокислота, що може вивільнятися з білків або бути синтезованою з ендогенних амінокислот, наприклад із серину за участю L-метіоніну як джерела сірки, а також надходити в організм з продуктами харчування. Нині відомо, що L-цистеїн регулює метаболічні процеси в організмі, окисний стрес, фізіологічні сигнальні шляхи та супутні захворювання через продукцію трипептиду глутатіону та амінокислоти таурину [1]. ендогенний синтез щур цистеїн

Наразі особливий інтерес представляють і активно досліджуються ефекти газоподібної біологічно активної молекули сірководню (H2S), що ендогенно синтезується в організмі за допомогою ферментів цистатіонін^-синтази (cystathionine Я-synthase - CBS), цистатіоніну-ліази (cystathionine y-lyase - CSE), а також 3-меркаптопіруватсульфуртрансферази (3-mercaptopyrnvate sulfurtransferase - 3-MST) разом з цистеїнамінотрасферазою (cysteine aminotransferase - CAT). CBS і CSE знаходяться в цитоплазмі клітин і використовують піридоксаль-5-фосфат як кофермент, тоді як 3-MST має цитоплазматичну і мітохондріальну локалізацію. САТ також є піридоксаль-5-фосфатнозалежним ферментом. Саме амінокислота L-цистеїн слугує субстратом для синтезу сульфіду водню цими ензимами. Так, CBS і CSE метаболізують цистеїн і/або гомоцистеїн, продукуючи при цьому H2S, тоді як 3-MST синтезує сірководень з 3-меркапто-пірувату, який утворюється ферментом САТ з цистеїну та а-кетоглутарату. Відомо також, що 3-MST потребує кофакторів, зокрема тіоредоксину та дигідроліпоєвої кислоти, а також регулюється кальцієм [2, 3].

У наших попередніх дослідженнях показано, що одноразове введення L-цистеїну зменшує реперфузійні пошкодження ізольованого серця після ішемії [4]. Амінокислота покращувала ендотелійзалежну релаксацію кілець аорти, і цей ефект був нівельований при видаленні періадвентиціальної жирової тканини [5]. При старінні разом з посиленням оксидативно-нітрозативного стресу, також зменшується ендогенний синтез H2S, зокрема в мітохондріях і тканині серця загалом, що в сукупності призводить до підвищення чут-ливості неспецифічної мітохондріальної пори (МП) до її природного активатора кальцію, і є однією з причин розвитку низки патологічних станів організму [6, 7]. Тому було б цікаво дослідити чи додаткове введення старим тваринам L-цистеїну модулює продукцію сірководню та рівень окисних процесів у мітохондріях. Адже ці органели вважаються однією з головних мішеней дії H2S, який впливає на мітохондріальне дихання, апоптоз та їх біогенез. Відомо, що сірководень у низьких, не токсичних концентраціях сприяє біогенезу та функціонуванню мітохондрій, тим самим попереджуючи загибель клітин [8]. Він безпосередньо впливає на активність електронно-транспортного ланцюга (ЕТЛ), діючи як субстрат чи антагоніст цитохром-с-оксидази. Так, у концентраціях менше ніж 20 мкмоль/л H2S може виступати єдиним неорганічним субстратом, слугуючи донором електрона для ЕТЛ за допомогою фермента сульфідхінонок-сидоредуктази (SQR). Електрони, вивільнені при окисненні H2S, захоплюються убихіноном і передаються по дихальному ланцюгу до комплексу III для подальшого поширення. Ця активність, ймовірно, стимулює фосфорилювання та продукцію АТФ у клітинах. Однак з підвищенням вмісту H2S інгібіторний вплив на ЕТЛ може пересилювати його стимулюючу дію до цілковитого пригнічення функціонування мітохондрій. Концентрації, які потрібні для повного інгібування цитохром-с-оксидази в різних моделях залежать від таких факторів, як тип клітини та клітинне середовище. За цих умов H2S є високоцитотоксичним, оскільки пригнічує активність ЕТЛ, знижує вміст внутрішньоклітинного АТФ, посилює генерацію АФК, індукує мітохондріальну деполяризацію та апоптоз. Крім того, у високих концентраціях він додатково інгібує вироблення АТФ за допомогою регуляції роз'єднувального білка 2 (UCP 2), який розсіює градієнт протонів і призводить до порушення синтезу АТФ. Припускають, що завдяки цим процесам клітини можуть адаптуватися до високих концентрацій H2S [8].

Відомо, що порушення ендогенного синтезу H2S супроводжують розвиток таких патологічних станів, як гіпертензія, атеросклероз, діабет, серцева недостатність, нейродегенеративні захворювання тощо. Більшість із цих станів характерні і частіше всього розвиваються у старих організмах, у яких синтез сірководню суттєво знижений [9, 10]. Таким чином, при зниженні ендогенної продукції сірководню, що спостерігається при старінні, проблема активації синтезу цього газового трансмітера та відновлення активності H^-синтезувальних ферментів набуває неабиякої актуальності. Припускаємо, що відновлення знижених концентрації H2S сприятиме посиленню мітохондріального метаболізму, збереженню їх функції, а також цитопротекції в серцево-судинній системі в цілому.

Метою нашої роботи було дослідити ефекти одноразового введення L-цистеїну старим тваринам на вміст сірководню, біохімічні показниками, що характеризують інтенсивність окисних процесів, та процес кальційіндукованого набухання мітохондрій у серці.

МЕТОДИКА

Досліди проведено на дорослих (6 міс, 220-250 г) і старих (22-24 міс, 300-350 г) щурах лінії Вістар. Тварин утримували на стандартному раціоні віварію. У кожній серії дослідів використано не менше ніж 10-12 тварин. У дослідженнях дотримувалися Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист тварин, які використовуються для експериментальних цілей (Страсбург, 1986). Тварин було поділено на три групи: I (контрольна) група - дорослі щури, II група - старі щури, III група - старі щури, яким одноразово внутрішньоочеревинно вводили розчин амінокислоти L-цистеїну у дозі 121 мг/кг за 30 хв до декапітації.

Серця, видалені з декапітованих щурів, промивали охолодженим 0,9%-м розчином KCl (4°C). Мітохондрії виділяли методом диференційного центрифугування [6]. Кінетику їх набухання оцінювали за допомогою спектрофотометричної реєстрації оптичної густини суспензії органел. Для цього органели поміщали в інкубаційне середовище ізотонічного складу (ммоль/л): KCl - 120, тріс - HCl - 25, KH2PO4 - 3; рН 7,4 (кінцевий об'єм - 3 мл) і реєстрували зниження оптичної густини суспензії мітохондрій при X = 520 нм впродовж 15 хв за наявності індуктора Са2+. Концентрація білка становила 0,4 мг/мл. Як контроль використовували суспензію мітохондрій в інкубаційному середовищі без додавання кальцію, при цьому обраховували амплітуду спонтанного (контрольного) набухання як різницю значень оптичної густини від 1-ї до 15-ї хв (A0 = ADj^/мг білка). Максимальну амплітуду вимірювали за умов активації пороутворення при дії індуктора МП - іонів кальцію (Amax = AD^/мг білка).

В ізольованих мітохондріях серця, до та після введення попередника de novo синтезу H2S, за допомогою спектрофотометра фіксували зміни вмісту ендогенного H2S та активність усіх трьох шляхів синтезу NO - індуцибельного (iNOS), конститутивного (cNOS) та неокисного реутилізаційного (нітратредуктаза) на тлі інтенсивності окисного (оксидативного) метаболізму. Вміст H2S визначали таким чином: до аліквот проб додавали 0,5 мл 1%-го розчину ацетату цинку, інкубували при 37,5°С протягом 10 хв, далі вносили 0,5 мл 20 ммоль/л розчину N,N- DPD (диметил-п-фенілендіамін) та 0,5 мл 30 ммоль/л розчину FeCl3. Після 10 хв інкубації в темряві на холоді визначали оптичну густину при X = 670 нм [11]. Активність різних ізоферментів NOS, як нітрозативної компоненти окисного стресу, Са2+-незалежної iNOS та Са2+-залежної сNOS визначали за утворенням L-цитруліну, фіксуючи оптичну густину інкубаційної суміші при X = 492 нм. Активність сNOS розраховувалася за наявності 2 ммоль/л Ca2+, iNOS - 5 ммоль/л EDTA. Активність ферментів виражалася у пікомолях новоутвореного L-цитруліну протягом 1 хв на 1 мг загального білка в пробі [12]. Метод визначення активності нітратредуктази базувався на здатності ензиму за наявності надлишку НАДН відновлювати нітрат-аніон (NO3-) до нітрит-аніона (NO2-) [13]. Аргіназну активність визначали за утворенням сечовини в інкубаційній суміші, що містила аліквоти проб та L-аргінін у тріс-НСІ-буфері (рН 7,4) [14] . Мітохондріальні пули NO2- визначали за допомогою реактиву Гріса методом Гріна [15] , NO3- - бруциновим реактивом, який додавали до безбілкової аліквоти проб та інкубували при 100°С протягом 10 хв, після чого охолоджували і вимірювали значення екстинції при X = 405 нм [16].

Інтенсивність оксидативної компоненти окисного стресу в мітохондріях серця старих щурів оцінювали за змінами пулів як одного із ранніх продуктів ПОЛ - дієнових кон'югатів (ДК), так і кінцевих - малонового діальдегіду (МДА). Методика визначення вмісту ДК включала екстракцію ліпідів зі зразків за допомогою органічних розчинників (гептан/ізопропанол 1:1) і зміни екстинції при X = 232 нм [17]. Вміст МДА в мітохондріях серця визначали, змішуючи 0,5 мл 1%-го розчину ТБК в 50 ммоль/л NaOH і 0,5 мл 2,8%-го розчину трихлороцтової з аліквотою проб. Суміш кип'ятили 20 хв на водяній бані, охолоджували, центрифугували і вимірювали величину екстинції при X = 532 нм. Вміст МДА розраховували з використанням коефіцієнта молярної екстинції 15600 моль-ьсм-1 [18]. Вміст ейкозаноїдів - тромбоксану B2 (TxB2) і лейкотрієну С4 (LTC4) визначали в спиртових екстрактах за допомогою радіоімунного методу, користуючись стандартними добірками реактивів «Amersham» (Англія). Радіоактивність проб вимірювали на лічильнику фірми «Backman» (Німеччина). Вміст сечової кислоти вимірювали в колориметричній реакції в аліквотах проб ізольованих мітохон- дрій за допомогою добірки реактивів фірми «Філісіт-Діагностика» (Дніпропетровськ, Україна). Вміст сечової кислоти в пробах розраховували за екстинцією стандартного її розчину. Концентрацію загального білка мітохондрій визначали за методом Лоурі [19].

Експериментальні результати перевіряли на нормальність розподілу за допомогою критерію Шапіро-Уілка. Їх обробляли методами варіаційної статистики з використанням програми Origin 7.0 («Microcall Inc.», США). Міжгрупові різниці між показниками визначали за допомогою критерію t Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

На рис. 1 представлено типові кінетичні криві зміни оптичної густини суспензії мітохондрій серця дорослих щурів у середовищі без кальцію та при додаванні цього універсального активатора МП у концентрації 10-4 моль/л, а також у старих щурів за умов одноразового введення попередника ендогенного синтезу сірководню амінокислоти L-цистеїну. Показано, що кінетичні криві мали нелінійний характер з виходом на плато, що свідчить про обмеження процесу набухання мітохондрій. Слід відзначити, що у фазі, коли набухання сягало постійних значень оптичної густини, встановлювався рівноважний стан, за якого відкривання неспецифічних пор було максимальним. За зміною оптичної густини було обчислено амплітуди спонтанного чи контрольного (Ас) та кальційзалежного (Amax) набухання мітохондрій. Значення контрольного набухання в перерахунок на вміст білка для дорослих, старих щурів, а також із введенням L-цистеїну старим тваринам становило 0,17 ± 0,005; 0,28 ± 0,011 і 0,22 ± 0,008 од. екст./мг білка відповідно; при цьому максимальні значення набухання органел, що включають в себе як пасивну, так кальційзалежну його компоненти, становили 0,43 ± 0,012; 0,56 ± 0,016 і 0,47 ± 0,009 од. екст./мг білка відповідно для трьох вищезазначених груп тварин. Отже, додавання розчину CaCl2 до мітохондрій серця щурів, що інкубували в середовищі за наявності неорганічного фосфату (Pi) і енергізованих окисненням сукцинату, призводило до істотного зниження оптичної густини і обрахованої Amax суспензії мітохондрій старих щурів порівняно з дорослими і характеризувалося як високоамплітудне. Графіки залежності оптичної густини від часу інкубації мітохондрій серця старих щурів при впливі L-цистеїну відрізнялися: зменшувалося набухання мітохондрій як у безкальцієвому середовищі, так і за умов дії цього індуктора, що свідчило про мітопротективні ефекти амінокислоти.

Отримані результати узгоджуються з літературними джерелами, які свідчать про формування за наявності Pi Са2+-залежної МП у мембранах органел серця тварин. МП є мультибілковим комплексом, який пронизує внутрішню мембрану мітохондрій, і утворюється як за фізіологічних, так і патологічних умов. Цей комплекс складається зі структурних каналоутворювальних і регуляторних білків. Нещодавно було виявлено, що F1F0 АТФ-синтаза може бути внутрішньомембранною пороутворювальною субодиницею МП [20]. Отже, ми показали, що попередник ендогенного синтезу сірководню L-цистеїн запобігав збільшеному спонтанному і Са+2-індукованому набуханню мітохондрій, що свідчить про запобігання пороутворенню у серці при старінні.

Для встановлення можливих біохімічних механізмів впливу L-цистеїну на рівні мітохондрій були проведені дослідження пулів H2S та показників оксидативного стресу в органелах серця щурів при старінні. У мітохондріях серця дорослих і старих щурів визначили базальний вміст ендогенно синтезованого сірководню, який становив 4,48 ± 0,44 та 2,35 ± 0,25 нмоль/мг білка відповідно (рис. 2), що свідчило про його зниження (в 1,91 раза, P < 0,05) при старінні. У разі введення старим щурам L-цистеїну, як субстрату системи мітохондріальних H^-синтезувальних ферментів, виявили зростання пулів H2S у мітохондріях серця до 6,02 ± 0,74 нмоль/мг білка, що було в 2,56 раза (P < 0,05) більше порівняно зі значеннями у старих тварин. Отже, нами доведено, що в мітохондріях, які є місцем як синтезу сірководню, так і його деградації, пригнічується ендогенний синтез H2S при старінні, можливо при цьому активується процес деградації (окиснення до іонів сульфату в органелах ферментом сульфі- токсидазою). Інтенсифікація останнього процесу в мітохондріях серця старих щурів може бути як спосіб адаптивного використання додаткового джерела енергії (синтезу АТФ) за рахунок процесів послідовного окиснен- ня ендогенних пулів H2S мітохондріальною сульфітоксидазою на кінцевому етапі його біосинтезу. Таким чином, після одноразового введення старим щурам попередника de novo синтезу H2S L-цистеїну спостерігали відновлення внутрішньомітохондріальних пулів H2S. Отже, серце є важливим джерелом утворення ендогенного H2S, який може впливати, зокрема, і на функціонування мітохондрій, попереджуючи відкривання МП.

Таблиця 1

Активація різних шляхів синтезу NO в мітохондріях серця старих щурів за дії L-цистеїну (121 мг/кг; M ± m)

Примітка тут і в табл. 2: *Р < 0,05 відносно значень у дорослих тварин; **Р < 0,05 відносно значень у старих щурів.

Рис. 1. Динаміка набухання мітохондрій серця дорослих (а) і старих (б) щурів: 1 - у середовищі без кальцію; 2 - при дії Са2+ (10-4 моль/л); 3, 4 - за умов введення in vivo попередника синтезу сірководню L-цистеїну старим тваринам без та за дії кальцію відповідно

Рис. 2. Вміст сірководню у мітохондріях серця дорослих (1) та старих (2) щурів, а також при введенні in vivo попередника синтезу сірководню L-цистеїну (3) старим тваринам. *Р < 0,05 відносно значень у дорослих тварин, **Р < 0,05 відносно значень у старих тварин

Як видно із табл. 1, у мітохондріях серця старих щурів пригнічувався у 3,18 раза (P < 0,05) конститутивний синтез NO кальційзалежними ізоферментами cNOS на тлі суттєвого підвищення (у 7,63 раза, P < 0,05) активності більш потужного індуцибельного синтезу NO ізоферментом iNOS порівняно з контролем. Отже, значне підвищення продукції оксиду азоту відбувалася внаслідок надмірної активності iNOS, а не сNOS. За цих умов надлишковий NO при одночасній гене-

рації з супероксидним радикалом (Ю2-) може призводити до утворення пероксинітриту (ONOO-) з подальшою активацією нітрозативного стресу, що водночас з посиленням окисного метаболізму є причиною суттєвих пошкоджень мітохондрій, а саме відкривання МП та ініціацією апоптозу кардіоміоцитів у серці старих щурів. При введенні старим тваринам L-цистеїну не відбувалося достовірного підвищення конститутивного синтезу NO, натомість активність індуцибельного у 1,73 раза (P < 0,05) пригнічувалася (див. табл. 1).

При старінні в мітохондріях серця щурів також значно активувався як реутилізаційний шлях синтезу NO (у 5,61 раза, P < 0,05) внаслідок підвищення активності першого ерменту двоетапного відновлення основного стабільного метаболіту NO - нітрату нітрат- і нітрит-редуктазами, так і неокис- ний процес метаболізму L-аргініну, про що свідчить підвищення в 7,07 раза (P < 0,05) активності аргінази ІІ порівняно зі значеннями у контрольних дорослих тварин (див. табл. 1). L-цистеїн вдвічі знижував активності як мітохондріальної нітратредуктази, так і аргінази ІІ - ферменту метаболізму/ деградації L-аргініну, що є також субстратом для синтезу NO (див. табл. 1).

NO2- і NO3- - це стабільні продукти метаболізму оксиду азоту. При цьому NO2- є маркером доступності кисню для спонтанного неферментативного окиснення NO, а NO3- - показник утворення і розпаду пероксинітриту. Ми показали, що в мітохон- дріях серця при старінні знижувалися у 1,86 раза пули NO2- порівняно зі значеннями у дорослих тварин (з 246,76 ± 31,6 до 132,40 ± 12,7 пмоль/мг білка), однак пули NO3- (92,8 ± 10,2 пмоль/мг білка) достовірно не змінювалися порівняно з контролем (68,86 ± 15,53 пмоль/мг білка). Досліджуваний попередник синтезу H2S не змінював пули стабільних метаболітів NO2- та NO3-.

Як видно із табл. 2, при старінні в мітохондріях серця щурів розвивається оксидативний стрес. На це вказує підвищений вміст сечової кислоти і ейкозаноїдів - LTC4 та TxB2, що є маркерами утворення О2- відповідними оксидазами - ксантиноксидазою, ліпоксигеназою та циклооксигеназою. Введення старим щурам L-цистеїну достовірно знижувало пули сечової кислоти (в 1,5 раза) у мітохондріях серця, що є доказом ефективного інгібування генерації *О2-.

Таблиця 2. Вміст маркерів різних шляхів генерації супероксидного радикала та продуктів перекисного окиснення ліпідів у мітохондріях серця старих щурів за дії L-цистеїну (121 мг/кг; M ± m)