Особливості формування імунної відповіді на термічну травму

Размещено на http://www.allbest.ru/

Особливості формування імунної відповіді на термічну травму

О.М. Линник1,2, О.І. Осадча2, Г.П. Козинець1,2,

І.Р. Янчій3, О.О. Шматова2, Г.М. Боярська2

1Національний університет охорони здоров'я України

імені П.Л. Шупика, Київ;

2ДУ «Інститут гематології та трансфузіологіїНАМН України», Київ

3«Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка НАМН України», Київ;

Для вивчення впливу термічної травми на формування імунної відповіді обстежено 43 пацієнти віком від 16 до 58 років з опіками площею ураження 20-60% поверхні тіла. Визначали функціональну активність нейтрофільних гранулоцитів (НГ) та моноцитів, вміст мієлопероксидази та речовин з позитивною реакцією на періодичну кислоту Шиффа (ШИК-речовин), вміст цитокінів: інтерлейкін-lЯ (ІЛ-lЯ), ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, фактор некрозу пухлин а (ФНП-а). Термічні ушкодження викликали зміни імунної відповіді, котрі характеризувалися прозапальною фазою, при якій клітини вродженого імунітету (НГ, моноцити) набували високої функціональної активності, виробляючи більший вміст прозапальних цитокінів: на 2-3-тю добу після опікової травми в периферичній крові вміст (ІЛ-lЯ становив 133,5 ± 21,1 пг/мл, ФНП-а - 265 ± 115,5 пг/мл, що перевищувало контрольні значення у 5,1 та 10,9 раза відповідно. Вміст ІЛ-6 на 2-3-тю добу сягав 85,30 ± 13,10 пг/мл. Водночас розвивався супутній синдром компенсаторної протизапальної відповіді зі збільшенням продукції протизапального ІЛ-4 (268,5 пг/мл), перевищуючи контрольні значення у 8,2раза, а вміст протизапального ІЛ-10 знизився. Це свідчить про те, що протизапальні цитокіни не компенсують високий вміст прозапальних факторів. На 7-8-му добу після опікової травми спостерігалася тенденція до подальшого підвищення вмісту прозапальних цитокінів ІЛ-Д та ФНП-а до 148,0 ± 27,0 та 281,2 ± 146,7 пг/мл відповідно, водночас вміст ІЛ-6 сягав 131,0 ± 11,1 пг/мл, протизапального цитокіну ІЛ-10 підвищився незначно, а ІЛ-4 знизився. Зазначені зміни у динаміці розвитку раннього періоду опікової хвороби, а також зниження активності мієлопероксидази та ШИК-позитивних речовин НГ свідчать про функціональний дефіцит НГ, зниження їх ферментативної активності та декомпенсацію енергетичних ресурсів клітин, клінічно можуть призводити до прогресування синдрому системної запальної відповіді та розвитку поліорганної дисфункції.

Ключові слова: термічна травма; імунологічна реактивність; синдром системної запальної відповіді; компенсаторний протизапальний синдром; цитокіни.

FEATURES OF THE IMMUNE RESPONSE FORMATION TO THERMAL TRAUMA

M. Lynnyk1,2, O.I. Osadcha2, H.P. Kozynets1,2,

R. Yanchiy3, O.O. Shmatova2, G.M. Boiarska2

1 Shupyk National Healthcare University of Ukraine, Kyiv, Ukraine;

2Institute of Haematology and Transfusiology of NAMS of Ukraine, Kyiv, Ukraine;

3Komisarenko Institute of Endocrinology and Metabolism of Ukraine, Kyiv, Ukraine

To study the effect of thermal trauma on the immune response formation, 43 patients aged 16 to 58 with body surface area of burns 20-60% were examined. The neutrophilic granulocytes (NG) and monocytes functional activity, the content of myeloperoxidase and substances with a positive reaction to Schiff's periodic acid (PAS- stained substances), the cytokines content were determined: interleukin-1Я (IL- 1Я), IL-2, IL-4, IL- 6, tumor necrosis factor-а (TNF-a). Thermal damage caused changes in the immune response, which were characterized by a pro-inflammatory phase in which innate immunity cells (neutrophilic granulocytes, monocytes) acquired high functional activity, producing a higher content of proinflammatory cytokines. On the 2-3rd day after the burn injury in the peripheral blood, the interleukin-1Я (IL-1Я) content was 133.5 ± 21.1 pg/ml, the tumor necrosis factor а (TNF-а) content was 265 ± 115.5 pg/ml, which exceeded the reference values by 5.1 and 10.9 times, respectively. The content of IL-6 on the 2-3rd day was 85.30 ± 13.10 pg/ml. Also a concomitant syndrome of compensatory anti-inflammatory response developed with increasing production of anti-inflammatory IL-4: on the 2-3rd day after burn injury, its content was 268.5 pg/ml, exceeding the reference values by 8.2 times. The content of anti-inflammatory IL-10 was decreased. This suggests that anti-inflammatory cytokines do not compensate for the high content of pro-inflammatory factors. On the 7th-8th day after the burn injury, there was a tendency to further increase the content of pro-inflammatory cytokines IL- 1Я and TNF-а to 148.0 ± 27.0, and 281.2 ± 146.7 pg/ml, respectively, while the content of IL-6 on the 7-8th day was 131.0 ± 11.1 pg/ml, the anti-inflammatory cytokine IL-10 increased slightly, and the content of IL-4 decreased. These changes in the early period of burn disease dynamics, as well as reduced activity of myeloperoxidase and PAS-stained substances NG, point for a functional deficiency of NG, reduced enzymatic activity and cells energy resources decompensation. These changes could clinically lead to SIRS progression and multiorgan dysfunction.

Key words: thermal trauma; immunological reactivity; systemic inflammatory response syndrome; compensatory anti-inflammatory response; cytokines.

ВСТУП

імунний термічна травма

За даними Всесвітньої організації охорони здоров'я (ВООЗ), щорічно майже 11 млн людей у всьому світі потребують медичної допомоги через опікову травму [1]. Термічні ушкодження викликають зміни імунної відповіді, які зазвичай характеризуються прозапальною фазою (клітини-ефектори вродженого імунітету), названою синдромом системної запальної відповіді (SIRS), а також супутнім протизапальним каскадом (активатори адаптивного імунітету Т- та В-лімфоцити), так званим синдромом компенсаторної протизапальної відповіді (CARS). Прозапальна відповідь регулюється вродженою імунною системою, зокрема нейтрофільними гранулоцитами (НГ) та моноцитами, при цьому протизапальна - адаптивною імунною системою - лімфоцитами та природними кілерами.

Для виявлення патогенної інвазії вроджена імунна система використовує два способи: першим є розпізнавання чужорідних для організму молекулярних структур інфекційного походження, так звані патогенасоційовані молекулярні патерни (англ. pathogen-associated molecular pattern - PAMP) - це мікробні полісахариди, токсини, нуклеїнові кислоти, протеїни тощо. Другий спосіб - розпізнавання ендогенних факторів, що виникають у відповідь на інфекцію або інший клітинний дистрес (наприклад, порушення іонного балансу клітини, некротична загибель власних клітин) - дистресасоційованих молекулярних патернів (англ. damage-associated molecular pattern - DAMP), до яких відносяться позаклітинні нуклеотиди або протеїни теплового шоку, кристали сечової кислоти, продукти некрозу та апоптозу та інші маркери пошкодження клітин і тканин, так звані аларміни [2].

У розпізнанні PAMP і DAMP беруть участь патернрозпізнавальні рецептори (англ. pattern-recognition receptors, PRR), зокрема Toll-подібні (англ. Toll-like receptors, TLR), які забезпечують індивідуалізовану реакцію вродженої імунної системи на різні типи інфекцій та ушкодження. На клітинному рівні TLR широко експресовані на структурних клітинах (епітеліальних, фібробластах, ендотеліальних) і на імунних клітинах - моноцитах, макрофагах, НГ, антигенпрезентуючих дендритних клітинах, природних кілерах (NK-гранулярні лімфоцити периферичної крові і лімфоїдних органів) і меншою мірою на еозинофілах, лімфоцитах [3].

Захисна запальна реакція після взаємодії PRR з PAMP або DAMP активується різноманітними механізмами, що призводять до локального виділення медіаторів запалення. Одним з механізмів формування вродженої прозапальної відповіді є активація інфламасом. Останні - це цитозольні макромолекулярні комплекси на основі протеїнів, утворення яких у клітині індукується дією PAMP або DAMP на групу PRR. В інфламасомах відбувається активація внутрішньоклітинної прокаспази-1, яка ініціює дозрівання таких специфічних цитокінів, як інтерлейкін-lЯ (ІЛ-lЯ,) ІЛ-18 або фактор некрозу пухлин а (ФНП-а), для модуляції і посилення захисної здатності вродженого імунітету [4, 5].

Ушкодження тканин при опіковій травмі зумовлює значний викид активних речовин та медіаторів запалення - алармінів. Останні взаємодіють з клітинами природної резистентності та активують реакції вродженого імунітету. Aларміни стимулюють TLR, які ініціюють активацію внут-рішньоклітинних сигнальних шляхів, у результаті чого відбувається експресія генів цитокінів (ФНП-а, ІЛ-1, ІЛ-6, ІЛ-12, інтерферон а/Я та інших) у відповідь на пошкодження. Експресія ІЛ-1 та ФНП-а найбільшою мірою виражена в моноцитах, тканинних макрофагах і дендритних клітинах, В-лімфоцитах, природних кілерах та епітеліальних клітинах [6, 7]. Свій вплив на набутий імунітет PRR реалізують за допомогою дендритних клітин, функцією яких є індукція та регуляція Т-клітинної відповіді.

Загальний процес фагоцитозу здійснюється НГ, основною функцією яких є ініціація запальної реакції. Біологічно активні речовини, які ініціюються НГ, завжди мають прозапальну спрямованість, працюють в осередках гострого запалення (ІЛ-1, ФНП-а) і беруть участь у регуляторному ланцюзі взаємодій при запаленні (ІЛ-6, у-інтерферон, трансформаторний ростовий фактор) [8]. Мієлопероксидаза - важлива складова частина антимікробної активності фагоцитів, що забезпечує вроджений неспецифічний імунітет [9].

Мета нашої роботи - визначити особливості формування імунної відповіді при термічній травмі у пацієнтів з опіками в гострому періоді хвороби.

МЕТОДИКА

Обстеженими були 43 пацієнти віком від 16 до 58 років з опіками, площа ураження - 20-60% поверхні тіла. Хворі знаходилися на лікуванні КНП «Київська міська клінічна лікарня N° 2» протягом 2016-2018 рр. Обстежені підписали інформовані згоди, в яких передбачені заходи з дотримання принципів медичної етики та безпеки для здоров'я пацієнта, його прав, людської гідності та морально-етичних норм відповідно до принципу Гельсінської декларації прав людини, Конвенції Ради Європи про права людини і біомедицини та Законів України.

У ранньому післяшоковому періоді на 2-3- тю добу та на стадії опікової токсемії на 8-10- ту добу після травми визначали функціональну активність НГ та моноцитів у тесті відновлення нітросинього тетразолію (НСТ-тест) спонтанному та індукованому ліпополісахаридом E. coli (ЛПС), вміст мієлопероксидази та ШИК- позитивних речовин (речовини з позитивною реакцією на періодичну кислоту Шиффа, PAS-речовини) [10, 11]. Вміст цитокінів ІЛ-lЯ, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ФНП-а) визначали з використанням сертифікованих в Україні тест-систем виробництва ТОВ «Протеїновий контур» (ProCon) [12, 13] за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА) на імуноферментному аналізаторі PR 1200 фірми «Sanofi Diagnostics Pasteur» (Франція) згідно з інструкцією фірми виробника.

Результати представлені як середні значення ± стандартні відхилення. Статистичну їх обробку проведено за допомогою структурного та порівняльного аналізу з використанням комп'ютерних програм Microsoft Excel, Statistica 64 та Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health. Результати обробляли з застосуванням методу варіаційної статистики за критерієм t Стьюдента для вибірок з нормальним розподілом з обчисленням показника довірчої ймовірності P (параметричний критерій).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У пацієнтів при розвитку опікового шоку значно збільшилася функціональна активність НГ у спонтанному НСТ-тесті (табл. 1). У ранньому післяшоковому періоді (2-3-тя доба) після травми знижувалась активність мієлопероксидази у периферичній крові на 18,13% відносно контрольних значень. Водночас вміст ШИК-позитивних речовин (маркер кількості глікогену, що відіграє важливу роль в енергетичному метаболізмі НГ [14]) не змінювався, а надалі мав тенденцію до зниження, що характеризує декомпенсацію енергетичних ресурсів клітин.

Стадія токсемії визначалася значним підвищенням значень спонтанного НСТ- тесту відносно контрольних та тенденцією до зниження порівняно з вихідними результатами у ранньому післяшоковому періоді. Зміни активності НГ у НСТ-тесті свідчать про високий ступінь функціональної активації фагоцитуючих клітин. При цьому зниження активності мієлопероксидази та вмісту ШИК- позитивних речовин у НГ є підтвердженням функціонального дефіциту їх ферментативної та енергетичної активності.

Таблиця 1. Показники стану нейтрофільних гранулоцитів у пацієнтів з опіками (М ± m, n = 20)

Примітка (тут і в табл. 2 і 3): P* - відносно контрольних значень, P** - відносно значень на 2-3-тю добу

Фагоцитоз в організмі здійснюють макрофаги [15]. Макрофаги фенотипу М1 є ефекторними клітинами, інтегрованими в імунну відповідь Т-хелперів 1-го типу (Тх1), здатними руйнувати мікроби і клітини новоутворень. Вони ж можуть продукувати надмірну кількість прозапальних цитокінів [16]. Макрофаги фенотипу M2, асоційовані з імунною відповіддю T-хелперів 2-го типу (Тх2), навпаки, обмежують запальну реакцію. Макрофаги обох фенотипів часто наявні в тканинах одночасно, відрізняючись набором медіаторів і маркерів, що секретуються ними.

При термічному ураженні нами встановлене підвищення функціональної активності макрофагів за наявності бактеріальних антигенів протягом усього терміну дослідження (табл. 2). Рівень функціональної активності пов'язаний з діяльністю макрофагів-резидентів. З них формується первинний бар'єр, що захищає організм від інфекції або шкідливих макромолекулярних комплексів. Разом з макрофагами-резидентами в антимікробній резистентності беруть участь макрофаги «запальні», які постійно надходять з вільного пулу, а їх функціональна активність щодо мікробних антигенів значно вища. Активовані моноцити фагоцитують і обробляють бактерії і інші чужорідні частинки для презентації антигена за допомогою навантаження і експресії на молекулах класу II головного комплексу гістосумісності мононуклеарної системи, включаючи людський лейкоцитарний антиген (HLA)-DR. Ці маркери клітинної поверхні можуть потім зв'язуватися з рецепторами Т-клітин, щоб брати участь в активації лімфоцитів. Висока функціональна активність НГ та моноцитів/макрофагів свідчить про розвиток прозапальної реакції на травму, що відіграє значну роль в антимікробному захисті. Оперативні втручання в ранньому періоді опікової травми являють собою додаткову травму [17] з утворенням дистресасоційованих молекулярних патернів (DAMP), таким чином викликаючи надмірне запалення у вигляді так званої реакції з «двома ударами». Травматичне ушкодження може викликати в організмі постраждалого такий вплив, що більш пізня незначна запальна реакція значно посилює системну запальну відповідь.

Показники функціональної активності нейтрофільних гранулоцитів та макрофагів у спонтанному та індукованому НСТ-тестах: I - спонтанний, нейтрофільні гранулоцити, II - індукований, нейтрофільні гранулоцити, III - спонтанний, макрофаги, IV - індукований, макрофаги. 1 - 2-3-тя доба, 2 - 7-8-ма доба, 3 - контрольні значення

Таблиця 2. Показники стану моноцитів у пацієнтів з опіками (М ± m, n = 20)

Протизапальні реакції, які контролюють ефекторні клітини адаптивного імунітету (Т-лімфоцити), діють як компенсаторна відповідь на запалення, викликане опіковою травмою. Лімфоцити є клітинними елементами адаптивної імунної відповіді. Зміни їхньої реакції після термічної травми пов'язані з підвищеним ризиком розвитку ускладнень у пацієнтів з опіками [18, 19]. При опіковій травмі знижується функціональна активність лімфоцитів [20]. Вміст імуноглобулінів G сироватки зменшується відразу після термічного пошкодження, що може бути пов'язано з більш низькою активністю В-лімфоцитів і плазматичних клітин [21]. CD4+ Т-клітини можна поділити на Т-хелпери (Th-клітини) і регуляторні Т-клітини. Є багато підтипів Т-хелперів, включаючи Th1 і Th2. Після термічного пошкодження переважає фенотип Th2 з підвищеними концентраціями ІЛ-4, ІЛ-2 і зменшенням продукції у-інтерферону [22]. Т-клітини можуть регулювати свою активність внаслідок синтезу ІЛ-10, ІЛ-2, ІЛ-6 і трансформуючого фактора росту Я, які інгібують проліферацію Т-клітин і продукцію цитокінів або безпосередньо, або через інші цитокіни [23].

Таблиця 3. Вміст (пг/мл) про- та протизапальних цитокінів у периферичній крові пацієнтів з опіками (M ± m, n = 20)