Зміни вмісту імунних клітин, які містять FcR III рецептор в селезінці та головному мозку після експериментальної ЧМТ

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЗМІНИ ВМІСТУ ІМУННИХ КЛІТИН, ЯКІ МІСТЯТЬ FCR III РЕЦЕПТОР В СЕЛЕЗІНЦІ ТА ГОЛОВНОМУ МОЗКУ ПІСЛЯ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ЧМТ

Лісяний М.І., Паламарьова А.В., Бєльська Л.М., Потапова А.Г.

ДУ «Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова НАМН України, відділ нейроімунології

При ЧМТ виникають порушення в діяльності імунної системи, що може ускладнювати регенеративні та репаративні відповідні реакції в головному мозку [1-3].

Важливу роль в імунопатогенезі ЧМТ відіграють цитотоксичні лімфоцити, моноцити, нейтрофіли, які можуть визивати післятравматичне запалення та ушкодження нейронів [3,4]. Однією із характеристик цих різних імунних клітин є експресія на них Fc рецептора III типу, відомого як CD-16 рецептор [5,6]. У людей CD-16 рецептор існує у 2-х формах: FcR III a (CD-16a) та FcR III b, які відносяться до молекул супер сімейства імуноглобулінів [6].

Показано, що FcR III a експресується на натуральних кілерних клітинах, макрофагах та тучних клітинах, тоді як FcR III b виявляють, в основному, на нейтрофілах [7]. Обидва рецептори разом приймають участь у різних імунних реакціях, таких як деградація базофілів та тучних клітин, фагоцитозі та окислювальному вибуху нейтрофілів, прямій та антитіло опосередкованій цитотоксичності моноцитів та натуральних кілерів [6,8]. Імунні клітини, які експресують CD-16 рецептор, приймають участь у знищенні вірусно інфікованих та ракових клітин, навіть без участі антитіл [9]. Крім того, клітини, які мають CD-16 рецептор, здатні індукувати синтез прозапальних цитокінів, таких як інтерферон у (ІНФ-у) та пухлинно-некротичний фактор (ПНФ), а також індукувати синтез рецептора ІЛ-2, який важливий для активації Т-клітин [8,9]. CD-16 широко використовується для ідентифікації різних типів імунних клітин, таких як натуральні кілерні клітини, нейтрофіли, моноцити, мієлоїдні, супресорні клітини [6,9,10]. На нейтрофілах та інших фагоцитуючих клітинах можлива висока та низька експресія CD-16, зрілі нейтрофіли мають високий рівень експресії CD-16, а попередники нейтрофілів, юні нейтрофіли, мають низький рівень експресії [9,10]. CD-16 клітини визначають за допомогою моноклональних антитіл і досить широко вивчають ці клітини при пухлинних, вірусних захворюваннях [6,7,11]. В той же час рівень цих клітин ще не достатньо широко досліджений при ЧМТ в людини та експерименті на тваринах, тому метою роботи було вивчення вмісту CD-16 клітин в селезінці та паренхімі головного мозку при різних термінах після ЧМТ у щурів та при корекції виниклих порушень в їх складі імуномоделюючим препаратом галавітом, який має здатність гальмувати запальні та імунопатологічні процеси в організмі[12,13].

Матеріали та методи. В роботі використані експериментальні тварини: статевозрілі щури розведення віварію ДУ «ІНХ НАМН»). Усі роботи з експериментальними тваринами проводили з дотриманням законодавчих норм та вимог Закону України №3447 IV “Про захист тварин від жорстокого поводження», «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для дослідних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1986), з урахуванням принципів біоетики та норм біологічної безпеки. Тварин утримували у стандартних умовах віварію, знеболення перед травмой проводили кетаміном 70 мг/кг та ксалазином 15 мг/кг, а евтаназію визивали наркозом за допомогою етилового ефіру в закритому ексикаторі.

Моделювання ЧМТ у щурів. Черепно-мозкова травма у тварин моделювалась шляхом падіння грузу вагою 100 г з висоти 120 см на голову щурів, що були занаркотизовані внутрішньочеревно 0,5 мл розчину кетаміну 70 мг/кг та ксалазину 15 мг/кг і знаходились в стані наркотичного сну, який тримався до 30 хв. Голову тварин розташовували під пластиковою вертикальною трубою діаметром 2,5 см, висотою 120 см таким чином, щоб удар (контакт) падаючого вантажу приходився на ліву півкулю в області тім'яної та потиличної долі головного мозку.

Після отримання травми у тварин рефлекторно відбувалась затримка дихання на кілька секунд, яке потім відновлювалось до звичайного ритму. Судом та інших порушень або виділення сечі та калу у тварин не було. Через 20-30 хв тварини виходили із наркозу і починали ворушитися та рухатись по клітці. Потім вони знаходились на звичному режимі утримання та харчування. Через 1, 5, 10 діб тварин з ЧМТ та контрольних інтактних щурів умертвляли ефірним наркозом та забирали селезінку та головний мозок.

Для корекції виникаючих порушень використовували імуномодулюючий препарат галавіт в дозі 2 мг/кг ваги тварин в обємі 0,5 мл, що вводили внутрішньом'язово тваринам на 2, 3, 4 добу після травми.

Відомо, що галавіт має імуномодулюючі та протизапальні властивості, його основні ефекти обумовлені здатністю діяти на функціональну та метаболічну активність макрофагів та нейтрофілів. Препарат на 6-8 годин блокує синтез цитокінів, активних форм кисню, гальмує запальну реакцію та зменшує інтоксикацію організму.

Отримання суспензії спленоцитів та клітин мікроглії та інфільтруючих імунних клітин головного мозку

Єелезінку та ліву та праву півкулі головного мозку гомогенізували в 5,0 мл середовища 199 та підраховували в камері Горяєва з 3% оцтовою кислотою, готували суспензії, які містили 10,0х10⁶ клітин на 1 мл середовища 199.

Мікроглію та інфільтруючі ЦНС моноцити виділяли з тканини мозку щурів в ступінчастому градієнті перколла за методом Sedgwick J. у спі- вавт. [14].

Мікроглія (OX1low) у дорослих інтактних тварин при цьому методі виділення становить 82,9% від загального числа виділених клітин, що було показано авторами методики [14] тестуванням цитофлуорометричним аналізом з використанням моноклональних антитіл щурів. Після отримання клітини відмивали від залишків перколла в CMF буфері, ресуспендували в середовищі Ігла, підраховували в розчині трипанового синього та 3% оцтової кислоти і використовували в подальших дослідженнях.

Визначення рівня С0-16 клітин в суспензіях селезінки та мікроглії проводили на проточному цитометрі за допомогою моноклональних антитіл проти С0-16 рецептора фірми BD Biosciences згідно інструкції до антитіл та методичних рекомендацій. Пинегіна Б.В. і ін. (2001) [15].

Статистичну обробку матеріалів проводили за програмою статобробки для Microsoft excel 2007 р. з визначенням середнього арифметичного і стандартного статистичного відхилення (m ± о) і показника t-Стьюдента. Статистично значущими вважали відмінності при p < 0,05.

Результати. Визначення рівня CD-16 клітин в селезінці виявило, що уже через 24 години після травми відбувається вірогідне зниження майже в 1,5 рази рівня CD-16 клітин в селезінці (табл.1), яке зберігається в подальші терміни на 5 та 10 добу. Це свідчить про вихід цих клітин з селезінки, яка є вторинним імунним органом і служить депо для різних імунних клітин. При проведенні імунокорекції галалітом в дозі 2,0 мг/кг в об'ємі 0,5 мл протягом 1, 2, 3 днів після ЧМТ, було встановлено, що на 5 добу кількість CD-16 клітин в селезінці, вірогідно, ще більше зменшується порівняно з нелікованими тваринами. На 10 добу дещо підвищується вміст CD-16 клітин в селезінці до рівня клітин, які виявляються при нелікованій ЧМТ у цей термін.

Таблиця 1

Рівень CD-16 клітин в селезінці при ЧМТ та лікуванні галавітом

Примітка: * - вірогідні відмінності в порівнянні з групою контролю (Р<0,05) ** - вірогідні відмінності в порівнянні з нелікованими тваринами.

Отже, проведеними дослідженнями виявлено, що при ЧМТ в селезінці суттєво зменшується кількість CD-16 клітин, і це може бути пов'язано як із міграцією їх в зону ушкодження, так і гальмуванням їх продукції імуносупресорними чинниками, які виникають при ЧМТ [1,4]. Використання прозапального імуномодулятора галавіту в ранні терміни визиває подальше гальмування вмісту CD-16 клітин на 5 добу, але ця дія була короткочасна і уже на 10 добу не виявилась різниця концентрацій цих клітин у лікованих та не лікованих тварин.

При дослідженні рівня CD-16 клітин у фракціях мікрогліальних та фагоцитарних клітин, виділених із мозку, було виявлено, що в обох півкулях мозку міститься вірогідно збільшена кількість цих клітин на 5 добу (табл.2). На 10 добу після ЧМТ рівень CD-16 клітин зменшувався і практично був на рівні контролю. Різниці у вмісту CD-16 клітин в лівій та правій півкулі не було виявлено як на 5, так і на 10 добуі Другим важливим фактором є те, що уже на 10 добу після такої травми рівень CD-16 клітин наближається до концентрації як і у здорових тварин, тобто уже на цей термін завершуються основні запальні процеси в головному мозку і відсоток клітин знижується до показників інтактних тварин.

Таблиця 2 Рівень CD-16 клітин у фракціях мікрогліальних клітин головного мозку при ЧМТ та лікуванні галалітом

Примітка: * - вірогідні відмінності в порівнянні з групою контролю (Р<0,05) ** - вірогідні відмінності в порівнянні з нелікованими тваринами.

При проведенні імунокорекції галалітом тварин з ЧМТ виявлено, що на 5 добу кількість CD-16 клітин у фракціях мікрогліальних клітин головного мозку була така, як ті, які не отримували цей препарат, лише в правій півкулі містилось CD-16 клітин дещо менше, ніж у лівій. При дослідженні на 10 добу було встановлено, що рівень цих клітин у фракціях мікроглії був достовірно збільшений порівняно з нелікованими та з контрольними тваринами.

Обговорення результатів

Отже, проведеними дослідженнями встановлено, що при ЧМТ у щурів відбуваються зміни в складі CD-16 позитивних клітин, а саме: в ранні строки на 1-5 добу визначається зниження рівня цих клітин в селезінці і підвищення в головному мозку.

Підвищення вмісту CD-16 клітин в головному мозку спостерігається у фракціях, які виділялись на перколі і містили, в основному, мікрогліальні та фагоцитуючі клітини. Цим клітинам, особливо мікрогліальним, приділяється основна роль в механізмі запалення, пошкодження нейронів, видалення клітинного дебрісу, процесів регенерації та відновлення [3, 4, 7].

Встановлений перерозподіл CD-16 клітин при ЧМТ із вторинного імунного органу селезінки в зону пошкодження, вказує на участь в імунопатогенезі ЧМТ клітин системного імунітету, природа цих клітин може бути різною: це і цитотоксичні лімфоцити, нейтрофіли, кілерні клітини, які, як відмічалось раніше, експресують FcR III рецептор [4,6,11]. Накопичення в паренхімі головного мозку CD-16 клітин можна віднести до фракції нейтрофільних клітин, а можливо, і самі мікрогліальні клітини також мають цей рецептор, тому що у інтактних тварин, виділених на перколі, у фракціях клітин міститься до 20% таких клітин [14].

Проведена імунокорекція імуномоделюю- чим галалітом на 2-4 добу після ЧМТ, підсилює міграцію CD-16 клітин із селезінки на 5 добу, а також сприяє затримці в головному мозку на 10 добу CD-16 клітин, тоді як у не лікованих тварин уже в цей строк рівень CD-16 клітин уже зменшується до норми. Отже, можна припустити, що галавіт впливає на міграцію та розподіл CD-16 клітин в мозку при ЧМТ. На 5-10 добу після ЧМТ отримані результати дозволяють думати, що збільшення на 10 добу кількості CD-16 клітин у головному мозку сприяє більш кращому відновленню та регенерації пошкодженого при травмі мозку [3,4].

Проведеними дослідженнями не встановлено суттєвої відмінності у кількості CD-16 клітин в лівій та правій півкулі, що може свідчити, що при цій моделі ЧМТ пошкоджуються обидві півкулі мозку, куди спрямовуються різні імунні клітини, в тому числі і ті, що мають FcR III рецептор для імуноглобулінів.

Висновки

При легкій ЧМТ у щурів в селезінці на 2-5 добу зменшується кількість CD-16 клітин, що містять FcR III рецептор, а у фракціях мікрогліальних клітин, які отримали із суспензії клітин головного мозку, збільшується кількість цих клітин.

На 10 добу після ЧМТ вміст в селезінці CD-16 клітин залишається знижений, тоді як у фракціях мікроглії, їх кількість повертається до рівня, який притаманний інтактним тваринам.

Галавіт - препарат із імуномоделюючими властивостями, практично не впливає на знижений рівень CD-16 клітин в селезінці та стимулює їх накопичення в головному мозку на 10 добу після ЧМТ, що може свідчити про позитивну стимулюючу дію цього препарату на імунні клітини, які приймають активну участь в імунних процесах при ЧМТ.

ЛІТЕРАТУРА

1. Ромоданов А.П., Лисяный Н.И. Черепномозговая травма и иммунологическая реактивность организма. Киев. Здоровья.- 1991.-151с.

2. Лисяный Н.И., Бельская Л.Н., Потапова А.И. Особенности нейроаутоиммунных реакций при черепно-мозговой травме различной тяжести //Імунологія та алергологія: наука і практика. 2019,-№1.-С.23-29

3. Педаченко Е.Г., Лисяный Н.И. Хроническая травматическая энцефалопатия: природа, механизмы и стадии развития //Ukrainian Neurosurgical Journal.-2019.-Vol.23, №3.- С.5-11.

4. Лисяный Н.И. Двойная роль иммунной системы в патогенезе черепно-мозговой травмы //Ukrainian Neurosurgical Journal.- 2019.-Vol.25, №1.-С.5-11.

5. Vivier E, Morin P, O'Brien C, Drukor B, Schlossman SF, Anderson P (January 1991) “Tyrosine phosphorylation of the Fc gamma RIII (CD16)^A zeta complex in human natural killer cells. Induction by antibody-dependent cytotoxicity but not by natural killing”. Jourmal of Immunology.146 (1). 206-10. PMID 170192.

6. Mandelboim O, Malik P, Davis DM, Jo CH, Boyson JE, Strominger JL (May 1999) “Human CD16 as a lysis receptor mediating direct natural killer cell cytotoxicity”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.96 (10): 5640-4. Doi:10.1073/pnas.96.10.5640.PMC 21913. PMID 10318937.

7. Yeap WH, Wong KL, Shimasaki N, Teo EC, Quek JK, Yong HX, Diong CP, Bertoletti A., Linn YC, Wong SC (September 2016). “CD16 is indispensable for antibody-dependent cellular cytotoxicity by human monocytes”. Scientific Reports. 6 (1): 34310. doi:10.1038/ sred34310. PMC 5037471. PMID 27670158.

8. Anegon I, Cuturi MC, Trinchieri G, Perussia B (February 1988). “Interaction of Fc receptor (CD16) ligands induces transcription of interleukin 2 receptor (CD25) and lympho- kine genes and expression of their products in human natural killer cells” The Journal of Experimental Medicine.167 (2): 452-72. Doi:10.1084/jen.167.2.452 PMC 2188858. PMID 2831292.

9. Dumitru CA, Moses K, Trellakis S, ang S, Brandau S (August 2012). “Neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: immunophenotyping. Cell biology and clinical relevance in human oncology”. Cancer immunology, Immunotherapy. 61 (8). 115567. doi: 10.1007/s00262-012-1294-5. PMID 22692756.

10. Pillay J, Tak T, Kamp VM, Koenderman L (October 2013). “Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences” Cellular and Molecular Life Sciences.70 (20): 3813-27. doi 10. 1007/s000 18-013-1286-4. PMC 3781313. PMID 23423530.

11. Arambura J, Azzoni L, Rao A, Perussia B (September 1995) “Activation and expression of the nuclear factors of activated T cells, NFATc, in human natural killer cells: regulation 10.doi 10.1084/jem.182.3.801. PMC 2192167. PMID 7650486

12. Гришина Т.И., Кузьмина Е.Г., Захарова Н.С. Иммуномодулирующие свойства препарата галавит //В кн. «Галавит».- М.Медицина С.6-16.

13. Латышева Т.В., Щербакова О.А. Новые возможности направленной иммунологической коррекции на примере отечественного иммуномодулятора Галавит. //Рос.ал- лергол.журнал.-2004,№1.-С.77-81.

14. Sedgwick D., Schwender S., Imrich H. et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1991.-N.88.-P.7438-7442.

15. Пинегин Б.В. Ярилин А.А. Симоновва А.В и др. Применение проточной ц итометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека (Пособие для врачей) Москва ,2001 55 с.

черепно мозкова травма галавіт регенеративний імуномоделюючий

ЗМІНИ ВМІСТУ ІМУННИХ КЛІТИН, ЯКІ МІСТЯТЬ FcR III РЕЦЕПТОР В СЕЛЕЗІНЦІ ТА ГОЛОВНОМУ МОЗКУ ПІСЛЯ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ЧМТ

Лісяний М.І., Паламарьова А.В., Бєльська Л.М., Потапова А.Г.

ДУ «Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П.Ромоданова НАМН України, відділ нейроімунології

При ЧМТ виникають порушення в діяльності імунної системи, що може ускладнювати регенеративні та репаративні відповідні реакції в головному мозку.

Метою роботи було вивчення вмісту CD-16 клітин в селезінці та паренхімі головного мозку при різних термінах після ЧМТ у щурів та при корекції виниклих порушень в їх складі імуномоделюючим препаратом галалітом.

Методи. Черепно-мозкова травма у тварин моделювалась шляхом падіння грузу вагою100 г з висоти 120см на голову щурів, що були занаркотизовані і знаходились в стані наркотичного сну, який тримався до 30 хв. Для корекції виникаючих порушень використовували імуномодулюючий препарат галавіт в дозі 2 мг /кг ваги тварин в обємі 0,5 мл, який вводили внутрішньом'язово тваринам на 2, 3, 4 добу після травми.

Cелезінку та ліву та праву півкулі головного мозку гомогенізували в 5,0 мл середовища 199 і готували суспензії, які містили 10,0х106 клітин на 1 мл середовища 199. Мікроглію та інфільтруючі ЦНС моноцити готували за методом Sedgwick J. у співав. Визначення рівня СD-16 клітин в суспензіях селезінки та мікроглії проводили на проточному цитометрі за допомогою моноклональних антитіл проти СD-16 рецептора фірми BD Biosciences згідно інструкції до антитіл.

Результати. При легкій ЧМТ у щурів в селезінці на 2-5 добу зменшується кількість CD-16 клітин, що містять FcR III рецептор, а у фракціях мікрогліальних клітин збільшується кількість цих клітин.

Галавіт - препарат із імуномоделюючими властивостями, практично не впливає на знижений рівень CD-16 клітин в селезінці та стимулює їх накопичення в головному мозку на 10 добу після ЧМТ.

Висновки. Отримані результати свідчать про вплив галавіту на рівень CD-16 клітин в селезінці та головному мозку, що вказує на імуномоделюючу активність цього препарату.

Ключові слова: черепно-мозкова травма в експерименті, галавіт, імунні клітини головного мозку та селезінки, FcR III - рецептор

ИЗМЕНЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ИММУННІХ КЛЕТОК, СОДЕРЖАЩИХ FcR III РЕЦЕПТОР В СЕЛЕЗЕНКЕ И ГОЛОВНОМ МОЗГЕ ПОСЛЕ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЧМТ

Лисяный М.И., Паламарёва А.В., Бельская Л.М., Потапова А.Г.

ГУ «Институт нейрохирургии им. акад. А.П.Ромоданова НАМН Украины, отдел нейроиммунологии

При ЧМТ возникают нарушения в деятельности иммунной системы, что может затруднять регенеративные и репаративные ответные реакции в головном мозге

Целью работы было изучение содержания CD16 клеток в селезенке и паренхиме головного мозга при разных сроках после ЧМТ у крыс и при коррекции возникших нарушений в их составе иммуномодулирующим препаратом галалитом.

Методы. Черепно-мозговая травма у животных моделировалась путем падения груза весом 100 г с высоты 120 см на голову крыс, которые были занар- котизированы и находились в состоянии наркотического сна, который держался до 30 мин. Для коррекции возникающих нарушений использовали иммуномодулирующий препарат галавит в дозе 2 мг/кг веса животных в объеме 0,5 мл, который вводили внутримышечно животным на 2, 3, 4 сутки после травмы.

Cелезёнку и левую и правую полушария головного мозга гомогенизировали в 5,0 мл среды 199 и готовили суспензии, содержащие 10,0х106 клеток на 1 мл среды 199 микроглии и инфильтрирующие ЦНС моноциты готовили по методу Sedgwick J. в со- авт. Определение уровня CD-16 клеток в суспензиях селезенки и микроглии проводили на проточном цитометре с помощью моноклональных антител против CD-16 рецептора фирмы BD Biosciences согласно инструкции к антителам.

Результаты. При лёгкой ЧМТ, у крыс в селезенке на 2-5 сутки уменьшается количество CD-16 клеток, содержащих FcR III рецептор, а во фракциях микроглиальных клеток увеличивается количество этих клеток.

Галавит - препарат с иммуномодулирующими свойствами, практически не влияет на пониженный уровень CD-16 клеток в селезенке и стимулирует их накопление в головном мозге на 10 сутки после ЧМТ.

Выводы. Полученные результаты свидетельствуют о влиянии Галавита на уровень CD-16 клеток в селезенке и головном мозге, что указывает на иммуномодулирующую активность этого препарата.

Ключевые слова: черепно-мозговая травма в эксперименте, галавит, иммунные клетки головного мозга и селезенки, FcR III - рецептор

CHANGES IN THE CONTENT OF IMMUNE CELLS CONTAINING THE FcR III RECEPTOR IN THE SLEEP AND BRAIN AFTER EXPERIMENTAL TBI

Lisyany M., Palamaryova A., Belska L., Potapova A.

GU “Institute of Neurosurgery named after Acad. A. Romodanov NAMS of Ukraine”, Department of Neuroimmunology

At TBI there are disturbances in activity of immune system, can complicate regenerative and reparative responses in a brain.

The aim of the study was to study the content of CD-16 cells in the spleen and brain parenchyma at different times after TBI in rats and in the correction of disorders in their composition by immunomodulatory drug galalite.

Methods. Craniocerebral trauma in animals was modeled by dropping a load weighing 100 g from a height of 120 cm on the head of rats that were anesthetized and were in a state of narcotic sleep, which lasted up to 30 minutes. To correct the resulting disorders used immunomodulatory drug galavit at a dose of 2 mg / kg of animal weight in a volume of 0.5 ml, which was administered intramuscularly to animals for 2, 3, 4 days after injury.

The spleen and the left and right hemispheres of the brain were homogenized in 5.0 ml of medium 199 and suspensions containing 10.0x106 cells per 1 ml of medium 199 microglia were prepared and infiltrated CNS monocytes were prepared by the method of Sedgwick J. in co-authors. Determination of the level of CD-16 cells in suspensions of spleen and microglia was performed on a flow cytometer using monoclonal antibodies against CD-16 receptor company BD Biosciences according to the instructions for antibodies.

Results. In mild TBI in rats, the number of CD16 cells containing the FcR III receptor decreases in the spleen for 2 to 5 days, and the number of these cells in the fractions of microglial cells increases.

Galavit is a drug with immunomodulatory properties, has virtually no effect on low levels of CD-16 cells in the spleen and stimulates their accumulation in the brain for 10 days after TBI.

Conclusions. The results indicate the effect of Galavit on the level of CD-16 cells in the spleen and brain, which indicates the immunomodulatory activity of this drug.

Keywords: craniocerebral trauma in the experiment, galavit, immune cells of the brain and spleen, FcR III - receptor

Размещено на Allbest.ru