Главная Коллекция "Revolution" Медицина Вплив кальцієвого навантаження на утворення мітохондріальних пор in situ і експресію генів мітохондріальних роз’єднувальних білків у серці тренованих щурів

Вплив кальцієвого навантаження на утворення мітохондріальних пор in situ і експресію генів мітохондріальних роз’єднувальних білків у серці тренованих щурів

Вивільнення мітохондріального фактора і експресія генів UCP у відповідь на дозоване збільшення концентрації кальцію у перфузійному розчині. Опис вплив вмісту іонів кальцію в розчині Кребса-Хензеляйта на показники кардіодинаміки ізольованого серця.

Рубрика Медицина
Вид статья
Язык украинский
Дата добавления 26.06.2022
Размер файла 477,6 K
рефераты на заказ со скидкой

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив кальцієвого навантаження на утворення мітохондріальних пор in situ і експресію генів мітохондріальних роз'єднувальних білків у серці тренованих щурів

Ю.В. Гошовська, Н.А. Струтинська, В.Ф. Сагач

Інститут фізіологіїім. О.О. Богомольця НАН України, Київ

На моделі ізольованого за Лангендорфом серця вивчали вплив кальцієвого навантаження (від 1,7 до 15 ммоль/л у перфузаті) на скоротливу активність, вивільнення мітохондріального фактора (як маркера утворення мітохондріальних пор транзиторної провідності, МПТП) і експресію генів роз'єднувальних білків UCP2/3 у нетренованих і тренованих плаванням щурів. Виявили, що у разі покращення функції ізольованого серця тренованих протягом 4 тиж щурів збільшувалась експресія UCP3, але не UCP2. Поступове збільшення вмісту кальцію у перфузаті супроводжувалося приростом скоротливої функції, більш вираженим у тренованих щурів. Однак 10 ммоль/л і більш високі концентрації кальцію призводили до аритмії та різкого зниження скоротливості ізольованого серця, що більше проявлялось у нетренованих щурів. Фізичні навантаження запобігали кальційін- дукованому вивільненню мітохондріального фактора, здійснюючи стабілізуючий вплив на мембрани мітохондрій, який нівелювався блокатором синтезу оксиду азоту (L-NAME). Виявили кальційчутли- вий характер експресії генів UCP: збільшення мРНК UCP3 при 5 ммоль/л кальцію і різке зниження експресії UCP2/3 при 12,5 ммоль/л його як у тренованих, так і нетренованих тварин, що дає змогу стверджувати про їх участь у регуляції кальцієвого гомеостазу. Наші результати вказують, що модель кальцієвого навантаження ізольованого серця може слугувати тестом для титрування МПТП in situ, а активація UCP при тренуваннях відігравати захисну роль при збільшенні вмісту позаклітинного кальцію разом з оксидом азоту, інгібуючи утворення МПТП.

Ключові слова: серце; оксид азоту; кальцієве навантаження; мітохондріальні роз'єднувальні білки; мітохондріальна пора; тренування; плавання.

Ю.В. Гошовская, Н.А. Струтинская, В.Ф. Сагач

ВЛИЯНИЕ КАЛЬЦИЕВОЙ НАГРУЗКИ НА ОБРАЗОВАНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ПОР IN SITU И ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ РАЗОБЩАЮЩИХ БЕЛКОВ В СЕРДЦЕ ТРЕНИРОВАННЫХ КРЫС

На модели изолированного по Лангендорфу сердца изучали влияние кальциевой нагрузки (от 1,7 до 15 ммоль/л в перфузате) на сократительную активность, высвобождение митохондриального фактора (как маркера образования митохондриальных пор тран- зиторной проводимости, МПТП) и экспрессию генов разобщающих белков UCP2/3 у нетренированных и тренированных плаванием крыс. Обнаружили, что улучшение функции изолированного сердца тренированных плаванием течение 4 нед крыс сопровождалось увеличением экспрессии UCP3, но не UCP2. Постепенное увеличение концентрации кальция в перфузате вело к приросту сократительной функции, более выраженного у тренированных крыс. Однако 10 ммоль/л и более высокие концентрации кальция приводили к аритмии и резкого снижения сократительной функции изолированного сердца, что больше проявлялось у нетренированных крыс. Физические нагрузки предотвращали кальцийиндуцированное выделение митохондриального фактора, осуществляя стабилизирующее влияние на мембраны митохондрий, которое нивелировалось блокатором синтеза оксида азота (L- NAME). Обнаружили кальцийчувствительный характер экспрессии генов UCP: увеличение мРНК UCP3 при 5 ммоль/л кальция и резкое снижение экспрессии UCP2/3 при 12,5ммоль/л как у тренированных, так и нетренированных животных, что позволяет утверждать их участие в регуляции кальциевого гомеостаза. Наши результаты указывают, что модель кальциевой нагрузки изолированного сердца может служить тестом для титрования МПТП in situ, а активация UCP при тренировках может играть защитную роль при увеличении внеклеточного кальция, вместе с оксидом азота ингибируя образование МПТП.

Ключевые слова: сердце; оксид азота; кальциевая нагрузка; митохондриальные разобщающие белки; митохондриальная пора; тренировки; плавание.

Yu.V. Goshovska, N.A. Strutynska, V.F. Sagach

EFFECT OF CALCIUM LOAD ON HEART FUNCTION, MPTP OPENING IN SITU AND UCP2/3 MRNA EXPRESSION IN THE HEART OF TRAINED RATS

0. 0. Bogomoletz Institute of Physiology of NAS of Ukraine, Kyiv

We have studied the effect of calcium load (1.7 to 15 mmol/l in perfusate) on isolated heart function, mitochondrial factor release (as a marker of mitochondrial permeability transition pore, MPTP), and cardiac uncoupling proteins (UCP2/3) mRNA expression in untrained and trained rats (swimming for 4 weeks). It was found that the improvement in the isolated heart function of trained rats was accompanied by an increase in the expression of UCP3, but not UCP2. A gradual increase of the calcium content in the perfusate led to an increase in contractile function, more pronounced in trained rats. However, 10 mmol/l and higher concentration of calcium led to arrhythmia and drastic decrease in contractility of isolated heart more obvious in untrained rats. Swimming course prevented the calcium-induced release of mitochondrial factor exerting a stabilizing effect on mitochondrial membranes which was, however, diminished by a nitric oxide synthesis blocker (L-NAME). We have found that UCPs genes expression is calcium-sensitive: an increase in UCP3 mRNA at 5 mmol of calcium and a sharp decrease in UCP2/3 expression at 12.5 mmol/l of calcium in perfusate in both trained and untrained rats indicating the participation of UCPs in the regulation of calcium homeostasis. Our data suggest that the calcium load may serve as a test for in situ MPTP titration. Activation of UCPs together with up-regulated nitric oxide may play a protective role against increasing extracellular calcium inhibiting MPTP formation during physical trainings.

Key words: heart; nitric oxide; calcium load; mitochondrial uncoupling proteins; mitochondrial permeability transition pore; training; swimming.

ВСТУП

Іони кальцію (Са2+) опосередковують низку фізіологічних процесів серед яких скорочення м'язів, вивільнення нейротрансмітерів, ендоцитоз тощо. Потрапляння Ca2+ в середину кардіоміоцита ініціює його скорочення (систола), а виведення цього катіона з цитоплазми у внутрішньоклітинні депо і в міжклітинний простір супроводжується розслабленням (діастолою). При цьому концентрація Са2+ в цитоплазмі зменшується приблизно на порядок, а при новому акті скорочення - на порядок збільшується. Такі різкі перепади можливі завдяки достатньому вмісту АТФ, що продукується мітохондріями для забезпечення роботи Са2+-помп саркоплазматичного ретикулума. Важлива роль мітохондрій у регуляції кальцієвого гомеостазу зумовлюється наявністю селективних кальцієвих каналів у мітохондріальних мембранах і здатністю мітохондрій накопичувати цей катіон (кальцієва ємність мітохондрій). Через зовнішню мембрану мітохондрій Ca2+ рухається через потенціалзалежний аніонний канал, а через внутрішню - рутенійчутливим кальцієвим уніпортером (mitochondrial calcium uniporter, MCU). Електрохімічний ґрадієнт, що підтримує мембранний потенціал мітохондрій (Aym) на рівні 180 мВ, є рушійною силою для поглинання Са2+ уніпортером. З матриксу мітохондрій Ca2+ виводиться за допомогою активного транспорту переважно через Na+/ Са2+-обмінник [1]. Спряжене зі збільшенням концентрації Ca2+ в цитозолі поглинання цих іонів мітохондріями може стимулювати дихання та синтез АТФ, однак за дуже високих концентрацій імовірним є відкривання мітохондріальних пор транзиторної провідності (mitochondrial permeability transition pore, МПТП) і ініціація апоптозу [2, 3]. Відомо, що пригнічення утворення МПТП при реперфузії за допомогою фармакологічних агентів (циклоспорин А, коензим Q, ендоте- ліальний-моноцит активуючий протеїн) має кардіопротекторний ефект [4-6], забезпечує швидке відновлення АТФ-залежних процесів, в тому числі відкачування Са2+ з цитоплазми кардіоміоцитів. Таким чином, регуляція транспорту Са2+ в кардіоміоцитах є важливою з точки зору підтримки спряження процесів скорочення-розслаблення міокарда і виживання клітин у несприятливих умовах.

Помірні фізичні тренування є чудовим засобом для попередження розвитку патологій серцево-судинної системи. Серед механізмів, що активуються тренуваннями, можна виділити збільшення ефективності викачування Са2+ із саркоплазми в ретикулум та в позаклітинне середовище Na+/Ca2+-обмінни- ком, а також збільшення спряження роботи дихального ланцюга і синтезу АТФ. Однак найважливішим ефектом тренувань, з нашої точки зору, є збільшення кальцієвої ємності мітохондрій і порогової концентрації Са2+, що викликає утворення МПТП. Встановлено, що набухання мітохондрій серця тренованих тварин за дії тієї ж самої концентрації кальцію було значно меншим, ніж у нетренованих [7]. Оскільки утворення МПТП in vitro (в суспензії мітохондрій) ініціюється великими дозами кальцію, вважається, що її відкривання є подією, характерною для патологічного процесу. Роль МПТП за нормальних умов, в тому числі і в розвитку адаптації до фізичних навантажень, залишається маловивченою [8]. Тестом на оцінку утворення МПТП in situ (в моделі ізольованого серця) можуть виступати спеткрофотометричні дослідження мітохон- дріального фактора в елюатах. Наявність великої кількості продуктів розпаду аденіно- вих нуклеодитів, які за нормальних умов не виявляються у відтоці, буде характеризуватися збільшенням оптичного поглинання цих розчинів в ультрафіолетовій ділянці спектра і вказуватиме на збільшення проникності мітохондріальних мембран внаслідок утворення МПТП [9, 10]. Дозоване збільшення вмісту Са2+ у перфузійному розчині дасть змогу з'ясувати, коли саме утворюються МПТП, і як це співвідноситься із скоротливою функцією міокарда.

Мітохондріальні роз'єднувальні білки (UCP) є одним із визнаних регуляторів Aym і відіграють кардіопротекторну роль, захищаючи від окисного стресу [11, 12], що може також мати важливе значення у формуванні адаптаційних змін міокарда до фізичних навантажень. Раніше висувалося припущення, що саме UCP є білками, що не просто регулюють обмін кальцію, а і є складовими субоди- ницями кальцієвого уніпортера [13]. Було показано, що надекспресія UCP2 та UCP3 збільшує здатність мітохондрій поглинати Са2+, в той час як трансфекція клітин HeLa інтерферуючими РНК значно знижує цю здатність. Водночас відомо, що кальцієвий уніпортер активується безпосередньо полі- ненасиченими жирними кислотами [14], як і UCP. Було визначено домен, який відповідає за кальцієву провідність - місце найбільшої гомології UCP2 та UCP3 - друга трансмембранна петля. Експерименти з надекспресією мутантних у цій ділянці білків у культурі ендотеліальних клітин показали, що характерного збільшення кальцієвої провідності мембран не відбувається. Це вказує на участь UCP2 та UCP3 в поглинанні Са2+ мітохондрія- ми у відповідь на підвищення його концентрації в цитозолі. Зважаючи на те, що МПТП і UCP можуть бути учасниками кальцієвого гомеостазу, дослідження цих двох механізмів у відповіді міокарда на збільшення концентрації кальцію при фізичних тренуваннях становить значний науковий інтерес.

Метою нашої роботи було дослідити вивільнення мітохондріального фактора і експресію генів UCP у відповідь на дозоване збільшення концентрації кальцію у перфузій- ному розчині на моделі ізольованого серця.

МЕТОДИКА

Експерименти виконували на дорослих самцях щурів лінії Вістар віком 5-6 міс, масою 300-330 г. Тварин було розділено на три групи: контрольну і дві дослідні, по 8 тварин у кожній. Досліди проводили відповідно до Директиви 2010/63/EU Європейського парламенту про захист тварин, що використовуються для наукових цілей (22.09.2010), Закону України №3447-IV «Про захист тварин від жорстокого поводження» (редакція від 13.02.20). Щури дослідної групи тренувалися плаванням у резервуарі з водою при 30°C протягом 4 тиж, 5 днів на тиждень, починаючи з 2-х хвилин у перший день, збільшуючи час на 4 хв. Тварин брали в експеримент на наступний день після останнього сеансу плавання. Після декапітації і розтину грудної клітки серця вилучали і швидко поміщали в охолоджений розчин Кребса-Хензеляйта. Серце за аорту підвішували до канюлі і здійснювали ретроградну перфузію коронарних судин за умов постійного тиску (80 мм рт. ст.) при 37°С розчином Кребса-Хензеляйта (у ммоль/л): NaCl - 118; KCl - 4,7; MgSO4 - 1,2; NaHCO3 - 24; KH2PO4 - 1,2; глюкоза - 10; CaCl2 - 1,7. Перфузійний розчин аерували карбогеном (95% О2 і 5% СО2). Скоротливу активність ізольованого серця реєстрували за допомогою латексного балончика, введеного в порожнину лівого шлуночка, з'єднаного з тензодатчиком 746 (Мінгограф-82, «Elema», Швеція) та програмного забезпеченням Global Lab. Вивчали тиск у лівому шлуночку, його першу похідну і коронарний потік. Після стабілізації роботи серця проводили кальцієве навантаження, поступово збільшуючи концентрацію кальцію в перфузійному розчині до 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5 ммоль/л. Перфузія кожною з концентрацій становила 15 хв. Синтез NO блокували за допомогою L-NAME (N ^)-нітроі-аргінін метилестергідрохлорид, «Sigma», США) у концентрації 10-4 моль/л, яким здійснювали перфузію серць протягом 15 хв до початку кальцієвого навантаження.

Проби відтікаючого від серця розчину об'ємом 2-3 мл відбирали в кінці перфузії. Вимірювали оптичну щільність в ультрафіолетовій ділянці спектра (А, = 230-260 нм). Результати зображали у вигляді графіків залежності екстинції від довжини хвилі. Мітохондріальний фактор як маркер відкривання МПТП розраховували як різницю між максимальним значенням екстинції (при 245-250 нм) та мінімальним (при 230235 нм) у кожному експерименті.

Для дослідження експресїї генів UCP здійснювали забір верхівки серця і виділяли тотальну РНК за допомогою реагента TRIZOL («Sigma», США). Зворотну транскрипцію або синтез комплементарної до РНК молекули ДНК проводили за допомогою набору RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit («Fermentas», Литва) і 300-600 нг тотальної РНК, випадковий гек- самерний праймер. Отриману одноланцюгову ДНК використовували для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для ампліфікації фрагментів генів UCP2 та UCP3, а також фрагмент гена Я-актину як внутрішнього контролю. Послідовність нуклеотидів у праймерах була такою: прямий - 5'-TCATCAA AGATACTCTCCTGAAAGC-3', зворотний - 5'-TGACGGTGGTGCAGAAGC-3' для гена UCP2 [15]; прямий - 5'-GTGACCT ATGACATCATCAAGGA-3', зворотний - 5'-GCTCCAAAGGCAGAGACAAAG-3' для гена UCP3 [15, 16]; прямий 5'-CCTCTGA ACCCTAAGGCCAA-3', зворотний 5'-AGC CTGGATGGCTACGTACA-3' для гена Я-актину [16].

Суміш для ампліфікації містила 5 мкл 5-кратного буфера для полімеразної ланцюгової реакції, 1,5 ммоль/л сульфату магнію, 200 мкмоль/л суміші чотирьох нуклео- тидтрифосфатів, по 30 пмоль/л кожного з праймерів («Metabion», Німеччина), 0,5 ОД Taq-полімерази (“АмплиСенс”, Росія) і ДНК-матрицю, отриману в результаті зворотної транскрипції. Об'єм проби доводили до 25 мкл деіонізованою водою. ПЛР проводили в термоциклері GeneAmp System 2700” (“Applied Biosystems”, США). Ампліфікація фрагментів вказаних генів складалася з 32 циклів, кожен з яких включав: денатурацію - 94°С (50 с), гібридизацію праймерів - 58°С (1 хв) і елонгацію - 72°С (1 хв). Ампліфі- ковані фрагменти розділяли за допомогою електрофорезу у 1,5%-му агарозному гелі з додаванням бромистого етидію. Оцінювали яскравість ампліфікатів за допомогою тран- сілюмінатора і програмного забезпечення ViTran (“Биоком”, Росія). Розраховували відношення інтенсивності свічення ампліфікатів UCP до Я-актину.

Статистичну обробку результатів проводили з використанням дисперсійного аналізу (ANOVA) з поправкою Тукі, вірогідними вважали зміни при Р < 0,05. кребс хензеляйт мітохондріальний ізольоване серце

Вплив вмісту іонів кальцію в розчині Кребса-Хензеляйта на показники кардіодинаміки ізольованого серця щурів (M ± m, n = 8)

Показник

Схема

Концентрація [Са2+], ммоль/л

досліду

1,7

2,5

5

7,5

10

12,5

15

Тиск у ліво-

Контроль

104,7±7,2

125,5±8,0

155,7±8,7

156,7±13,6

141,5±8,9

130,2±9,8

98,5±7,1

му шлуноч-

Тренування

102,2±4,3

147,8±11,0 182,2±13,9 196,8±15,2 193,1±16,4 162,7±20,2102,3±14,2

ку, мм рт.ст.

Тренування і L-NAME

92,8±6,3

115,2±5,8

141,0±9,2

154,2±6,2

137,6±14,0 118,2±16,8

83,2±9,4

Швидкість

Контроль

1956±162

2436±168

3171±161

3251±300

2864±175

2557±191

1765±193

Тренування

1912±83

2946±230

3803±314

4181±362

4024±375

3233±465

1905±203

міокарда, мм рт.ст.-с-1

Тренування і L-NAME

1720±138

2207±123

2815±231

3253±222

2782±324

2324±374

1575±198

Швидкість

розслаблен-

Контроль

1613±157

2010±170

2502±185

2342±273

1843±239

1449±216

901±265

ня міокарда, мм рт.ст.-с-1

Тренування

1652±110

2454±163

2997±234

3193±243

2875±259

2367±377

1014±141

Тренування і L-NAME

1498±152

1933±137

2311±210

2497±220

1993±307

1555±318

1012±183

Коронар-

Контроль

12,05±0,8

10,8±0,7

12,1±1,12

11,75±1,4

8,35±1,0

7,02±1,2

4,9±1,2

ний потік,

мл-хв-1

Тренування

16,0±1,5

16,5±1,3

18,5±1,1

18,6±1,1

15,0±1,4

11,4±2,0

7,0±1,3

Тренування і L-NAME

10,36±1,0

10,0±0,7

10,9±1,1

11,0±0,9

8,6±1,37

7,0±1,18

3,9±0,8

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Збільшення вмісту Са2+ в перфузійному розчині супроводжувалось інотропною стимуляцією ізольованого серця. Максимальний тиск у лівому шлуночку у всіх трьох групах був зафіксований за концентрації Са2+ 7,5 ммоль/л, однак приріст цього показника у тренованих тварин був значно більший і становив в середньому 94,6 мм рт. ст. щодо 52,0 мм рт. ст. у нетренованих (таблиця). Максимальна швидкість скорочення і розслаблення міокарда також були найвищими за концентрації 7,5 ммоль/л, і їх прирости становили 2269 і 1541 мм рт. стх-1 відповідно у тренованих тварин, що вдвічі більше, ніж у нетренованих (1295 і 749 мм рт. ст-с-1). Ці результати свідчать про збільшення ефективності роботи серця після курсу плавання, їх покращену здатність відповідати посиленням скоротливості на дію кальцієвих навантажень. Перфузія тренованих сердець сполукою L-NAME запобігала двократному збільшенню приросту тиску у лівому шлуночку, який становив всього 61,4 мм рт. ст., а також максимальної швидкості скорочення і розслаблення міокарда (1533 і 999 мм рт. ст. відповідно), що доводить важливу роль NO у формуванні адаптації до фізичних навантажень не лише у вигляді покращення скоротливості, але і здатності утилізувати великі концентрації кальцію, які можуть збільшуватися за різних фізіологічних і патологічних умов.

Важливим показником покращення роботи серця за дії фізичних навантажень є збільшення коронарного потоку, який у тренованих тварин був на 32% більшим, ніж у нетренованих (див. таблицю). Блокатор NO знижував коронарний потік тренованих тварин на 35%. Крім того, у відповідь на кальцієве навантаження до 7,5 ммоль/л він збільшувався на 16% у групі тренованих тварин, і лише на 6% за попередньої дії блокатора NO. Таким чином, наші результати вказують на значну роль NO в адаптації до фізичних тренувань і формування здатності кардіоміоцитів утилізувати великі концентрації кальцію.

Після максимальної інотропної реакції за дії 7,5 ммоль/л Са2+ у всіх трьох групах спостерігався спад скоротливої функції ізольованого серця у разі дії наступного збільшення концентрації Са2+, при чому блокатор NO прискорював зменшення усіх досліджуваних показників у тренованих тварин. При 15 ммоль/л Са2+ спостерігалися значні порушення скоротливої активності у вигляді екстрасистолії та епізоди фібриляції.

Спектрофотометричне дослідження показало, що оптична щільність елюатів сердець тренованих тварин, зібраних при 2,5 ммоль/л Са2+, відрізнялася найменшою кількістю загального вмісту метаболітів (рис. 1, а). Це може свідчити про більшу ефективність перебігу метаболічних процесів у міокарді тренованих тварин як результат адаптації до фізичних навантажень. Концентрація Са2+ 5 і 7,5 ммоль/л не викликало суттєвих змін оптичної щільності серцевих елюатів, що узгоджується з показниками кардіодинаміки, і підтверджує здатність сердець усіх трьох груп тією чи іншою мірою утилізувати Са2+ за таких умов. Подальше зростання оптичної щільності елюатів відбувалося поступово відповідно до збільшення концентрації Са2+ в перфузаті. Найбільша екстинція спостерігалась у розчинів, зібраних при 15 ммоль/л Са2+ (див. рис. 1, б, в). Мітохондріальний фактор становив у контрольних щурів 0,035 ± 0,007 ум. од, у тренованих - 0,027 ± 0,008 ум. од., у тренованих за дії L-NAME - 0,016 ± 0,007 ум. од. (Р > 0,05). Незважаючи на нижчий фактор у групі з попередньою блокадою NO, оптична щільність елюатів цієї групи займала проміжне місце між тренованими і не тренованими тваринами як при 2,5, так і при 12,5 і 15 ммоль/л Са2+ (див. рис.

1) . Варто відмітити, що отримані значення мітохондріального фактора були значно меншими (приблизно в 4-6 разів), ніж при ішемії-реперфузії ізольованого серця щурів такого самого віку [6] і навряд чи свідчать про відкривання великої кількості МПТП. Однак треба враховувати постійне вимивання метаболітів із коронарного русла перфузійним розчином, тоді як при моделюванні ішемії метаболіти накопичуються протягом певного часу. Наші результати вказують на те, що збільшення продукції NO при тренуваннях є важливим тригером розвитку тренованості і механізмом збільшення резервів міокарда, одним з яких є здатність забезпечувати ефективний менеджмент кальцієвих транзієнтів, імовірно, внаслідок збільшення кальцієвої ємності саркоплазматичного ретикулума і/ чи мітохондрій.

абв

Рис. 1. Зміни оптичної щільності розчинів, що відтікають від ізольованого серця при 2,5 ммоль/л Са2+ (а), 12,5 ммоль/л (б), 15 ммоль/л (в). 1 - контроль, 2 - тренування, 3 - тренування і L-NAME. *Р < 0,05

Ми виявили, що в серці нетренованих щурів після введення 5 ммоль/л Са2+ підвищувалося співвідношення мРНК иСР3/актин до 170 ± 4,2% (Р < 0,01 щодо контролю; рис.

2) . Однак при 12,5 ммоль/л Са2+ у перфузаті це співвідношення знижувалося і становило 122,1 ± 7,3% (Р < 0,01 щодо навантаження 5 ммоль/л). Такі коливання експресії за досить короткий час вказують на те, що активація UCP3 може бути одним із механізмів швидкого реагування на збільшення концентрації кальцію в міокарді, а його експресія - регулюватися за принципом зворотного зв'язку.

Рис. 2. Експресія гена мітохондріального роз'єднувального білка 3 (UCP3) у серці нетренованих щурів в контролі (1, n = 5), за дії 5 (2, n = 6) і 12,5 (3, n = 6) ммоль/л кальцію в перфузійному розчині. **Р < 0,01

Тренування плаванням підвищувало експресію гена UCP3 у серці: співвідношення мРНК иСР3/актин становило 124,1 ± 2,7% (Р < 0,01 ; рис. 3). При цьому експресія UCP2 залишалася незмінною. Кальцієві навантаження до 12,5 ммоль/л Са2+ у перфу- заті призводили до достовірного зниження експресії як UCP2, так і UCP3 порівняно з групою тренованих тварин. Таким чином, ми виявили зниження експресії генів UCP у разі дії великих концентрацій кальцію у серці як тренованих, так і нетренованих тварин.

Дослідження мітохондріальних механізмів відповіді серця на підвищення концентрації позаклітинного кальцію є важливою задачею, бо неконтрольоване збільшення концентрації кальцію і перевантаження кардіоміоцитів призводить до утворенням МПТП, виходом цитохрому С з мітохондрій і ініціацією апоптозу. Разом з тим роль МПТП за нормальних умов і при фізичних навантаженнях залишається не з'ясованою. Раніше нами було показано, що серця тренованих тварин є більш стійкими до дії ішемії-репер- фузії, а мітохондрії серця і відповідно МПТП - менш чутливі до впливу кальцію [7]. При цьому збільшувалась активність конститутивної NO-синтази. Наразі ми показали, що проведення кальцієвого навантаження може використовуватися як тест на відкривання МПТП in situ, а NO, який продукується при фізичних тренуваннях є важливим інгібітором утворення МПТП і може бути одним із механізмів збільшення кальцієвої ємності мітохондрій кардіоміоцитів при адаптації до фізичних навантажень і/або регулятором кальцієвих транзієнтів.

Рис. 3. Експресія генів роз'єднувальних білків (UCP2 та UCP3) у серці контрольних (1, n = 6), тренованих тварин (2, n = 8) і тренованих тварин за дії 12,5 ммоль/л Са2+ (3, n = 5). *Р < 0,05, **Р < 0,01

Відомо, що фізичні навантаження плаванням чи тренування на тредмілі збільшують вміст мРНК UCP3 у скелетних м'язах щурів [17-19]. Це можна пояснити активацією лі- полізу, внаслідок чого в крові збільшується концентрація вільних жирних кислот, які через рецептор, що активується проліфератором пероксидом (PPAR), стимулюють експресію UCP у м'язах. Цікавий аспект однієї з праць [19] полягає у надзвичайно швидкій активації експресії мРНК UCP3, збільшення якої в скелетних м'язах в 2,5-3 рази автори спостерігали вже через 30 хв одноразових тренувань або гіпоксії. Однак експресія мРНК UCP2 та UCP3 у скелетних м'язах і серці щурів може знижуватися практично вдвічі внаслідок дуже тривалих фізичних навантажень (8-тижнева програма тренувань на тредмілі) [20]. У наших дослідах експресія UCP2 залишалася незмінною, але спостерігали збільшення експресії UCP3, що збігається з даними літератури. З одного боку, це може вказувати на помірність обраної програми тренувань для тварин, з іншого - на дещо відмінні функції для обох UCP, які у серці можуть відповідати на різні стимули. Крім того, збільшення їх експресії в скелетних м'язах і серці при фізичних навантаження супроводжується помірним зменшенням Дут, продукції АФК і збільшенням ефективності окисного фос- форилювання [17, 21]. Ми вважаємо, що зниження продукції АФК UCP-залежним чином може здійснювати антиоксидантний ефект і робити внесок у зниження чутливості МПТП до дії Са2+.

Наші результати вказують на те, що UCP беруть участь у відповіді на зміну концентрації Са2+ і, ймовірно, задіяні у регуляції кальцієвого гомеостазу. Невеликі дози Са2+ (5 ммоль/л), при яких реєстрували зростання скоротливої активності міокарда, стимулювали експресію UCP3 у інтактних тварин. При підвищенні концентрації кальцію в перфузаті до 12,5 ммоль/л, коли пригнічується роботи серця, експресія UCP3 зменшується, оскільки виникають умови для утворення МПТП, порушення роботи мітохондрій і відповідно зниження Д^т. Схожу картину змін експресії генів UCP2/3 спостерігали в серцях тренованих щурів, де при високих дозах Са2+ їх експресія також достовірно знижувалась. Імовірно це є одним із механізмів зменшення кальцієвої ємності, оскільки було показано значне зниження поглинання Ca2+ мітохонд- ріями при використанні інтерферуючих РНК до UCP2 і UCP3 [13], що ще раз підтверджує участь UCP у регуляції кальцієвого гомеостазу. Однак наразі важко сказати, за допомогою якою механізму це відбувається. Можна припустити, що кальційтранспортна функція UCP не пов'язана з протон-провідною їх активністю, оскільки чим більший Д^т - тим більше повинне бути поглинання кальцію мітохондріями, а зниження ДУт внаслідок роботи UCP має знижувати це поглинання. Незважаючи на те, що поглинання великої кількості кальцію може прискорювати роботу дихального ланцюга і збільшувати продукцію АФК, самі іони кальцію можуть знижувати протонний ґрадієнт, стимулюючи транзи- торне відкривання МПТП і, таким чином, запобігати надмірній ґенерації АФК, у чому власне і буде полягати фізіологічна функція МПТП. Крім того, мітохондріальний Са2+ може активувати ферменти антиоксидантного захисту (каталазу, супероксиддисмутазу, глу- татіон), знижуючи в такий спосіб продукцію АФК [22].

Таким чином, ми встановили, що адаптація до фізичного навантаження супроводжується зменшенням чутливості сердець до утворення МПТП під дією Са2+, що може бути зумовлено активацією синтезу NO і системи UCP. Імовірно, всі клітинні механізми, котрі спрямовані на стабілізацію проникності мітохондріальних мембран роблять свій внесок у загальний захисний ефект, що спостерігається при адаптації до фізичного навантаження.

ВИСНОВКИ

1. Фізичні навантаження плаванням протягом 4 тиж супроводжувалися покращенням функції ізольованого серця щурів і зменшенням загальної кількості метаболітів, що вивільняються з міокарда у перфузійний розчин.

2. Фізичні навантаження плаванням збільшували експресію UCP3, але не UCP2 у серці.

3. Фізичні навантаження запобігали каль- ційіндукованому вивільненню мітохондрі- ального фактора, здійснюючи стабілізуючий вплив на мембрани мітохондрій, що був опосередкований синтезом оксиду азоту і ймовірно активацією системи UCP.

4. Експресія UCP2/3 різко зменшувалась у відповідь на збільшення концентрації іонів кальцію у перфузійному розчині як у тренованих, так і нетренованих тварин, що дає змогу стверджувати про їх участь у регуляції кальцієвого гомеостазу.

5. Модель кальцієвого навантаження ізольованого серця може слугувати тестом для титрування транзиторної провідності міто- хондріальних мембран in situ.

REFERENCES

1. Boyman L, Williams GSB, Khananshvili D, Sekler I,

Lederer WJ. NCLX: The mitochondrial sodium calcium exchanger. J Mol Cell Cardiol. 2013;59:205-13.

2. Halestrap AP. A pore way to die: the role of mitochondria

in reperfusion injury and cardioprotection. Biochem Soc Trans. 2010 Aug 1;38(4):841-60.

3. Bauer TM, Murphy E. Role of mitochondrial calcium and

the permeability transition pore in regulating cell death.

Circ Res. 2020;126(2):280-93.

4. Ong S-B, Dongworth RK, Cabrera-Fuentes HA, Hau

senloy DJ. Role of the MPTP in conditioning the heart - translatability and mechanism. Br J Pharmacol. 2015;172(8):2074-84.

5. Sagach VF, Scrosati M, Fielding J, Rossoni G, Galli C,

Visioli F. The water-soluble vitamin E analogue Trolox protects against ischaemia/reperfusion damage in vitro and ex vivo. A comparison with vitamin E. Pharmacol Res. 2002;45(6):435-9.

6. Goshovska YV, Fedichkina RA, Korneliuk OI, Sagach

VF. Endothelial monocyte-activating polypeptide-ii and Proemap/P43 diminish isolated heart function disturbances after ischemia-reperfusion. Fiziol Zh. 2018;64(5):7-15. [Ukrainian].

7. Chorna SV, Talanov SO, Strutynska NA, Vavilova

GL, Kotsuruba AV, Gaidai NM, et al. The functional state of the rat heart during ischemia-reperfusion , the sensitivity of calcium-induced mitochondrial permeability transition pore opening and the uncoupling protein 3 expression following long exercise training. Fiziol Zh. 2010;56(1):13-21. [Ukrainian].

8. Kwong JQ, Molkentin JD. Physiological and pathological

roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metab. 2015;21(2):206-14.

9. Nadtochiy SM, Nauduri D, Shimanskaya TV, Sagach

VF, Brookes PS. Purine release: a protective signaling mechanism of the mitochondrial permeability transition pore in ischemia. Fiziol Zh. 2008;54(6):5-14.

10. Sahach VF, Vavilova HL, Rudyk OV, Strutyns'ka NA.

Release of unidentified substances of mitochondrial origin-evidence of mitochondrial permeability transition pore opening in the heart mitochondria of rats. Fiziol Zh. 2003;49(5):3-12. [Ukrainian].

11. Azzu V, Jastroch M, Divakaruni AS, Brand MD. The

regulation and turnover of mitochondrial uncoupling proteins. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2010;1797(6- 7):785-91.

12. Iu.V. Hoshovs'ka. The role of uncoupling proteins in

mechanisms of protection from oxidative stress. Fiziol Zh. 2015;61(1):91-101. [Ukrainian].

13. Trenker M, Malli R, Fertschai I, Levak-Frank S, Graier

WF. Uncoupling proteins 2 and 3 are fundamental for mitochondrial Ca2+ uniport. Nat Cell Biol. 2007;9(4): 445-52.

14. Zhang B-X, Ma X, Zhang W, Yeh C-K, Lin A, Luo J, et

al. Polyunsaturated fatty acids mobilize intracellular Ca2+ in NT2 human teratocarcinoma cells by causing release of Ca2+ from mitochondria. Am J Physiol Physiol. 2006;290(5):C1321-33.

15. Huntgeburth M, Tiemann K, Shahverdyan R, Schlьter

K-D, Schreckenberg R, Gross M-L, et al. Transforming growth factor Я1 oppositely regulates the hypertrophic and contractile response to Я-adrenergic stimulation in the heart. PLoS One. 2011;6(11):e26628.

16. Stavinoha MA, RaySpellicy JW, Hart-Sailors ML,

Mersmann HJ, Bray MS, Young ME. Diurnal variations in the responsiveness of cardiac and skeletal muscle to fatty acids. Am J Physiol Metab. 2004;287(5):E878-87.

17. Jiang N, Zhang G, Bo H, Qu J, Ma G, Cao D, et al.

Upregulation of uncoupling protein-3 in skeletal muscle during exercise: a potential antioxidant function. Free Radic Biol Med. 2009;46(2):138-45.

18. Lu Z, Sack MN. ATF-1 Is a Hypoxia-responsive

transcriptional activator of skeletal muscle mitochondrial- uncoupling protein 3. J Biol Chem. 2008;283(34): 23410-8.

19. Zhou M, Lin B-Z, Coughlin S, Vallega G, Pilch PF.

UCP-3 expression in skeletal muscle: effects of exercise, hypoxia, and AMP-activated protein kinase. Am J Physiol

Metab. 2000;279(3):E622-9.

20. Boss O, Samec S, Desplanches D, Mayet M, Seydoux J,

Muzzin P, et al. Effect of endurance training on mRNA expression of uncoupling proteins 1, 2, and 3 in the rat. FASEB J. 1998;12(3):335-9.

21. Bo H, Jiang N, Ma G, Qu J, Zhang G, Cao D, et al. Regu

lation of mitochondrial uncoupling respiration during exercise in rat heart: Role of reactive oxygen species (ROS) and uncoupling protein 2. Free Radic Biol Med. 2008;44(7):1373-81.

22. Yan Y, Wei C, Zhang W, Cheng H, Liu J. Cross-talk

between calcium and reactive oxygen species signaling. Acta Pharmacol Sin. 2006;27(7):821-6.

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.

© 2000 — 2023, ООО «Олбест» Все права защищены