Коронавірусна хвороба (COVID-19). Виклики та перспективи специфічної діагностики

Размещено на http://allbest.ru

КОРОНАВІРУСНА ХВОРОБА (COVID-19). ВИКЛИКИ ТА ПЕРСПЕКТИВИ СПЕЦИФІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ

К.М. Гуменюк, Д.О. Дубина, О.О. Юрченко

ДУ «Український науково-дослідний протичумний інститут імені І. І. Мечнікова МОЗ України»

Пандемія коронавірусної хвороби (COVID-19), яка стартувала наприкінці 2019 року в Китаї, стала непередбаченим викликом для системи охорони здоров'я абсолютно усіх країн світу. Серед проблем, які потребували негайного вирішення, стало налагодження масової специфічної діагностики емерджентної інфекції, спричиненої коронавірусом SARS-CoV-2. У даному огляді представлені технології, які застосовуються для специфічної діагностики COVID-19. Обговорено переваги та обмеження найбільш поширених методологій, спрямованих на виявлення збудника або специфічних до нього антитіл. Виявлення фрагментів геному вірусу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією в реальному часі (рЗТ-ПЛР) дозволило досягти високої точності діагностики. З самого початку пандемії та дотепер цей метод вважається «золотим» стандартом, незважаючи на обмеження, пов'язані з його високою вартістю, трудомісткістю та необхідністю проведення досліджень в спеціалізованих лабораторіях. Більш дешеві імунологічні методи мають недостатню діагностичну ефективність і можуть використовуватися лише як додаткові до молекулярного тестування. В огляді також представлені перспективні методи специфічної діагностики COVID-19, які засновані на молекулярно-генетичних технологіях, характеризуються простотою та швидкістю виконання, не потребують дорогого обладнання і можуть виконуватись в пунктах надання медичної допомоги.

Ключові слова: вірус SARS-CoV-2, специфічна діагностика, полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією в реальному часі (рЗТ-ПЛР), імуноферментний аналіз (ІФА), швидкі діагностичні тести.

діагностика коронавірусна хвороба тестування інфікування

У грудні 2019 року в Ухані, Китай, почали реєструватися випадки пневмонії невідомого походження [111]. Китайський центр з контролю та профілактики захворювань 7 січня 2020 року офіційно повідомив про спалах атипової пневмонії, викликаної новим патогенним коронавірусом [91], який пізніше отримав назву SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus- коронавірус 2 важкого гострого респіраторного синдрому) [45], а респіраторне захворювання, спричинене ним, - коронавірусна хвороба COVID-19 (COronaVIrus Disease) [110]. Здатність вірусу SARS-CoV-2 до ефективної передачі від людини до людини призвела до його планетарного поширення. У березні 2020 року Всесвітня організація охорони здоров'я (ВООЗ) охарактеризувала захворюваність, спричинену новим коронавірусом, як пандемію [112]. Станом на 11 березня 2021 року в світі зареєстровано більше 118 млн. випадків захворювання, серед яких більше 2,6 млн. (2,22%) летальних [117].

Статистична інформація щодо кількості випадків COVID-19 у світі базується, переважно, на даних діагностичного тестування [113]. Розробка стратегії ефективної специфічної діагностики напряму залежить від рівня вивчення вірусу SARS-CoV-2, його геномного складу та антигенних властивостей, розуміння динаміки вірусної репродукції та кінетики імунної відповіді, спрямованої проти вірусу. Дослідження цих аспектів коронавірусної хвороби COVID-19 розпочалося з перших днів виявлення емерджентної інфекції. Так, перша генетична послідовність вірусу SARS-CoV-2 була завантажена до бази геномних даних GISAID вже 10 січня 2020 року [30].

Основною складністю при налагодженні тестування для діагностики COVID-19 стала необхідність проведення масового обстеження з використанням найнадійніших методів та з урахуванням наявних технологічних та економічних можливостей. У цій ситуації доречною стала розробка тестів на основі вже існуючих молекулярно-генетичних та імунологічних технологій, які широко застосовуються для специфічної діагностики інших інфекційних захворювань. Разом з цим, продовжується пошук нових підходів, які дозволять підвищити ефективність діагностики за рахунок використання високочутливих і високоспецифічних тестів, простих і швидких у виконанні, з високою пропускною здатністю та можливістю застосування за межами спеціалізованих лабораторій.

Тому, метою роботи є узагальнення поточного стану розробки методів специфічної діагностики коронавірусної хвороби COVID-19, визначення основних проблем, пов'язаних з тестуванням, та ідентифікація перспективних технологій, спрямованих на виявлення інфікування вірусом SARS-CoV-2.

Характеристика вірусу SARS-CoV-2

Збудником нової коронавірусної хвороби COVID-19 є споріднений 2 коронавірусами кажанів вірус SARS-CoV-2, який відноситься до роду Betacoronavirus підродини Orthocoronavirinae родини Coronaviridae [45].

Вірус SARS-CoV-2 є оболонковим РНК-вірусом сферичної форми діаметром близько 120 нм. Геном вірусу представляє собою лінійну однонит- кову РНК позитивної полярності та є одним з найбільших серед РНК-вірусів (29903 нуклеотиди) [118]. У вірусній РНК довга відкрита рамка зчитування (Open Reading Frame, ORF) та невеликі ділянки, що кодують структурні та додаткові білки, фланковані з обох сторін регіонами, що не транслюються (UnTranslated Regions, UTRs) [22]. ORF займає майже 2/3 довжини геному та має 2 рамки зчитування, що перекриваються (ORF^ та ORF1b) [28, 70] та кодують 16 неструктурних протеїнів, в тому числі, РНК-залежну РНК-по- лімеразу (RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) та геліказу (helicase, Hel)

- ферменти реплікативно-транскрипційного комплексу (replicase-transcriptase complex, RTC), який забезпечує синтез субгеномних РНК (sgRNAs), що кодують 4 структурні (E, M, N, S) та 9 додаткових протеїнів [2, 22,26, 91] (рис. 1).

Рис. 1. Структура та геном вірусу SARS-CoV-2 [2]

Fig. 1. SARS-CoV-2 genome and structure [2]

Динаміка вірусної репродукції

Після проникнення вірусу SARS-CoV-2 в організм людини інкубаційний період триває від 1-го до 14-ти днів (в середньому - 3-7 днів), а за деякими даними більше трьох тижнів [57, 89]. Концентрація вірусу SARS-CoV-2 на різних стадіях захворювання, в різних органах та рідинах відрізняється, що являється важливим критерієм для визначення того, який біологічний матеріал та в які строки необхідно відбирати з метою специфічної діагностики [38]. Для більшості пацієнтів середня тривалість від появи симптомів до ранньої, прогресувальної та реконвалесцентної стадій становить 4 (2-6), 12 (7-19) та 20 (10-33) днів відповідно [131]. Вірус швидко реплікується в організмі людини в перші декілька днів захворювання, досягаючи піку (10⁴-10⁷ копій/мл) в ранній та прогресувальній стадіях, після чого на стадії реконвалесценції вірусне навантаження зменшується до рівня нижче ніж 10⁴ копій/мл. У середньому вірус виділяється протягом близько 20 днів, але його концентрація поступово знижується [91]. Концентрація вірусу в зразках, які визначені ВООЗ як клінічний матеріал для діагностики COVID-19, розрізняється: вірусне навантаження значно вище в біологічних матеріалах із респіраторного тракту - бронхоальвеолярний лаваж, ендотрахеальний аспірат, мокротиння, назо- та орофарингеальні мазки (матеріал перелічений в порядку зниження вірусного навантаження) [100], ніж в інших біологічних зразках (фекалії, плазма і сироватка крові, сеча) [39, 60, 103]. Концентрація вірусу в клінічному матеріалі з нижніх дихальних шляхів вища, ніж з верхніх [60, 103]. Нещодавно слина була запропонована як надійний зразок для виявлення вірусу SARS-CoV-2 [7, 12, 99].

Кінетика гуморальної імунної відповіді

Вірус SARS-CoV-2 містить чотири основні структурні білки, до яких можуть синтезуватися антитіла: поверхневий глікопротеїн шипа S, який складається з N-кінцевої субодиниці S1 та С-кінцевої субодиниці S2, білки оболонки E, мембрани M та нуклеокапсиду N [52].

Багато залишається невідомим стосовно рівня та тривалості гуморальної відповіді після інфікування вірусом SARS-CoV-2. Вважається, що специфічні імуноглобуліни ізотипів IgA, IgM та IgG синтезуються одночасно та починають виявлятися вже в перший тиждень захворювання [65, 69]. Інші дослідники спостерігали сероконверсію пізніше: приблизно через 7-14 днів після появи симптомів [34, 75, 128, 137], на 11-24 день захворювання [11], через 3 тижні після інфікування або появи симптомів [15, 93, 134, 136]. За різними оцінками титри антитіл до вірусу SARS-CoV-2 досягають максимуму через 6 днів (IgM, IgG) після сероконверсії [65] або через 3-4 тижня від початку захворювання, після чого поступово знижуються до рівня, що не де- тектується [53].

Динаміка титрів IgM протягом інфекції ще недостатньо вивчена, проте відомо, що 70% хворих мають IgM на 8-14 день захворювання [11]. Схожі результати отримані при дослідженні серійних зразків плазми госпіталізованих пацієнтів з COVID-19 - в середньому сероконверсія IgM відбувалася на 12 день хвороби [137]. В іншому дослідженні з використанням ІФА повідомляється про набагато раніше виявлення IgM - через 3-6 днів після появи симптомів [48].

Слід зазначити, що IgA також з'являються рано, одночасно з IgM, а їх рівень досягає максимуму через 18-21 день [79]. У 92,7% обстежених IgA починали виявлятися через 3-6 днів (медіана - 5 днів) після появи симптомів [48]. Можливо, що титри IgA вище, а їх присутність є більш тривалою, ніж IgM. IgA секретуються на поверхні слизових оболонок тіла, і їх виявлення та титр у сироватці або плазмі крові можуть відображати імунну функцію слизових оболонок [79].

IgG починають виявлятися через 3 дні з моменту появи симптомів або принаймні через 7-10 днів після зараження [65]. При дослідженні методом ІФА серійних зразків плазми госпіталізованих пацієнтів з COVID-19 продемонстровано, що в середньому сероконверсія IgG відбувається на 14 день захворювання [137], що співпадає з даними про виявлення IgG через 10-18 днів (медіана - 14 днів) після розвитку симптомів у 77,9% пацієнтів [48]. За іншими даними IgG можуть виявлятися через 20 днів після інфікування та присутні в крові тривалий час [134].

Досі залишаються мало вивченими тривалість гуморальної імунної відповіді, рівень захисного титру антитіл та швидкість його зниження в залежності від важкості перебігу інфекції [53]. Останні дані свідчать про те, що хворі з важким перебігом COVID-19 мають вищі титри IgM та IgG у порівнянні з пацієнтами з легкими захворюваннями або безсимптомними особами [66, 68]. У деяких легких та безсимптомних випадках антитіла не виявлялися протягом усього періоду досліджень (до 46 днів) [18, 64, 65, 66, 128]. Можливо, це пов'язано з елімінацією вірусу із організму ще до розвитку імунної відповіді завдяки чинникам вродженого імунітету. Сероконверсія також може бути відсутньою у хворих на хронічний лімфолейкоз (ХЛЛ) [42].

У пацієнтів, які одужують, виявляються нейтралізувальні антитіла через два-три місяці після зараження [61, 65]. Але зараз ще недостатньо даних щоб визначити, чи формується протективний імунітет та яка його тривалість.

Загальна характеристика методів специфічної діагностики COVID-19

Точні лабораторні технології, застосовані в певні терміни від моменту інфікування, відіграють життєво важливу роль у специфічній діагностиці COVID-19. На початку інфекції, коли імунна відповідь ще не сформована, доцільно використовувати методи, спрямовані на виявлення вірусу SARS- CoV-2, його РНК або антигенів у біологічних субстратах, де відбувається репродукція збудника [13]. Починаючи з другого тижня після появи симптомів у діагностиці COVID-19 можуть застосовуватися імунологічні методи, спрямовані на детекцію специфічних противірусних антитіл - імуноглобулінів класів М, А та G, в сироватці крові [32].

Узагальнена інформація про основні технології, які здатні виявляти інфікування вірусом SARS-CoV-2, представлена в таблиці 1.

Методи детекції вірусу SARS-CoV-2

Ізоляція вірусу на культурі клітин є найнадійнішим методом підтвердження етіології при діагностиці вірусних інфекцій. Для ізоляції вірусу SARS-CoV-2 можуть використовуватися культури клітин Caco-2, Vero, Vero E6, Vero E6/TMPRSS2 та VeroCCL81 [16, 49, 56, 92, 122]. Проте, даний метод не рекомендується для рутинної діагностики, в першу чергу, з огляду на високу небезпеку збудника, наслідком чого є необхідність проведення досліджень в умовах лабораторій рівня біологічного захисту 3 (BSL-3). Іншими недоліками методу є його тривалість, низка пропускна здатність в умовах обмежених ресурсів [97], а також менша чутливість у порівнянні з молекулярно-генетичними методами. Наприклад, ізолювати вірус SARS-CoV-2 в культурі клітин Caco-2 вдалося лише із 51,6% зразків, позитивних в рЗТ-ПЛР [56]. Проте, даний метод має вирішальне значення для оцінювання динаміки виділення вірусу хворими, вивчення ефективності вакцин та терапевтичних засобів, дослідження патогенезу та стабільності вірусу [21].

Іншим методом прямого виявлення вірусу SARS-CoV-2 є електронна мікроскопія, за допомогою якої вдалося ідентифікувати вірус у зразках внутрішніх органів - легень, серця, нірок та плаценти [17, 37, 84]. Але дослідження мазків із дихальних шляхів не дозволило виявити вірусні частинки навіть у зразках з низьким значенням порогового циклу (cycle threshold, Ct) в рЗТ-ПЛР, що відповідає великому числу копій РНК в біологічному мате- ріалі [Michael Laue і Lars Moller, Інститут Роберта Коха, персональне повідомлення]. Відсутність відповідного обладнання в клінічних лабораторіях та низька пропускна здатність методу не дозволяють застосовувати електронну мікроскопію для рутинної діагностики, але безперечним залишається її значення для вивчення патогенезу та шляхів передачі інфекції [17, 37, 84].

Таблиця 1. Характеристика деяких технологій, які дозволяють виявляти маркери коронавірусної хвороби COVID-19

Table 1 Characteristics of some technologies which allow to detect coronavirus disease COVID-19 markers

Починаючи з першої публікації послідовності геному нового корона- вірусу, почалася розробка діагностичних тестів для виявлення РНК вірусу SARS-CoV-2 на основі технологій ампліфікації нуклеїнових кислот (nucleic acid amplification tests, NAAT). Більшість наявних протоколів засновані на по- лімеразній ланцюговій реакції зі зворотною транскрипцією в реальному часі (рЗТ-ПЛР) (real-time reverse transcription polymerase chain reaction, rRT- PCR) та спрямовані на детекцію загально визначених генів-мішеней в різних комбінаціях [62, 91, 127]. Теоретичний поріг виявлення вірусу SARS-CoV-2 методом рЗТ-ПЛР становить < 10 копій/тест, що дозволяє здійснювати ранню діагностику навіть при низьких титрах вірусу [29].

Ген Е (мішень upE) є найбільш консервативним регіоном в геномі вірусу SARS-CoV-2, через що його детекцію рекомендують використовувати як скринінговий інструмент першої лінії [67]. Наступними за рівнем консервативності є гени М та N [88]. Послідовність ORF1a та ген S є більш консервативними, ніж ділянка ORF1b [67]. Використання гену N як мішені дозволило підвищити чутливість рЗТ-ПЛР на порядок та в середньому в 4 рази в порівнянні з використанням послідовності ORF1b [29] та гену S відповідно [88]. Використання як мішені генів RdRp/Hel забезпечило підвищення чутливості та специфічності реакції за рахунок виключення перехресної реактивності з іншими поширеними респіраторними вірусами та дозволило виявляти інфікування вірусом SARS-CoV-2 у хворих на COVID-19 навіть при низькому вірусному навантаженні [100].

Для підвищення чутливості молекулярно-генетичних методів використовують як мінімум дві специфічні вірусні мішені. Проте, слід враховувати, що недостатня специфічність праймерів у мультиплексній системі рЗТ- ПЛР може призвести до їх перешкоджання один одному, тим самим знижуючи ефективність ампліфікації та чутливість системи [12, 31]. Вірус SARS-CoV-2 як представник РНК-вірусів з позитивною полярністю має високий рівень мутацій, що пояснюється недоліком коректувальної активності полімерази [91]. Така властивість ускладнює дизайн праймерів та зондів для рЗТ-ПЛР [127].

Виходячи з високої чутливості рЗТ-ПЛР, в умовах масового обстеження в певних регіонах або в групах осіб з низьким рівнем інфікування, потенційно ефективною стратегією використання ресурсів є тестування до п'яти зразків, об'єднаних в пули [12, 86]. Розроблено високочутливий та специфічний метод виявлення РНК вірусу SARS-CoV-2 на основі гніздової (nested) рЗТ-ПЛР в одній реакційній суміші. Підвищена чутливість даної реакції дозволяє використовувати її для скринінгового тестування слини та аналізу зразків об'єднаних в пули, що є актуальним під час масового тестування [124].

У діагностиці COVID-19 за допомогою рЗТ-ПЛР є вірогідність отримати хибні результати, що пов'язані з багатьма чинниками як преаналітичного, так і аналітичного етапів дослідження [12, 62, 91] (табл. 2).

Таблиця 2. Ймовірні причини отримання хибних результатів на різних етапах рЗТ-ПЛР

Table 2. Probable reasons for getting incorrect results at different stages of rRT-PCR

Крім того, слід враховувати вплив на чутливість процедур інактивації вірусу SARS-CoV-2 (термічної та хімічної), які можуть застосовуватися перед тестуванням з метою зниження ризику інфікування персоналу під час аналізу. Виділена з лізованих вірусів РНК може деградувати через розрив хімічних зв'язків, спричинений високою температурою при тепловій інактивації [81].

Хибнопозитивні результати також можуть бути отримані в результаті перехресної реактивності праймерів з нуклеїновими кислотами інших мікроорганізмів. Ще однією причиною хибнопозитивних результатів являється контамінація, яка пов'язана з великою завантаженістю лабораторій і одночасною обробкою великої кількості зразків [31].

Для виключення хибнонегативних результатів при діагностиці COVID-19 дослідження кожного зразка супроводжує внутрішній контроль, який підтверджує якість відбору та пробопідготовки РНК та відсутність інгібування ампліфікації. Внутрішній контроль може бути ендогенним, коли генетична мішень міститься в самому біологічному матеріалі, або екзогенним, який додається в процесі аналізу. Найчастіше при діагностиці COVID-19 методом рЗТ-ПЛР як ендогенний контроль використовують ген рибонуклеази Р (RNAse P) людини [7, 62].

Слід підкреслити, що результат дослідження може залежати від типу та терміну відбору біологічного матеріалу. Так, у 93% пацієнтів, які спочатку отримали негативний результат рЗТ-ПЛР, РНК вірусу SARS-CoV-2 була виявлена в середньому протягом наступних 5,1±1,5 днів, що, можливо, пов'язане зі зміною рівня вірусного навантаженням [62]. Описані випадки, коли при негативному результаті дослідження зразків з верхніх дихальних шляхів на наявність РНК коронавірусу, було отримано позитивний результат для зразків фекалій [97]. Концентрація вірусу SARS-CoV-2 в зразках з нижніх дихальних шляхів є вищою, ніж в інших біологічних матеріалах [100], але через інвазивність процедури відбору та підвищену небезпеку для медичного персоналу внаслідок утворення аерозолю тестування зразків з нижнього респіраторного тракту застосовується лише в випадках отримання негативних результатів при дослідженнях біологічного матеріалу з верхніх дихальних шляхів у пацієнтів з високою ймовірністю захворювання на COVID-19 [12]. Разом з цим, виявлення РНК вірусу не обов'язково корелює з активною реплікацією життєздатного вірусу. Виходячи з вище викладеного, необхідно усвідомлювати, що негативний результат не виключає захворювання на COVID-19, однак позитивний результат тесту може бути використаний для постановки діагнозу, якщо він підтверджується клінічними та / або епідеміологічними даними [62].

Незважаючи на те, що наявні в даний час діагностичні тести на основі рЗТ-ПЛР не забезпечують достатньої надійності, оскільки виявляють не всі випадки інфекції [62, 96, 139], цей метод досі залишається «золотим» стандартом етіологічної діагностики COVID-19 [116].

Наявність багатьох обмежень рЗТ-ПЛР, що особливо помітно в умовах пандемії, сприяє пошуку альтернативних методів діагностики, які були б більш швидкими, дешевшими та могли б виконуватися в лабораторіях з обмеженими ресурсами [6]. Тому, на сьогоднішній день зростає інтерес до діагностичних тестів на основі NAAT, наприклад, таких, які не потребують екстракції та очищення РНК і можуть бути використані безпосередньо в пунктах надання медичної допомоги (point of care, POC) та дозволяють отримати результат через 30-90 хвилин [7, 12], що особливо важливо, коли потрібно терміново встановити етіологію захворювання.

Перспективними вважаються розробки на основі технологій ізотермічної ампліфікації нуклеїнових кислот, найбільш поширеною з яких є петлева ізотермічна ампліфікація зі зворотною транскрипцією (reverse transcription and loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP) [127].

На відміну від рЗТ-ПЛР, яка здійснюється в умовах циклічної зміни температури, RT-LAMP проводиться при постійній температурі (60-65 °C), а тривалість ампліфікації становить лише 30 хвилин. Інша перевага RT-LAMP перед рЗТ-ПЛР полягає в тому, що завдяки набагато більшій кількості амп- ліфікованої ДНК (до 10⁹ копій специфічних таргетних послідовностей [94]) результат тесту може обліковуватися візуально [7, 24, 31, 74].

У LAMP-технології використовується ДНК-полімераза Bacillus stearothermophilus (Bst), що має активність полімерази та зворотної тран- скриптази [24], та, зазвичай, три пари праймерів, два з яких - прямий та зворотній, утворюють петлі при відпалі на внутрішній ділянці таргетної послідовності [6, 74]. Вважається, що RT-LAMP є надзвичайно специфічним методом, оскільки в реакції використовується 4-6 пар праймерів для ідентифікації шести-восьми різних ділянок цільової ДНК [123, 135].

Незважаючи на те, що дизайн праймерів для RT-LAMP складніший, ніж для рЗТ-ПЛР, цей метод більш толерантний до присутності інгібіторів і придатний для тестування необроблених зразків [94].

Метод RT-LAMP успішно використовується для детекції вірусу SARS- CoV-2 у сечі, мазках з рото- та носоглотки [129]. Зручність та швидкість цього методу також зумовлені можливістю використовувати як біоматеріал слину, що дозволяє пацієнтам самостійно відбирати зразки, дослідження яких можуть виконуватися без етапу екстракції РНК та за межами оснащеної лабораторії (пряма RT-LAMP) [7, 72]. Проте, при відсутності етапу екстракції РНК відмічається зниження чутливості RT-LAMP в порівнянні з рЗТ-ПЛР, тоді як тестування виділеної РНК показало чудові результати [35]. Дослідження клінічних зразків методом RT-LAMP показали високі рівні специфічності (80%- 100%) та чутливості (83%-100%) при застосуванні методики рЗТ-ПЛР як під- тверджувальної [24, 77]. У порівнянні з рЗТ-ПЛР метод RT-LAMP для детекції гену ORF1ab характеризується чутливістю більше 97% [132]. Іншими дослідниками показано, що RT-LAMP та рЗТ-ПЛР мають однакову чутливість (1000 копій/мл) і можуть виявляти РНК вірусу SARS-CoV-2 в зразках, розведених у 20 разів [123]. За іншими даними чутливість RT-LAMP є на порядок нижчою, ніж рЗТ-ПЛР [7, 35]. Склад біологічного матеріалу може впливати на ефективність ампліфікації, про що свідчить необхідність подовження тривалості ампліфікації у прямій RT-LAMP, в якій відсутня стадія екстракції РНК [129].

Для детекції продуктів ампліфікації RT-LAMP використовуються різні методи: агарозний гель-електрофорез, колориметричні системи з візуальною детекцією, флуориметрія в режимі реального часу (SYBR Green I), турбидіме- трія або візуальна оцінка помутніння [6, 24].

Вважається, що поєднання методу RT-LAMP з іншими інноваційними технологіями здатне підвищити його ефективність [24]. Розроблено інкубаційну камеру, сконструйовану за допомогою 3D-принтера, для проведення реакції RT-LAMP, що дозволяє виявляти вірус SARS-CoV-2, у найпоширенішій формі комерційно доступних мікропробірок - пробірках типу Eppendorf [43].

Сконструйована система повної автоматизації LAMP - Simprova, яка складається з центрального блоку, що контролює всю систему, блоку попередньої обробки, де відбувається виділення нуклеїнової кислоти із зразків, а також компоненту LAMP для ампліфікації та детекції [126]. Є дані про розробку на основі технології LAMP методу з використанням штучного інтелекту (artificial intelligence-assisted loop mediated isothermal amplification, АІ-LAMP) [90].

Запропоновано заснований на LAMP метод, який поєднується з процесом швидкого аналізу послідовності в режимі реального часу з використанням нанопори Flongle. Цей метод може застосовуватися як в лабораторії, так і в польових умовах, та дозволяє ідентифікувати РНК вірусу SARS-CoV-2 за 30 хвилин [24].

Для спрощення процедур RT-LAMP застосовуються різні підходи: проведення всіх етапів реакції в одній пробірці, використання для детекції продуктів ампліфікації біосенсорів на основі наночастинок, включення етапу обробки сухих мазків магнітними часточками для збільшення виходу вірусної РНК [6, 127].

Інтеграція методу RT-LAMP з оптичними системами, системами, основаними на наноматеріалах, та передовими інформаційними технологіями сприяє розробці швидких, чутливих, специфічних та економічно ефективних методів специфічної діагностики COVID-19 [6].

Розробляються методи на основі полімеразної рекомбіназної ампліфікації (recombinase polymerase amplification, RPA) - ізотермічної реакції, яка відбувається при температурі (37-42 °C), та зарекомендувала себе як високо чутлива для виявлення вірусів [55].

Інші методи специфічної діагностики COVID-19, що стрімко розвиваються, основані на технології CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats - короткі паліндромні повтори, регулярно розташовані групами) [62]. Дана технологія використовує різні Cas-ензими, які розпізнають та зв'язуються зі специфічними послідовностями цільових РНК з наступним неспецифічним розщепленням ендонуклеазою нецільової РНК та репортерних зондів, що призводить до підсилення сигналу флуоресценції [31]. Технологія CRISPR-Cas разом з рЗТ-ПЛР та секвенуванням нового покоління використовувалася для підтвердження першого завізного випадку COVID-19 в Шанхаї [1]

Перевагами технології CRISPR-Cas в порівнянні з рЗТ-ПЛР є більша чутливість, специфічність, швидкість та простота виконання [44, 104]. Розроблено тест, якій може виявляти 10 копій вірусу SARS-CoV-2 за 45 хвилин без спеціального обладнання, та демонструє добру узгодженість з рЗТ-ПЛР. В аналізі використовуються розроблені авторами білок Cas12a, специфічний до вірусу SARS-CoV-2, CRISPR-РНК та одноланцюговий ДНК-репортер, мічений молекулою зеленого флуоресцентного гасителя. При наявності в системі РНК вірусу SARS-CoV-2 протеїн Cas12a розщепляє молекулу ДНК-репортеру, в результаті чого випромінюється зелений флуоресцентний сигнал, який можна побачити неозброєним оком в промені з довжиною хвилі 485 нм. Дана технологія забезпечує надійний та зрозумілий метод діагностики на місці надання медичної допомоги [104].

Методика SHERLOCK (Specific High Enzymatic Reporter unLOCKing - розблокування специфічного високочутливого ферментативного репортера), в якій технологія CRISPR-Cas13a поєднана з LAMP [31], дозволяє отримувати результат через 40-70 хвилин [7].

Розроблено швидкий, простий та точний аналіз, який об'єднує технології CRISPR-Cas12 та RT-LAMP, для виявлення вірусу SARS-CoV-2 в екстрактах РНК з мазків з дихальних шляхів. Даний метод, який отримав назву DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR transreporter - ДНК-ен- донуклеазно-орієнтований CRISPR-трансрепортер), продемонстрував 95% позитивну прогностичну узгодженість та 100% негативну прогностичну узгодженість з рЗТ-ПЛР [14, 24]. Аналіз проводиться шляхом занурення тест-смужки в розчин виділеної РНК, а результат обліковується візуально через 30-40 хвилин. Разом з цим, слід зазначити, що тести на основі CRISPR- Cas не враховують мутації в вірусному геномі та процес редагування РНК у клітинах людини [76].

За допомогою іншої інноваційної технології - DNHCR (DNA nanoscaffold hybrid chain reaction - ланцюгова реакція з гібридними ДНК-наночастка- ми), результати дослідження зразків слини можливо отримати протягом 10 хвилин. Проведені дослідження дозволяють припускати, що цей підхід характеризується високою чутливістю при виявленні вірусів [7].

Поверхнево-посилена раманівська спектроскопія (Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) виникла як потужна аналітична методика для молекулярного аналізу (секвенування ДНК та детекції вірусних антигенів), яка може бути особливо вигідною для діагностичних цілей у поєднанні з невід'ємними оптичними та хімічними властивостями наночастинок плазмонів [46, 85]. SERS кидає виклик сучасним флуоресцентним методам детекції як з погляду чутливості, так і, що ще важливіше, можливості одночасного виявлення різних компонентів у суміші, що стає все більш бажаним для клінічної діагностики [46, 105]. Окрім того, цей метод можна пристосувати для використання в місцях надання медичної допомоги [47, 85, 121]. Перша розробка на основі технології SERS показала 92,5% чутливість та 88,8% специфічність для виявлення РНК вірусу SARS-CoV-2 в слині, що дозволило авторам запропонувати її використання в польових умовах з наступним підтвердженням позитивних результатів в лабораторії молекулярно-генетичними методами, такими як рЗТ-ПЛР [33].

Крім молекулярно-генетичних методів, для виявлення гострої інфекції COVID-19 застосовуються імунологічні методи, які детектують антигени вірусу SARS-CoV-2 (найчастіше нуклеокапсид) в респіраторних зразках. Серед них найпоширенішими є швидкі діагностичні тести для детекції антигенів, які доцільно використовувати, коли рівень вірусного навантаження найвищий, а пацієнти представляють найбільшу небезпеку для оточуючих - зазвичай за 1-3 дні до появи симптомів та протягом перших 5-7 днів захворювання [114]. Більшість швидких тестів засновані на імунохроматографії, але також розроблені тести, в яких застосовуються інші технології, наприклад, мікрорідинний імунофлуоресцентний аналіз (microfluidic immunofluorescence assay) [10, 56]. У порівнянні з рЗТ-ПЛР швидкі тести мають нижчу чутливість, що призводить до отримання негативних результатів у зразках з Ct < 30-35 [115]. Оцінювання 4-х швидких тестів з використанням 100 клінічних зразків у порівнянні з рЗТ-ПЛР та ізоляцією вірусу на культури клітин показало, що загальна чутливість швидких тестів для зразків, позитивних в рЗТ-ПЛР, коливалася від 24,3% до 50%. Однак для зразків з вірусним навантаженням більше 6 log₁₀ копій РНК/мл, яке, як правило, спостерігається у осіб, які виділяють інфекційний вірус, чутливість швидких тестів становила від 81,8% до 100%. Швидкі тести демонструють більш значну кореляцію з методом ізоляції вірусу на культурах клітин (61,8-82,4%) [56]. При порівнянні з ампліфікаційними технологіями, один з імунофлуоресцентних швидких тестів продемонстрував співпадіння результатів у 82,0% симптоматичних пацієнтів при обстеженні у перші 5 днів після початку захворювання та у 54,5% - з шостого дня після появи симптомів [10]. Отже, негативні результати швидких тестів не можуть повністю виключати інфікування вірусом SARS-CoV-2. У цій ситуації слід проводити повторне тестування за допомогою молекулярно-генетичних методів, особливо у пацієнтів із симптомами захворювання. Крім того, негативні результати швидких тестів не повинні бути підставою для зняття карантинних обмежень. Разом з цим, позитивні результати у безсимптомних осіб можуть бути корисними для швидкого відстеження контактів [115].

Інші методи детекції антигенів вірусу SARS-CoV-2 не використовуються в клінічній діагностиці, але успішно застосовуються для вивчення інших аспектів COVID-19. За допомогою імуногістохімії вдалося виявити білки S та N вірусу SARS-CoV-2 в плаценті хворої на COVID-19 жінки, що підтвердило можливість вертикальної передачі вірусу SARS-CoV-2 новонародженому, у якого незабаром після народження розвинулася пневмонія, а захворювання на COVID-19 було підтверджено детекцією вірусної РНК [37].

Розроблені на основі імуноферментного аналізу (ІФА) тест-системи, які дозволяють виявляти вірусні білки S та N, використовуються переважно в наукових дослідженнях, а не для клінічної діагностики [101].

Методи виявлення антитіл до вірусу SARS-CoV-2

Тести для детекції антитіл до вірусу SARS-CoV-2 виявляють гуморальну імунну відповідь організму, яка розвивається в середній та пізній стадіях захворювання [120]. На відміну від методів детекції РНК або антигенів вірусу SARS-CoV-2, які переважно застосовуються для етіологічного підтвердження діагнозу, серологічні тести дозволяють виявляти паст-інфекцію, відстежувати контакти, ідентифікувати донорів для терапії плазмою реконвалесцентів (з обов'язковим наступним визначенням титрів у реакції нейтралізації (РН)), з'ясовувати ступінь ураження певної популяції, оцінювати ефективність вакцинації [8, 9]. Серологічне тестування може бути доречним для діагностики у пацієнтів із пізніми ускладненнями COVID-19, наприклад, такими як мультисистемний запальний синдром (MIS-C) у дітей [109]. Крім того, тести для визначення антитіл застосовуються як додаткові у хворих з негативним чи невизначеним результатом ПЛР (наприклад, при пізньому зверненні) [8, 48, 78, 87, 134].

Поєднання рЗТ-ПЛР та методів виявлення антитіл (IgM та IgG) може бути потужною стратегією для підвищення клінічної чутливості діагностики інфекції, спричиненої вірусом SARS-CoV-2, особливо після другого тижня захворювання [41].

Слід ще раз підкреслити, що серологічні тести не призначені для виявлення інфікування на ранній стадії. Крім того, відсутні докази, що вони можуть бути корисними для встановлення імунного статусу, передбачення сприйнятливості до реінфекції (шляхом визначення захисного титру) та скринінгу донорської крові з метою виявлення зараження вірусом SARS- CoV-2 [9]. Деякі дослідники вважають, що відстеження динаміки антитіл до різних антигенів вірусу може бути корисним для прогнозування перебігу COVID-19 [58].

Разом з цим, стійкість та кінетика антитіл до вірусу SARS-CoV-2 (титри яких знижуються та зникають з часом) можуть призвести до недооцінки рівня ураження вірусом SARS-CoV-2 певних груп населення, що є особливо важливим при дослідженнях серопревалентності. Крім того, отримання позитивного результату при серологічному тестуванні не обов'язково свідчить про неінфекційність особи, особливо коли визначають антитіла, які не мають нейтралізувальних властивостей [5, 66, 108].

Використання імунологічних тестів стає доцільним приблизно через 15-21 день після зараження [32]. У зв'язку з тим, що різні ізотипи антитіл до вірусу SARS-CoV-2 (IgA, IgM та IgG) синтезуються майже одночасно [65, 69], а динаміка IgM та IgA при COVID-19 недостатньо зрозуміла [48, 137], детекція IgA та IgM немає очевидної клінічної переваги перед детекцією IgG. Сумнівною також залишається корисність виявлення IgA та IgM для диференціації недавнього та минулого зараження.

На відміну від високо специфічної рЗТ-ПЛР, перехресна реактивність є великою проблемою тестів для виявлення антитіл до вірусу SARS-CoV-2, враховуючи, що існує шість інших коронавірусів людини. Основні комерційні імунологічні тести націлені на антитіла до епітопів білків S або N, причому деякі реакції фокусуються на субодиниці S1, що, як вважається, забезпечує підвищену специфічність та кращу кореляцію з нейтралізувальними антитілами [51, 71, 75, 119]. Але потрібні додаткові дослідження, щоб визначити, як комерційні тести корелюють з РН для виявлення антитіл до вірусу SARS-CoV-2. Порівняння результатів чотирьох різних серологічних тестів для всебічної оцінки перехресної реактивності між сироватками крові хворих на COVID-19 та тяжкий гострий респіраторний синдром (ТГРС), спричинений вірусом SARS-CoV-1, показало значну перехресну реактивність при використанні в тесті білка N будь-якого з двох вірусів. Тести, в яких як антигени застосовуються області S1 або рецептор-зв'язувальний домен (receptor-binding domain, RBD) білка S, показують кращу специфічність. Виявлено, що всі, хто переніс ТГРС, мають значний рівень антитіл, які залишаються в крові навіть через 17 років після зараження. Титри антитіл проти білка N знижуються більше, ніж антитіл до RBD білка S, що, як відомо, відіграють більш важливу роль у забезпеченні протективного імунітету [27]. Не всі антитіла, що зв'язуються з антигенами вірусу SARS-CoV-2, мають вірус- нейтралізувальні властивості, але існує широкий спектр кореляційних зв'язків між зв'язувальною та нейтралізувальною активністю [40, 51, 71].

Для уникнення хибнопозитивних та хибнонегативних результатів, важливо, щоб клінічна чутливість та специфічність тестів для виявлення антитіл до вірусу SARS-CoV-2 були якомога вищими. Чутливість тестів може виявитися недостатньою при обстеженні осіб зі зниженою імунною реакцією (наприклад, з ослабленим імунітетом, людей похилого віку тощо) та осіб із легким перебігом захворювання, коли титри антитіл можуть бути занадто низькими, щоб їх можна було виявити. На специфічність тестів можуть впливати такі загальні чинники, як ревматоїдний, антитіла до інших вірусів, включаючи ендемічні коронавіруси, антитіла до антигенів тварин, моноклональні антитіла тощо. Зростає кількість досліджень, спрямованих на оцінювання діагностичної точності тестів на різних стадіях інфекції та визначення чинників, що призводять до хибнопозитивних та хибнонегативних результатів при безсимптомній, легкій та важкій формах COVID-19 [25, 51, 71, 83, 98, 107].

Найбільш специфічним та дуже чутливим методом для виявлення противірусних антитіл є реакція нейтралізації (РН), за допомогою якої можна оцінити протективну функцію антитіл, що проявляється в нейтралізації вірусу та пригніченні його реплікації [54]. Цей метод є дуже важливим, оскільки багато антигенів можуть бути спільними для споріднених груп вірусів, але лише деякі з цих антигенів є вірусоспецифічними [82]. Визначення титрів нейтралізувальних антитіл може бути корисним для оцінки рівня захисту при скринінгу реконвалесцентної плазми та при оцінці ефективності вакцин проти SARS-CoV-2. Незважаючи на те, що РН вважається «золотим» стандартом для виявлення протективних антитіл, вона характеризується низькою пропускною здатністю та тривалістю, а для її проведення потрібний висококваліфікований персонал та лабораторії рівня біологічної безпеки 3 (BSL-3). Тому РН непридатна для використання в рутинній клінічній діагностиці [102, 116]. Уникнути необхідності проведення досліджень в умовах підвищеної біобезпеки дозволяє використання в РН замість живих вірусів псевдовірусів. Розроблений та валідований тест на основі псевдовірусу є більш зручним та продемонстрував виражену реакцію з антитілами проти вірусу SARS-CoV-2 сироваток крові реконвалесцентів. Це підкреслює майбутній потенціал РН з псевдовірусами у вивченні та диференціації нейтралізувальних антитіл, які в основному націлені на рецептор-зв'язувальний домен (RBD) білку S, в той час як інші імунологічні тести спрямовані на виявлення антитіл до вірусних білків N та M [73]. Потрібні подальші дослідження, щоб зрозуміти, як результати інших імунологічних тестів корелюють з титрами нейтралізувальних антитіл та чи можна вважати, що нейтралізувальні антитіла складають основу імунного захисту [3, 20, 23].

За винятком РН, серологічні тести виконуються відносно легко і вимагають меншої технічної експертизи та більш простого та дешевого обладнання в порівнянні з технологіями, основаними на виявленні нуклеїнових кислот [133].

Серед методів детекції антитіл до вірусу SARS-CoV-2, найбільш поширеним є імуноферментний аналіз (ІФА). Діагностична точність методу залежить від типу антигену, сорбованого в лунках планшету. Використання білка S - найбільш варіабельного та видоспецифічного, сприяє підвищенню точності результатів [97]. При використанні як антигену нуклеокапсидного білка N - найбільш консервативного серед бетакоронавірусів людини, можуть спостерігатися хибнопозитивні результати внаслідок перехресної реакції з іншими коронавірусами - MERS-CoV, SARS-CoV-1, ендемічними коронавірусами (HKU1, 229E, OC43, NL63), що, як відомо, викликають сезонну застуду [95, 106]. Продемонстроване успішне виявлення IgM та IgG проти вірусу SARS-CoV-2 на ранніх стадіях COVID-19 з використанням ІФА на основі білка N вірусу кажанів SARSr-CoV Rp3 [138].

Необхідність у проведенні регулярних серологічних досліджень для виявлення імунних осіб серед певних груп населення та визначення рівня популяційного імунітету спонукала до широкого впровадження автоматизації. Автоматизовані платформи забезпечують високу пропускну здатність та точність результатів. На відміну від більшості діагностичних систем на основі ІФА, в яких використовують стандартний 96-луночний планшет як тверду фазу та стандартний спектрофотометричний/колориметричний метод детекції сигналу, в автоматизованому аналізі матеріалами твердої фази можуть бути полістирол (PS-COOH) або наночастинки на металевій основі (магнітні наногранули). Крім того, в автоматизованих системах зазвичай застосовуються більш чутливі системи детекції, такі як технологія хемілюмінесценції [130]. Проте, навіть такі імунологічні тести є недостатньо ефективними у порівнянні з рЗТ-ПЛР. Розроблений хемілюмінесцентний аналіз на основі синтетичних пептидів, які представляють епітопи білків orf1a/b, S і N, здатний виявляти IgG та IgM в сироватках крові у 71,4% та 57,2% пацієнтів з діагнозом, підтвердженим в рЗТ-ПЛР, відповідно. Авторами пропонується поєднання даного імунологічного аналізу з рЗТ-ПЛР для підвищення точності діагностики COVID-19 [19].

За відсутності лабораторних умов для проведення таких серологічних реакцій як ІФА, рекомендовано використовувати швидкі діагностичні тести для детекції антитіл. Як і при детекції антигенів, перевагами швидких тестів для виявлення антитіл є простота виконання та можливість проведення тестування в пунктах надання медичної допомоги. Більшість швидких тестів є якісними та засновані на технології імунохроматографії, якій не вистачає точності лабораторних систем [32, 36, 63]. В інших тестах застосовується імунофлуоресценція або імунологічні реакції з колоїдним золотом [50, 80]. Для проведення тесту достатньо 10 мкл сироватки, а його тривалість становить 15 хвилин [50]. Оцінювання точності швидких тестів, як правило, проводять шляхом порівняння з рЗТ-ПЛР. При дослідженні зразків від 525 пацієнтів імунохроматографічним швидким тестом чутливість складала 89%, а специфічність - 91% [59]. При обстеженні 191 пацієнта у 70 (36,6%) була виявлена РНК вірусу SARS-CoV-2, тоді як у 34 (17,3%) антитіла до вірусу. Крім того, 13 (6,8%) обстежених, які отримали позитивний результат в серологічному тесті, мали негативний результат рЗТ-ПЛР. Цей швидкий тест мав чутливість 30% та специфічність 89% порівняно зі стандартним аналізом рЗТ-ПЛР [80].

Результати клінічних випробувань швидкого тесту з колоїдним золотом показали, що при виявленні IgM його чутливість становила 79,0%, а специфічність - 99,7%; при виявленні IgG ці показники дорівнювали 84,3% та 99,4% відповідно. Загальна чутливість виявлення IgM та IgG становила 90,6%, а специфічність - 99,2% [50]. При визначенні діагностичної точності іншого швидкого тесту в порівнянні з реакцією імунофлуоресценції (РІФ) та ІФА, його чутливість складала 88% (95% довірчий інтервал (95%CI): 70-96), а специфічність - 98% (95%CI: 90-100) [4]. На даний момент недостатньо доказів, які підтверджують можливість використання швидких тестів для виявлення антитіл до вірусу SARS-CoV-2 як альтернативи традиційним лабораторним системам [125].

Узагальнення

Пандемія COVID-19 висвітлила вирішальну роль специфічної діагностики в контролі над інфекційними захворюваннями. Наявність сталих діагностичних технологій, на розробку та оптимізацію яких пішли десятки років, швидка ідентифікація та розшифрування геному вірусу SARS-CoV-2 - збудника інфекції, дозволили швидко розробити методики детекції вірусної РНК на основі технологій ампліфікації нуклеїнових кислот (NAAT), а також різноманітні імунологічні тести, які характеризуються достатньо високими рівнями чутливості та специфічності.

Тестування методом рЗТ-ПЛР зразків із респіраторних шляхів досі залишається «золотим» стандартом діагностики COVID-19. Даний підхід дозволяє отримувати найбільш точні результати та підтверджувати діагноз вже на ранній стадії захворювання. Використання більш простих та зручних швидких діагностичних тестів, які можуть застосовуватись в пунктах надання медичної допомоги, обмежено через їх недостатню чутливість у порівнянні з рЗТ-ПЛР. Серологічні імунологічні реакції для визначення антитіл - пізніх маркерів інфекції, можуть бути корисними лише як доповнення до молекулярно-генетичних технологій, що застосовуються для діагностики COVID-19.

Разом з цим, за наявності різноманітних обмежень, які властиві всім без виключення діагностичним методам, перспективними залишаються розробки, спрямовані на отримання достовірних та швидких результатів з використанням методів з високою пропускної здатністю. З цією метою проводиться удосконалення існуючих методів, спрямоване на підвищення аналітичної чутливості та специфічності, зменшення тривалості аналізу за рахунок тестування нативних зразків методами NAAT (без проміжного етапу екстракції РНК), впровадження повної автоматизації усіх етапів дослідження. З іншого боку створюються тести на основі альтернативних технологій (RT- LAMP, CRISPR-Cas, SERS тощо), які більш прості у виконанні та можуть застосуватися за межами спеціалізованих лабораторій.

Е.Н. Гуменюк, Д.А. Дубина, О.А. Юрченко

ГУ «Украинский научно-исследовательский противочумный институт имени И. И. Мечникова МЗ Украины»

КОРОНАВИРУСНАЯ БОЛЕЗНЬ (COVID-19). ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

Реферат

Пандемия коронавирусной болезни (COVID-19), которая стартовала в конце 2019 года в Китае, стала непредсказуемым вызовом для системы здравоохранения абсолютно всех стран мира. Среди проблем, которые требовали немедленного решения, стало налаживание массовой специфической диа- гностики эмерджентной инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2. В данном обзоре представлены технологии, применяемые для специфической диагностики COVID-19. Обсуждаются преимущества и ограничения наиболее распространенных методологий, направленных на выявление возбудителя или специфических к нему антител. Выявление фрагментов генома вируса с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (рОТ-ПЦР) позволило достичь высокой точности диагностики. С самого начала пандемии и до сих пор этот метод считается «золотым» стандартом, несмотря на ограничения, связанные с его высокой стоимостью, трудоемкостью и необходимостью проведения исследований в специализированных лабораториях. Более дешевые иммунологические методы имеют недостаточную диагностическую эффективность и могут использоваться только как дополнение к молекулярному тестированию. В обзоре также представлены перспективные методы специфической диагностики COVID-19, которые основаны на молекулярно-генетических технологиях, характеризуются простотой и быстротой выполнения, не требуют дорогостоящего оборудования и могут выполняться в пунктах оказания медицинской помощи.

Ключевые слова: вирус SARS-CoV-2, специфическая диагностика, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени (рОТ-ПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА), быстрые диагностические тесты.

K.M. Gumeniuk, D.O. Dubyna, O.O. Yurchenko

SB"Mechnikov Ukrainian Research Anti-Plague Institute of the Ministry of Health of Ukraine"

CORONAVIRUS DISEASE (COVID-19). CHALLENGES AND PROSPECTS OF SPECIFIC DIAGNOSTICS

Summary

The coronavirus disease (COVID-19) pandemic, which started in the late 2019 in China, has become an unforeseen challenge to the health care system of all the countries in the world. Establishment of a mass specific diagnostics of emergent infection caused by the coronavirus SARS-CoV-2 was one of the problems that needed immediate solution. This review presents the technologies used for the specific diagnostics of COVID-19. The advantages and limitations of the most common methodologies for detection of the pathogen or virus-specific antibodies are discussed. Detection of the virus genome fragments by reverse transcription and real-time polymerase chain reaction (rRT-PCR) allowed to achieve high accuracy of diagnosis. From the beginning of the pandemic, this method has been considered as the "gold" standard, despite the limitations associated with its high cost, complexity and the need for testing in specialized laboratories. Cheaper immunological methods have insufficient diagnostic efficiency and can be used only as complements to molecular testing. The review also presents promising methods of specific diagnostics of COVID-19 which are based on molecular genetic technologies, characterized by simplicity and rapidity, do not require expensive equipment and can be performed in points of care.