Морфофункциональные маркеры эффективности стимуляции пролиферации клеточного пула слизистой носа у больных полипозным риносинуситом

Размещено на http://allbest.ru

Морфофункциональные маркеры эффективности стимуляции пролиферации клеточного пула слизистой носа у больных полипозным риносинуситом

Л.С. Бакулина¹, Д.Ю. Бугримов², О.В. Лидохова³, О.В. Кашаева⁴

Аннотация. Актуальность и цели. Проведено изучение возможных патоморфологических и патофизиологических механизмов эффективного лечения полипозного риносинусита. Материалы и методы. Объектом исследования были пациенты с диагнозом двустороннего полипозного риносинусита, пациентам проводился иммуногистохимический анализ экспрессии TLR9 с помощью моноклональных антител в биопсийном постоперационном материале (двукратно: до лечения и спустя 20 сут после) и цитологическое исследование мазков-перепечатков со слизистой носа с окрашиванием по Романовскому Гимзе (иммерсионная микроскопия 7*90). Результаты. Установлены индивидуальные особенности состояния пролиферативной активности эпителиального пула слизистой носа и патологической полипозной ткани в ответ на комплексную иммунокорректирующую терапию. Выводы. Полученные результаты позволяют включать иммунокорректирующую терапию в комплексное лечение полипозного риносинусита для сокращения возможных рецидивов патологии.

Ключевые слова: полип, экспрессия TLR9, риносинусит, патоморфологические маркеры

Morphofunctional markers of the efficiency stimulated by the pool proliferation of the nasal mucosa cells in patients with polyposis rhinosinusitis

L.S. Bakulina¹, D.Yu. Bugrimov², O.V. Lidokhova³, O.V. Kashaeva⁴

Abstract. Background. The article highlights potential pathomorphological and pathophysiological mechanisms of effective treatment of polypous rhinosinusitis. Materials and methods. The study included patients diagnosed with bilateral polyposis rhinosinusitis, who were conducted immunohistochemical analysis of TLR9 expression using monoclonal antibodies in biopsy postoperative material (twice: prior to treatment and 20 days after treatment), and cytological examination of nasal reprint smears stained by Romanovsky-Giemsa method (immersion microscopy 7*90). Results. The study detected individual features of the proliferative activity of the epithelial pool of the nasal mucosa and pathological polyposis tissue in response to complex immunocorrective therapy. Conclusions. The results obtained allow including immunocorrective therapy in the complex treatment of polyposis rhinosinusitis to reduce possible relapses of the pathology.

Keywords: polyp, TLR9 expression, rhinosinusitis, pathological markers

лечение полипозный риносинусит моноклональные антитела

Ежегодно во всем мире каждый десятый случай хронического риносинусита приводит к гиперпластической трансформации эпителиальной ткани, в основе которой лежит нарушение местного иммунного и клеточного паритета слизистой полости носа, проявляющегося гиперпродукцией тучными клетками и лимфоцитами целого каскада цитокинов и интерлейкинов (IL-5, IL-13 и др.). Подобная реактивность является стимулом к повышению пролиферативного потенциала эпителиоцитов и, как следствие, к часто рецидивирующим доброкачественным гиперпластическим разрастаниям слизистой оболочки носа [3, 4]. Подобное мнение о патогенезе позволяет ряду исследователей, помимо «классического» хирургического лечения полипозных образований слизистой полости носа, применять и иммунокорректирующую терапию, основанную на индукции механизмов врожденного иммунитета. Одним из направлений реализации вышеуказанного патогенеза заболевания является анализ экспрессии группы рецепторов клеток врожденного иммунного ответа, известных как семейство PRRs (патоген-распознающих рецепторов), способных распознавать и связываться с антигенами патоген-ассоциированных молекулярных паттернов PAMPs [5]. Главным семейством PPRs, на которое возможно воздействие антигена, является Toll-подобные рецепторы (в частности TLR9). Триггером TLR9 является неметиллированная пара нуклеотидов цитозин-гуанин (мотив CpG) [5, 6], содержащаяся в основном действующем веществе раствора дезоксирибонуклеата натрия. Однако для уточнения механизма действия на уровне эпителиального пула клеток слизистой полости носа необходимо селективное изучение экспрессии TLR9 [3]. Для решения этой задачи была запланирована и выполнена настоящая работа, призванная оценить возможность снижения рецидивов гиперпластической трансформации ткани после хирургического лечения полипозного риносинусита у пациентов в комплексном применении дезоксирибонуклеата натрия, персонифицировать протоколы лечения с целью возможного полного излечения больного.

В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение морфофункциональных маркеров стимуляции пролиферативной активности эпителия слизистой полости носа при хирургическом лечении полипозного риносинусита и введении агониста TLR9 (дезоксирибонуклеата натрия).

Материалы и методы

Исследование проводили на базе Воронежской областной клинической больницы № 1. Объектом исследования были пациенты с диагнозом двустороннего полипозного риносинусита III и/или IV степени. Рандомизация пациентов в исследовании была следующей: основная группа (группа ОГ), пациентам которой проводилась хирургическая терапия патологии в сочетании со стандартным протоколом лечения в комбинации с инсуфляциями раствора дезоксирибонуклеата натрия (п = 30), и референсная группа (группа РГ) пациентам применялась только хирургическая терапия в сочетании со стандартным протоколом лечения (п = 30). Хирургическая терапия заключалась в эндоскопической (жесткий 0° и 30° эндоскоп 2,7 и 4 мм с анемизацией 0,1 % раствором адреналина) двусторонней полипотомии и/или полипосинусотомии. Стандартный протокол лечения включал в себя назначение в постоперационный период системной кортикостероидной терапии (дексаметазон внутривенно капельно 8-12 мг на 200 мл физиологического раствора 2 раза в сутки в течение 6 дней) и ирригационной терапии (1-2-кратное промывание носовых ходов изотоническим раствором через наложенные в ходе операции соустья). Инсуфляции раствора дезоксирибонуклеата натрия (0,25 % в форме спрея) проводились пациентам группы ОГ по 2 дозы в каждый носовой ход 3 раза в день в течение 20 дней. Во время исследования всем пациентам проводились инструментально-диагностические манипуляции. На период исследования всем пациентам двукратно приводились морфологическое и трехкратно цитологическое исследования операционного и биопсийного материала: первое исследование до начала лечения, второе исследование после начала лечения 20-е сут. Метод иммуногистохимического окрашивания TLR9 заключался в кофокусном иммуногистохимическом анализе экспрессии TLR9 с помощью моноклональных антител (Anti-TLR9 antibody[26C593.2] ab134368 (100 мкг) (производитель: CarlZeissMicroscopy, Германия). Тканевые образцы обрабатывались через систему АГТ11-ФМП 4 и иммуностейнер BenchMark XT. Демаскировка осуществлялась на приборе PTLink: буфер

En Vision FLEX Target Retrieval Solution high pH (50x) со временем нагрева 20 мин (t = 95 °С), визуализации гистофайн (414152F), время инкубации полимера 20 мин (t = 22-24 °С); хромоген Dako (K802(SM803)/20044820), инкубация (время/температура) 10 мин / 22-24 °С, без усиления. Морфометрия препаратов осуществлялась на микроскопе Olympus (серия BX2WI), аппаратно-программный комплекс для биологических исследований с системой документирования на основе прямого исследовательского микроскопа ZEISS Axio Imager.A2. Количественная оценка уровня экспрессии TLR9-ro3rn'™ных клеток, в биоматериале полипов слизистой носа проводилась с помощью количественного в среднем количестве экспрессии TLR9-позитивных клеток на поле зрения у каждого пациента с использованием объектива ^х40. Цитологическое исследование: метод мазков-перепечатков со слизистой носа (забор мазка ватным тампоном, смоченном в стерильном физиологическом растворе, на уровне нижних носовых раковин) с окрашиванием по Романовскому Гимзе. Микроскопию проводили под иммерсией при увеличении (7^Х90). В мазках-перепечатках определяли индекс деструкции клеток (ИДК), индекс модуляции клеток плоского эпителия (ИМК), средний показатель деструкции (СПД), индекс цитолиза клеток (ИЦК) [7]. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью методов вариационной статистики пакетов программ Ехсеl 2003, Statiatica 6.0, SPSS for Windows с использованием параметрических критериев. Достоверность определялась по критерию Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

До начала терапии у всех пациентов в мазках-перепечатках цитологическая картина слизистой полости носа характеризовалась относительным постоянством: эпителиальные пласты клеток были плотной структуры, сами клетки группировались в папиллярные конгломераты, в ряде полей зрения (3:1) отмечалось наличие сегментоядерных нейтрофилов и эозинофилов; ИЦК составил 0,04 у.е.; модуляция клеток плоского эпителия была низкой и составляла 0,26 у.е., наиболее мелкий класс деструкции доминировал в процентном соотношении относительно всего массива клеток с деструкцией, пикноморфные ядра не визуализировались (ИДК составил 0,72 у.е.), тинкториальных изменений не выявлено все это свидетельствовало о наличии слабого естественного репарационного процесса слизистой оболочки носа у пациентов до начала лечения (табл. 1).

Цитологическая характеристика мазков-перепечатков слизистой носа у пациентов в исследовании (у.е., М ± т)

Таблица 1

Примечание. * р < 0,05, n количество исследуемых в группе.

Спустя 20 сут. после начала лечения у пациентов группы ОГ прослеживалась четкая тенденция к постепенному уменьшению воспалительной реакции, появлению в воспалительном инфильтрате гистиоцитов и лимфоцитов, а также большого количества фибробластов, обнаруживалась более выраженная корнификация в клетках плоского эпителия, усиленная секреция и дистрофические изменения у части клеток респираторного эпителия: ИЦК достоверно уменьшился в 2 раза до 0,02 у.е.; ИДК снизился на 72 % (до 0,48 у.е.), а модуляция регенераторного потенциала эпителиоцитов слизистой повысилась в 2 раза (0,44 у.е.). Стоит отметить, что при визуализации мазков-перепечатков у 90 % пациентов группы ОГ на 20-е сут лечения выявлялись признаки регенерации респираторного эпителия; помимо элементов плоскоклеточной метаплазии, отмечались группы клеток цилиндрической формы, единичные реснитчатые клетки респираторного эпителия. У пациентов группы РГ выявлялись единичные признаки лечебного патоморфоза (ИМК повысился всего на 19 % до 0,31 у.е.; ИДК снизился на 9 %, а ИЦК вообще не изменился). В более чем 2/3 случаев после лечения у пациентов группы РГ присутствовало в мазках-перепечатках большое количество элементов воспаления, среди которых преобладали сегментоядерные нейтрофилы, часть из них с признаками незавершенного фагоцитоза.

Таким образом, у пациентов, получавших лечение с применением дезоксирибонуклеата натрия, в цитограммах мазков-перепечатков со слизистых оболочек носа были выявлены морфологические особенности, которые заключались в разрыхлении структур клеток, увеличении межклеточных промежутков и усилении секреции. Такая картина свидетельствовала о том, что дезоксирибонуклеат натрия блокировал образование папиллярных структур предшественников полипозной ткани в строме слизистой полипозной ткани.

Среднее количество TOLL+ клеток (экспрессия TLR9) в группе РГ пациентов составляла 3,2 у.е. с объемной плотностью 2,4 % (табл. 2). После проведенного стандартного лечения полинозного риносинусита в биопсийном материале этих же пациентов экспрессия TLR9 возросла на 15 %, но эти изменения носили недостоверный характер.

Таблица 2

Сравнительные показатели экспрессии TLR9 у пациентов в исследовании (у.е.)

Примечание. * р < 0,05 по сравнению с данными группы РГ; n количество пациентов, у.е. условные единицы экспрессии TLR9.

Объемная плотность клеток достоверно (р < 0,001) возрастала на 14 % (от 2,4 до 2,9 %). В группе ОГ отмечались следующие изменения: достоверно (р < 0,001) возрастало среднее количество TOLL+ клеток (экспрессия TLR9) после лечения на 36,3 % (с 3,4 до 4,3), а объемная плотность этих структур с 2,4 до 3,6 %. Таким образом, повышение экспрессии TLR9 во множестве иммунокомпетентных клеток биопсийного материала на фоне включения вещества дезоксирибонуклеата натрия в схемы лечения полипозного риносинусита в послеоперационном периоде опосредованно подтверждают роль врожденного иммунного ответа в эффективности терапии.

Заключение

В результате исследования степени влияния агонистов TLR9 на стимуляцию пролиферации клеточного пула слизистой полости носа после хирургического лечения у больных полипозным риносинуситом можно сделать следующие выводы:

1) включение агониста TLR9 в схемы лечения пациентов с полипозным риносинуситом приводит к нарушению межклеточных связей в структурах полипозной ткани и усилению регенераторных процессов слизистой оболочки носа в 89,7 % случаев.

2) экспрессии TLR9 у пациентов из группы ОГ были в среднем на 39,6 % выше по сравнению с показателями пациентов группы РГ;

3) стимуляция регенерации клеточного пула слизистой полости носа сопровождается снижением деструктивных процессов эпителиоцитов на 34,6 % по сравнению с показателями пациентов группы РГ.

Список литературы

2. Павлуш Д.Г., Павлуш Е. Н., Матвеева Н. Ю. [и др.]. Хронический полипозный риносинусит: этиопатогенетические механизмы его возникновения // Медицина. 2018. Т. 6, № 2 (22). С. 69-78. doi:10.29234/2308-9113-2018-6-2-69-78

3. Зурхаева Р.З., Саидов М. З. Корреляционные взаимосвязи между CDпозитивными клетками и экспрессией TLR-рецепторов при полипозном риносинусите // Вестник Дагестанской государственной медицинской академии. 2014. № 4 (13). С. 29-32.

4. Машкова Т. А., Мальцев А. Б., Неровный А. И. [и др.]. Роль блокатора лейкотриеновых рецепторов в восстановлении носового дыхания у больных полипозным риносинуситом // Вестник оториноларингологии. 2017. Т. 82, № 5. С. 32-35. doi:10.17116/otorino201782532-35

5. Филатов О. Ю., Назаров В. А. Образраспознающие рецепторы врожденного иммунитета и их роль в иммунотерапии: обзор // Патогенез. 2020. № 18 (4). С. 4-15. doi:10.25557/2310-0435.2020.04.4-15

6. Филатов О. Ю., Кашаева О. В., Бугримов Д. Ю. [и др.]. Морфофизиологические принципы иммунологического действия ДНК эукариот // Российский Иммунологический журнал. 2013. Т. 7 (16), № 4. С. 47-52.

7. Матвеева Л. А. Местная защита респираторного тракта у детей. Томск : Изд-во Том. ун-та, 1993. 276 с.

Размещено на Allbest.ru