Новый тест на альфа2-макроглобулин в диагностике туберкулеза легких

Размещено на http://www.allbest.ru/

НОВЫЙ ТЕСТ НА АЛЬФА2-МАКРОГЛОБУЛИН В ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ

Кривенцев Ю.А., Даутов И.Б.

Аннотация

альфа макроглобулин туберкулез легкие

В ходе исследования разработан оригинальный способ выделения и очистки альфа2-макроглобулина, состоящий в последовательном фракционировании глобулинов плазмы крови беременных женщин добавлением сернокислого аммония до 40%, анионообменной хроматографии на сефадексе типа DEAE и гель-хроматографии на Toyopearl-65. Моновалентные антисыворотки к изучаемому белку, полученные иммунизацией кроликов, легли в основу смоделированного иммунохимического теста на альфа2макроглобулин с порогом чувствительности 1,63±0,08 мг/л и воспроизводимостью, равной 97,2%. Оценка диагностической значимости теста на альфа2-макроглобулин показала его абсолютную специфичность и высокую диагностическую эффективность (97,9%), что доказывает его ценность как дополнительного параметра в диагностике, прогнозе и оценке качества терапии туберкулеза легких. Проведена широкая клиническая апробация предлагаемого теста на альфа2-макроглобулин на 390 пробах от 180 больных туберкулезом легких и здоровых доноров. Анализ показал значительное достоверное повышение средней концентрации альфа2-макроглобулина при различных формах туберкулеза легких в его активном течении, высокую прямую корреляцию уровня этого белка с объемом поражения паренхимы легких и высокую обратную корреляцию динамики его концентрации с течением туберкулезного процесса при успешном лечении.

Ключевые слова: альфа-2-макроглобулин, туберкулез легких, диагностика, иммунохимия, очистка.

Annotation

NEW TEST FOR ALPHA2-MACROGLOBULIN IN THE DIAGNOSIS OF PULMONARY TUBERCULOSIS

Kriventsev Y.A., Dautov I.B.

In the course of the study, an original method for isolating and purifying alpha2-macroglobulin was developed, consisting in the sequential fractionation of blood plasma globulins of pregnant women by adding ammonium sulfate up to 40%, ion-exchange chromatography on Sephadex DEAE type and gel chromatography on Toyopearl65. Monovalent antisera to the studied protein, obtained by immunization of rabbits, formed the basis of a simulated immunochemical test for alpha2-macroglobulin with a sensitivity threshold of 1.63±0.08 mg/l and a reproducibility of 97.2%. The assessment of the diagnostic significance of the test for alpha2-macroglobulin showed its absolute specificity and high diagnostic efficiency (97.9%), which proves its value as an additional parameter in the diagnosis, prognosis and evaluation of the quality of pulmonary tuberculosis therapy. A wide clinical approbation of the proposed test for alpha2-macroglobulin was carried out on 390 samples from 180 patients with pulmonary tuberculosis and healthy donors. The analysis showed a significant significant increase in the average concentration of alpha2-macroglobulin in various forms of pulmonary tuberculosis in its active course, a high direct correlation of the level of this protein with the volume of damage to the lung parenchyma, and a high inverse correlation of the dynamics of its concentration with the course of the tuberculosis process with successful treatment.

Keywords: alpha-2-macroglobulin, pulmonary tuberculosis, diagnostics, immunochemistry, purification.

Основная часть

Начало XXI в. ознаменовано успехами по многим направлениям российской медицины, в том числе и фтизиатрии, что во многом обусловлено выполнением соответствующих государственных программ. Однако широкое распространение туберкулеза легких, ежегодно приводящее к длительной потере нетрудоспособности и даже инвалидизации десятков тысяч работоспособных граждан нашей страны, до сих пор остается злободневной проблемой как в медицинской, так и в общегосударственной сферах [1, 2, 3, 4].

В этом аспекте выявление новых неселективных маркеров туберкулезного процесса, а также разработка на их основе оригинальных и простых биохимических тестов, способных оптимизировать стандартные схемы диагностики, прогноза и адекватного анализа качества лечения туберкулеза легких, безусловно, являются насущными задачами современной фтизиатрии.

Наиболее привлекательным в этом плане, на наш взгляд, является альфа2макроглобулин (МГ) - тяжелый гликопротеид плазмы крови человека (молекулярная масса 820 кД), известный как острофазовый маркер. Кроме того, его уровень повышается у нефротических больных, у пациентов с псориазом, отторжением трансплантата, а снижение концентрации этого белка в сыворотке крови отмечается при панкреонекрозе, массивных ожогах, остеоартрозе ревматического генеза, вирусном гепатите [5, 6, 7].

По данным многих авторов, являясь активным ингибитором большинства известных протеолитических ферментов, МГ выполняет функцию выраженного иммуносупрессора, причем на уровне как клеточного, так и гуморального иммунитета [7, 8]. Основываясь на этих сведениях, мы выдвинули предположение, что такая патология, как туберкулез легких, довольно часто сопровождающаяся снижением иммунного статуса, может стимулировать индукцию гена МГ и, следовательно, приводить к достоверным изменениям уровня данного белка.

Цель исследования: создание, клиническая апробация и оценка диагностической значимости иммунохимического теста на альфа2-макроглобулин для диагностики туберкулеза легких.

Материалы и методы исследования

В качестве материала в данном исследовании использовали сыворотку крови больных различными формами туберкулеза легких, которую получали в ГБУЗ АО «Областной клинический противотуберкулёзный диспансер» (клинический материал), а также человеческую плазму (в контрольной группе), получаемую в Астраханской областной станции переливания крови. Следует отметить, что для исследования брали материал только от больных с активным туберкулезным процессом, т.е. от пациентов с выраженной клинической картиной, манифестными данными рентгенографии и компьютерной томографии (КТ) легких, положительной реакцией на «Диаскинтест» и уровням С-реактивного белка (СРБ) не ниже 50 мг/л.

Всего исследовано 390 проб, из них: 336 образцов крови от 126 пациентов с туберкулезом легких и 54 - от доноров (табл. 1).

Таблица 1

Перечень материала по группам

Проведено исследование 48 пациентов в динамике: на момент поступления в стационар, на 3-й месяц и по окончании интенсивного курса терапии (144 пробы) с позитивными результатами лечения, качество которого оценивали по нормализации клинических, рентгенологических и лабораторных данных.

Объем поражения легких, определяемый методом компьютерной томографии органов грудной клетки, вычислялся по авторской разработке как отношение количества пораженных сегментов к общему их числу - 19, которое затем переводили в проценты от общего объема легочной паренхимы. Пример: если у пациента обнаруживали патологические зоны активного туберкулеза, занимавшие в одном сегменте четверть объема, а в другом - половину, то общий объем поражения рассчитывался следующим образом: (1/4 - 1/2) / 19 х 100 = 3,95%.

Для очистки МГ применяли методы высаливания белков исходного материала (сыворотка крови беременных женщин (38-40 недель), доставляемая из ГБУЗ АО «Клинический родильный дом», Астрахань) сернокислым аммонием 40%-ного насыщения, анионообменной хроматографии на сефадексе типа DEAE А-50 в 0,01 М трис-HCl, рН 7,1 буфере а гель-проникающую хроматографию проводили на Toyopearl-65 с использованием 0,14 М фосфатного буфера, рН 7,3.

Моноспецифические поликлональные антисыворотки на МГ получали иммунизацией кроликов породы «шиншилл» дробными дозами очищенного препарата МГ подкожно, в 4-5 точек в районах лимфоузлов, по следующей схеме: 4 введения с 5-дневными интервалами смеси антигенного материала с 2,5 мл полного адьюванта Фрейнда, 3 мг убитых туберкулезных палочек и 0,5 мл физраствора. Антиген вводили в возрастающих дозах: 12 - 24 - 48 - 64 мг. Контроль качества полученных антисывороток к МГ проводили методами иммунопреципитации и иммуноэлектрофореза. Титры полученных гипериммунных моновалентных антисывороток, определенные методом радиальной иммунодиффузии, составили 1/128.

Определение концентраций МГ как в очищенных препаратах, так и в клиническом материале проводили методом ракетного электрофореза на 1% на 0,05 М вероналмединаловом буфере рН-8,6 с додецилсульфатом натрия (ДСН) в авторской модификации [9, 10]. Порог чувствительности метода устанавливали по минимальной концентрации МГ в стандартной пробе, при которой еще визуально определялись электрофоретические пики. Уровень искомого протеина определяли с помощью калибровочной кривой, построенной на основании усредненных значений высоты пиков разгона проб с известной концентрацией МГ (от 0,5 до 1500 мг/).

Для оценки диагностической значимости разработанного теста на МГ использовали альтернативный тип референтной оценки с применением количественного результата трактовки. Дискриминантная концентрация (точка разделения) определялась как сумма средних числовых значений уровня МГ в контрольной группе и трехкратного среднеквадратического отклонения (М±3о) по каждой из референтных групп. Чувствительность теста определялась как процент числа истинно положительных от суммы истинно положительных и ложноотрицательных результатов; специфичность - как процент числа истинно отрицательных от суммы ложноположительных и истинно отрицательных выявлений; воспроизводимость - как процент сходных значений (не выше ±о) при повторных определениях идентичных проб; диагностическая эффективность - как половина суммы значений чувствительности и специфичности теста.

Статистический анализ полученных данных проводили при помощи лицензионного пакета Excel-2019 (Microsoft) с использованием общепринятых показателей: М (средняя величина), m (среднее отклонение), р (значимость различий), t (критерий Стьюдента), r (корреляционный коэффициент Пирсона), а также F (критерий Фишера) для дисперсионного анализа по клиническим выборкам.

Результаты исследования и их обсуждение

Настоящее исследование проводилось с 2017 по 2020 гг.

В ходе работы смоделирован новый алгоритм получения очищенного препарата МГ, включающий три простых и эффективных этапа: высаливание белковых компонентов исходного биоматериала добавлением (NH4)2SO4 до 40%, анионообменное хроматографическое выделение на сефадексе типа DEAE А-50 с 0,01 М трис-HCl в качестве элюэнта при рН 7,1 с элюцией в нисходящем ступенчатом градиенте рН, а также гельфильтрация на Toyopearl-65 с элюцией в 0,14 М фосфатном буфере при рН 7,3.

Степень чистоты препарата МГ, определяемая как процент его абсолютных средних величин (мг/л) к таковым по общему белку в очищенных препаратах, составила 84,31±2,8%, что соответствовало степени очистки в 73,4±2,4 раза.

На основе полученных самостоятельно специфических антисывороток к МГ и очищенного препарата этого белка разработан оригинальный иммунохимический тест на МГ с порогом чувствительности 1,63±0,08 мг/л (р<0,005). Анализ многократных повторных определений уровня МГ в стандартных пробах очищенного препарата показал его высокую воспроизводимость - 97,2%.

Предлагаемый способ количественного определения МГ в сыворотке крови основывается на методе ракетного электрофореза в авторской модификации, заключающейся в добавлении ДСН в исследуемые пробы (до 2% концентрации). Как показал эксперимент, будучи активным анионным детергентом, ДСН увеличивает заряд белковых молекул, в том числе и МГ, и тем самым значительно повышает электрофоретическую подвижность этого «тяжелого» белка. Данной манипуляцией достигаются два позитивных эффекта, являющихся безусловным преимуществом теста: во-первых, существенно сокращается время проведения электрофоретического анализа (с 1,5 ч до 45-50 мин), во-вторых, увеличивается длина пиков преципитации, что повышает точность определения концентрации МГ.

Проведена широкая клиническая апробация иммунохимического теста на МГ в представленных выборках клинического материала (табл. 2).

Таблица 2

Результаты количественного определения МГ в выборках

Математический сравнительный анализ сопоставляемых парных средних по клиническим выборкам по отношению к результатам в группе сравнения, а также уровней дисперсии показал высокую статистическую значимость в исследуемых выборках. Различия средних концентраций МГ между всеми клиническими группами и контрольной группой оказались достоверными (р<0,05).

Выявлена высокая прямая корреляция между средними значениями МГ в каждой выборке и соответствующими средними объемами поражения паренхимы легких активным туберкулезным процессом (без учета фиброзных изменений), что свидетельствует о значимости МГ как маркера активного туберкулеза легких (табл. 3).

Было также проведено количественное определение уровня МГ в динамике у пациентов с позитивным течением патологического процесса, свидетельствующим об успешности проводимого лечения. В представленных клинических группах исследование показало удовлетворительные значения обратной корреляции между концентрацией МГ и сроками терапии (за исключением больных с фиброзно-кавернозной формой, где величина r оказалась на грани достоверности) (табл. 3).

Таблица 3

Анализ корреляционных отношений по группам

Данный факт свидетельствует о безусловной ценности МГ как маркера качества лечения.

На наш взгляд, выраженное повышение среднего уровня МГ у больных туберкулезом легких объясняется ключевой ролью этого белка в формировании иммунного статуса человека, что было показано нами ранее [8]. Неудивительно, что, будучи выраженным иммуносупрессором, этот протеин чутко реагирует на активный туберкулезный процесс, который, как правило, развивается на фоне подавленного иммунитета. Если учесть активную роль МГ в формировании иммунологической толерантности беременных женщин [8], не исключено, что этот белок также участвует в процессах иммунологической супрессии при туберкулезе легких. Снижение средних значений МГ в сыворотке крови пациентов в процессе успешного лечения тоже укладывается в данную гипотезу.

На заключительном этапе исследования проведена оценка качества теста на МГ как нового диагностическо-прогностического инструмента для фтизиатрии с учетом альтернативной количественной характеристики результатов. Расчет дискриминантной концентрации дал значение 371±34,6 мг/л. Анализ диагностической значимости предлагаемого теста на МГ по основным показателям дал следующие результаты: чувствительность - 95,8%; прогностичность отрицательного результата - 79,4%; диагностическая эффективность - 97,9%; специфичность - 100%; прогностичность положительного результата - 100%.

Данные результаты объясняются полным отсутствием ложноположительных срабатываний и доказывают клинико-лабораторную ценность нового теста на МГ.

Заключение

Включение нового селективного, чувствительного, воспроизводимого и эффективного иммунохимического теста на альфа2-макроглобулин в стандартную панель диагностики и оценки течения туберкулеза легких в качестве дополнительного параметра, несомненно, облегчит клинико-диагностический мониторинг данной патологии.

Список литературы

1. Тюлькина Е.А. Фактическая функция врачебной должности врача-фтизиатра в удмуртской республике // Современные проблемы науки и образования. 2017. № 6. [Электронный ресурс]. URL: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=27156 (дата обращения: 10.03.2022).

2. Тевосян С.Т., Борисов Н.В., Груздева Е.С. Туберкулез как актуальная медикосоциальная проблема // Молодой ученый. 2019. № 7 (245). С. 143-145.

3. Веневцева Н.В., Кондусова Ю.В., Князева А.М., Пятницина С.И. Туберкулез как общественное опасное заболевание. Вопросы профилактики // Приднепровский научный вестник. 2018. Т. 10. № 3. С. 024-026.

4. Барканова О.Н., Гагарина С.Г., Калуженина А.А. Туберкулез в сочетании с covid-19 // Лекарственный вестник. 2021. Т. 15. № 2 (82). С. 33-37.

5. Kumar N.P., Thiruvengadam K., Sivakumar S., Hissar S., Babu S., Moideen K., Nancy A., Viswanathan V., Kornfeld H. Acute Phase Proteins Are Baseline Predictors of Tuberculosis Treatment Failure. Frontiers in Immunology. 2021. vol. 12. no. MAR. P. 731878.

6. Зорина В.Н., Школьникова Т.В., Короткий Н.Г., Зорина Р.М., Бурдина А.В., Коняхина И.Г., Зорин Н.А. Альфа-2-макроглобулин, лактоферрин и некоторые цитокины при псориазе // Иммунология. 2014. Т. 35. № 1. С. 21-23.

7. Зурнаджьянц В.А., Кчибеков Э.А., Коханов А.В., Сердюков М.А., Алексашина Д.С., Луцева О.А. К вопросу о значении теста на а2-макроглобулин для своевременной диагностики тяжести воспалительного процесса в поджелудочной железе // Медицинский вестник Северного Кавказа. 2016. Т. 11. № 3. С. 405-408.

8. Кривенцев Ю.А., Носков А.И., Осыко С.В. и др. Иммунохимический тест на альфа2-макроглобулин в оценке иммунного статуса человека // Современные проблемы науки и образования. 2016. № 3. [Электронный ресурс]. URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=24622 (дата обращения: 10.03.2022).

9. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Иммунохимический анализ концентрации фетального гемоглобина в крови новорожденных мальчиков и девочек с внутриутробной гипоксией // Омский научный вестник. 2006. Т. 46. № 9. С. 272-274.

10. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Лапеко С.В. Новый иммунохимический тест для лабораторной оценки состояния эритрона // Клиническая лабораторная диагностика. 2009. № 12. С. 27-30.

Размещено на Allbest.ru