Сублімаційне сушіння бактеріальних препаратів на основі Lactobacillus casei

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Шугай М.О.1, к.б.н, с.н.с.

Чорна Н.А.1, н.с,

Институт продовольчих ресурсів НААН, м. Київ, Україна

У виробництві ферментованих харчових продуктів важливо забезпечити ефективне і довготривале зберігання клітин мікроорганізмів заквашувальних препаратів. Проблема тривалого зберігання мікроорганізмів зводиться до створення умов анабіозу, тобто гальмування процесів обміну речовин. З відомих способів зберігання біоматеріалів сублімаційне сушіння чи ліофілізація (осушування матеріалу в умовах низького тиску і за низьких температур) вважається одним з найефективніших і найекономічніших методів тривалого зберігання мікроорганізмів. При висушуванні виживання клітин залежить від багатьох факторів, серед яких важливе місце займають їх біологічні особливості пов'язані з видовою і штамовою специфічністю, умови культивування, вік культури, склад середовища сублімаційного сушіння, технологічні параметри цього процесу. Для захисту мікроорганізмів використовують захисні середовища (ЗС), до яких уводять речовини, що зменшують відмирання клітин під час заморожування, сушіння та зберігання.

Мета роботи: провести підбір компонентів ЗС для стабілізації біомаси Lаctobacillus casei (L. casei) з високим рівнем антагоністичної дії щодо технічно шкідливої мікрофлори та встановити режими зберігання бакпрепаратів. Предмет дослідження: здатність лактобактерій L. сasei зберігати життєздатність і властивості під час сублімаційного сушіння та упродовж зберігання. У роботі використані загальновживані мікробіологічні та технологічні методи досліджень. Результати дослідження. Досліджено протекторну дію захисних середовищ на збереження життєздатності клітин L. casei та розчинність бактеріальних препаратів. Найкращих показників досягнуто при використанні сахарозо-цитратного і сахарозо-желатозного середовищ у співвідношенні до біомаси клітин як 2:1. Вироблено ліофілізовані бактеріальні препарати, показники якості яких відповідають сучасним вимогам: чисельність клітин на рівні (4,5-4,8)*10п КУО/см3, розчинність - (0,4-0,5) см3 сирого осаду та достатній рівень активності в молоці зі збереженням високої антагоністичної активності до Escherichia соїі, Staphylococcus aureus і Bacillus cereus. При зберіганні упродовж шести місяців за температури (4±2) °С і 9 місяців за температури мінус (18±2) С° бактеріальні препарати зберігали високу чисельність живих клітин та здатність до реактивації. Сфера застосування результатів дослідження. Використання бактеріальних препаратів захисної дії від технічно шкідливої мікрофлори дозволить поліпшити показники безпечності та якості отримуваного сиру.

Ключові слова: бактеріальний препарат, захисне середовище, сублімаційне сушіння

FREEZE DRYING OF BACTERIAL PREPARATIONS BASED ON LACTOBACILLUS CASEI

Myroslava Shugai1, PhD, Biologocal, Senior Researcher Natalia Tshorna1, Researcher institute of Food Resources of NAAS, Kyiv, Ukraine

For the production offermentedfood products, it is important to ensure efficient and longterm storage of microorganism cells of starter preparations. The problem of long-term storage of microorganisms is reduced to the creation of conditions for suspended animation, that is, inhibition of metabolic processes. Of the known methods for storing biomaterials, freeze drying or lyophilization (drying of the material under low pressure and at low temperatures) is considered one of the most effective and economical methods of long-term storage of microorganisms. During drying, cell survival depends on many factors, among which their biological characteristics associated with species and strain specificity, cultivation conditions, culture age, composition of the freeze drying medium, and technological parameters of this process occupy an important place. To protect microorganisms, protective media are used, into which substances are introduced that promote cell survival during freezing, drying and storage. The aim of this work: to select the components of a protective environment to stabilize the biomass of Lactobacillus casei (L. casei) with a high level of antagonistic action to technically harmful microflora and to establish storage regimes for the bacterial preparation. Subject of research: the ability of L. casei lactobacilli to maintain viability and properties during freeze drying and storage. The work used commonly used microbiological and technological research methods. Research results. The protective effect of protective media on maintaining the viability of L. casei cells and the solubility of bacterial preparations was studied. The best performance was achieved when using sucrose-citrate and sucrose-gelatinous media in a ratio to cell biomass of 2: 1. Lyophilized bacterial preparations were produced, the quality indicators of which meet modern requirements: the number of cells at the level of (4.5-4.8) x 10 11 CFU / cm3, solubility - (0.4-0.5) cm3 of raw sediment and a sufficient level of activity in milk while maintaining a high antagonistic activity to E. coli, S. aureus and Bacillus cereus. When stored for six months at a temperature of (4 ± 2) C and 9 months at a temperature of minus (18 ± 2) C, bacterial preparations retained a high number of living cells and the ability to reactivate. Scope of research results application. The use of bacterial preparations with a protective effect against technically harmful microflora will improve the safety and quality of cheese.

Key words: bacterial preparation, protective environment, freeze drying

Постановка проблеми

lаctobacillus casei бакпрепарат сушіння

У виробництві ферментованих харчових продуктів важливо забезпечити ефективне і довготривале зберігання клітин мікроорганізмів заквашувальних препаратів. З відомих способів зберігання біоматеріалів найбільш придатним для промислового виробництва вважається сублімаційне чи ліофільне сушіння - осушування матеріалу в умовах низького тиску і за низьких температур. В основі методу лежить явище сублімації - випаровування вологи з оминанням рідкої фази. Низька температура, за якої тривалий час знаходиться висушуваний матеріал, оберігає білки від денатуруючої дії підвищених концентрацій електролітів, що виникають внаслідок видалення води. Виживання клітин під час ліофілізації забезпечується природною здатністю мікроорганізмів впадати в анабіоз за несприятливих для життєдіяльності умов [1].

Сушіння виморожуванням - давній спосіб сушіння. Його використовували ще в 16му столітті південно-американські індіанці, які жили на великих висотах в Андах. Вони отримували ліофілізований картопляний продукт з довгим терміном придатності шляхом заморожування картоплі протягом ночі і сушіння її на схилах.

Використання ліофілізації як експериментального методу збереження мікробних культур розпочалось з кінця минулого - початку нинішнього століття. Зокрема, 1909-го року американський дослідник Л. Шеккель вперше застосував метод заморожування в суміші льоду й солі з подальшим поглинанням вологи сірчаною кислотою під вакуумом для висушування комплементу сироватки крові морської свинки та вірусу сказу [2]. У 1914-му році Роджерс [3] ліофілізував молочнокислі бактерії. Хоча більшість клітин швидко втратили життєздатність, на підставі чого дослідник висловив сумнів у можливості тривалого збереження бактерій за допомогою ліофілізації, однак він перший відзначив дуже важливий вплив на виживання клітин залишкової вологи.

Виживання мікроорганізмів при висушуванні залежить від багатьох факторів, серед яких важливе місце займають біологічні особливості мікроорганізмів, пов'язані з їх видовою і штамовою специфічністю, умови культивування та вік культури, склад середовища, в якому вони перебувають під час сублімаційного сушіння, та технологічні параметри цього процесу [4, 5].

Донедавна вважалося, що ростові середовища не впливають на виживання мікроорганізмів під час сушіння. Тому дослідження насамперед були зосереджені на впливі захисних речовин і фаз росту, а не рецептурі ростового середовища. Однак було виявлено, що середовище росту може суттєво вплинути на виживання ліофілізованих клітин Enterococcus faecalis, Enterococcus durans та Lactobacillus bulgaricus [6, 7]. Також показано, що результат зележить від штаму і використаних вуглеводів: клітини Lactobacillus bulgaricus менше втрачали життєздатність після ліофілізації за умов, коли їх вирощували в присутності маннози, порівняно з фруктозою, лактозою або глюкозою. Водночас додавання до захисного середовища будь-якого з цих вуглеводів підвищувало захист клітин від висихання під час зберігання [7].

До захисних середовищ зазвичай уводять речовини, що зменшують відмирання мікроорганізмів під час заморожування, сушіння та зберігання у сухому вигляді. Речовини, що використовується з цією метою, можуть відрізнятися захисною дією щодо окремих несприятливих факторів. З огляду на це варто використовувати комплексні захисні середовища з двох чи кількох компонентів. Мета роботи полягала у підборі компонентів захисного середовища для стабілізації біомаси L. casei, що входять до препартів для виробництва сиру та встановленні режимів зберігання бакпрепаратів.

Матеріали та методи. Етап сублімаційного сушіння біомаси потребує вирішення ряду питань, пов'язаних із визначенням впливу кріозахисних компонентів на виживання мікроорганізмів, їх активність та якість отриманих бакпрепаратів. Під час патентного пошуку було визначено, що ефективними ліопротекторами можуть бути:

- вуглеводневі сполуки - цукроза, лактоза, тригалоза, мальтоза, манноза, сорбіт, агар-агар;

- білкові компоненти - желатин, сухе знежирене молоко, пептон;

- солі - цитрат натрію, глутамат натрію, фосфатний буфер.

Також було відзначено, що найвищим рівнем захисту відзначаються комплексні ЗС, які містять компоненти, представлені речовинами різної хімічної будови - вуглеводи, білки та солі. Виходячи з цього було скомбіновано п'ять комплексних ЗС, до складу яких входили у різних співвідношеннях сахароза, цитрат натрію, сухе знежирене молоко, желатин (табл. 1).

Нарощені в ростовому середовищі мікроорганізми осаджували за допомогою ценрифугування та змішували з ЗС. Суспензії бактеріальних клітин заморожували при температурі мінус (40±1) °С упродовж (16±2) год, після чого висушували в сублімаційній сушарці ТГ-15 протягом (18±2) годин за таких режимів: початок сушіння - за температури мінус (25±2) °С, закінчення - за температури (30±2) °С.

Якість отриманих бактеріальних концентратів оцінювали за показниками виживання лактобактерій після ліофілізації та за індексом розчинності, який визначали відповідно до ГОСТ 30305.4-95.

Чисті культури лактобактерій підтримували методом субкультивування, між пересівами зберігали за температури холодильника. Визначення титру життєздатних клітин визначали чашковим методом в агаризованому середовищі МРС; активну кислотність середовища культивування лактобактерій - потенціометрично; титровану кислотність - згідно з ГОСТ 3624-92; наявність БГКП - у середовищі Кесслер; наявність дріжджів та плісені - на середовищі Сабуро. Розчинність сухих бакпрепаратів - згідно з ГОСТ 30305.4-95 і виражали в см³ сирого осаду; вміст вологи - згідно з ГОСТ 24061-88. Антагоністичну активність відновлених після висушування культур лактобактерій визначали методом «дифузії в агар» [8]. Активність відновлених препаратів оцінювали за приростом титрованої кислотності через 3 години культивування та за часом сквашування 1 дм³ стерильного молока за оптимальної температури росту культур (37±1) °С.

Контроль чистоти культур проводили методом світлової мікроскопії фарбованих метиленовою синькою мікропрепаратів, обчислення ступеня виживання клітин після сублімаційного сушіння (N) - згідно з [9] за формулою:

(1),

де

Ni - чисельність клітин до висушування біомаси з захисним середовищем, КУО/см³;

N2 - чисельність клітин після висушування біомаси з захисним середовищем, КУО/см³. (До початкового об'єму суху біомасу доводили фізіологічним розчином).

Оцінку результатів досліджень проводили за рівнем значимості Р. Результати вважали достовірними при Р < 0,05.

ЗС для сублімаційного сушіння №1, №2, №3, №5 готували відповідно до таблиці 1.

Таблиця 1. Склад захисних середовищ для сублімаційного сушіння біомаси L. Casei

Результати та обговорення

Аналіз отриманих даних (табл. 2) показав, що залучення до складу ЗС сухого знежиреного молока хоча й забезпечувало порівняно високі показники виживання молочнокислих бактерій (до 91% - 95 % КУО/см³ після ліофілізації), однак значно погіршувало розчинність бакпрепаратів (індекс розчинності з використанням середовищ №2 та №5 перевищував 0,5 см³ сирого осаду). Використання ЗС № 3 і № 4 дозволило отримати бактеріальні препарати з низькими індексами розчинності - 0,5 см³ і 0,4 см³ сирого осаду, відповідно) та обумовлювало ступінь виживання бактерій на рівні 96 % - 97 %. Вихід сухих бакконцентратів із застосуванням ЗС № 3 і № 4 становив 4,3 - 4,6 г з 1 дм³ ростового середовища.

Таблиця 2 Вплив захисних середовищ на якість бактеріального препарату

Досліджено вплив режимів зберігання і об'єму захисного середовища на збереження життєздатності лактобактерій. З цією метою бакконцентрати закладали на зберігання за температурних режимів: мінус 18±2 °С (температура морозильної камери) і (4±2) °С (камера побутового холодильника) при відносній вологості повітря 80 %. Стабільність препаратів оцінювали за чисельністю життєздатних клітин та їх біохімічною активністю - часом, необхідним для утворення молочного згустку.

Отримані дані (табл. 4) свідчать, що ефективнішим було зберігання бакпрепаратів за від'ємних температур, забезпечуючи загальну чисельність лактобактерій через 9 місяців зберігання на рівні 1,1 х 10¹¹ КУО/г, тоді як при зберіганні за температур від 2 до 6 °С аналогічні показники бакпрепарати мали вже через 6 місяців.

Таблиця 4Здатність до зберігання бакпрепаратів № 1 та № 2т(за співвідношення біомаси до захисного середовища як 1:2)